包含囊泡的藥物組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 該申請要求享有歐洲申請EP13154463. 7 (于2013年2月7日提交）的權益，其兩 者的完整內容在此為全部目的通過引用并入本文。
技術領域
[0002] 本發明設及藥物組合物，其包含動物囊泡（vesicle)和細菌囊泡，用于制備所述組 合物的方法，和其用途。
【背景技術】
[0003] 癌癥是發病率和死亡率的主要全球原因，其被預期在接下來的數十年變得越來 越普遍。對癌癥的常規治療包括化學治療藥物、放射治療和介入性手術。基于癌癥細胞 的分子表達概況，也已經對不同的癌癥類型開發了特異的激素和抗體治療(例如，赫賽汀 (Herceptin)，用于Her2陽性乳腺癌的抗-Her2抗體)。
[0004] 因為它們的特異性、安全性和對控制復發關鍵的長期免疫記憶，癌癥疫苗已經 作為對用于癌癥的常規治療的有吸引力的替代物在近期出現（Dougan等人，AnnuRev Immunol. 2009; 27:83-117，PMID: 19007331)。弁妍康（Cervarix)和加德西（Gardasil) 是預防性疫苗的成功實例，其顯示了對宮頸癌預防的功效。運些疫苗，基于來自致癌的人乳 頭瘤病毒（HPV)變體的抗原的遞送，激活了強大的抗病毒免疫應答，其因此防止了HPV-誘 導的宮頸腫瘤的新生成。
[000引 2010年，食品與藥品管理局（FoodandDrugA血inistration)批準了用于晚期前 列腺癌治療的疫苗(普羅文奇（Provenge))的使用。運是刺激免疫系統對抗自體抗原W促 進癌細胞殺傷的治療疫苗的第一個實例。該疫苗是基于使用前列腺特異蛋白質（前列腺酸 性憐酸酶-融合蛋白）（其引發免疫系統W識別并殺死前列腺癌細胞）致敏（pulsed)的激 活的樹突狀細胞的使用。然而，對該疫苗最初的熱情由于其中等的功效(存活期增加4. 1個 月)和過高的成本(~$93, 000/劑量/患者)而迅速減少。然而，普羅文奇代表了癌癥疫苗發 展的里程碑并且已經開啟了個人化癌癥疫苗治療領域的新途徑。
[0006] 然而，使用不同遞送載體和/或與多種佐劑配制的基于腫瘤相關抗原（TAA)的遞 送的大多數疫苗由于四個主要原因已經導致了令人失望的結果：（〇很多TAA是低免疫原 性的，因為它們是過表達的(例如Her2)或攜帶體細胞突變的(例如RAS，p53)或翻譯修飾 (例如MUC1)的蛋白質；（ii) 一些TAA在胎兒發育期間頻繁地高表達(例如CEA)但是不在 成人中高表達；（iii)TAA，特別是胞內的那些，具有低抗原性，因為它們是低效率地遞送至 抗原遞呈細胞(APC)的；（iv)TAA通常在免疫抑制環境中或在由有缺陷的抗原呈遞過程(例 如缺少MHCI)、不存在共刺激分子(例如缺少B7分子)和免疫抑制因子(例如比-10和TFG) 的釋放導致的TAA建立的免疫耐受情況下表達。
[0007] 對新的免疫調節試劑逆轉晚期癌癥狀態通常的免疫耐受性的能力和增加對癌癥 細胞免疫監督的能力進行評估。新型抗原遞送系統和佐劑還W增加癌癥疫苗的效能為目標 進行發展。運些包括樹突狀細胞活化劑和生長因子、疫苗佐劑、T-細胞刺激物和生長因子、 經遺傳修飾的T細胞、細胞因子、中和或抑制抑制性細胞的試劑。佐劑，包括那些在臨床中 使用的，諸如明抓和MPL(Romanowski等人，Lancet2009Dec12;374(9706):1975-85， PMID: 19962185)，和那些在臨床發展的后期使用的，意在通過模式識別受體（PRR)諸如化R 祀向先天免疫系統用于激活。
[0008] 盡管在運些領域近期有所進步，但是來自癌癥疫苗(例如，用于非霍奇金淋己瘤 (non-Hodgkin'Slymphoma)治療的MyVax和化vid)的臨床研究結果還沒有令人滿意的， 并且在此仍對能夠克服在癌癥患者中建立的耐受性并且在體內有效提升T細胞和B細胞水 平并且使T-細胞數目維持延長的時期的有效的免疫刺激分子/疫苗遞送平臺有需求。還 可期望增加的免疫應答用于治療不同于癌癥的疾病，特別地，其中的患者可W是免疫受損 (immune-compromised)的，例如由于感染、退行性疾病或老齡。
[0009] 大多數抗原使用激活的T輔助（Th)細胞主要是Thl和Th2細胞激活B細胞。 Thl細胞分泌IFN-丫，其激活巨隧細胞并且誘導通過B細胞的調理的抗體（opsonizing antibody)的生產。Thl應答主要導致細胞介導的免疫(細胞應答)，其針對胞內病原體(侵 襲性細菌、原生動物和病毒)進行保護。Thl應答激活細胞毒性T淋己細胞（CTL)，其是T細 胞的亞群，其誘導由病毒和其它胞內病原體感染的細胞的死亡。天然殺傷（NK)細胞也通過 Thl應答激活，運些細胞在腫瘤細胞、通過病毒或胞內細菌感染的細胞的細胞調亡/殺傷的 誘導中起到主要作用。在另一方面，化2細胞通常誘導在對抗胞外病原體(寄生蟲、胞外微 生物和毒素）的防御中至關重要的體液(抗體）應答。
[0010] 對疫苗的化應答的量級和類型可W極大地調節，取決于抗原制劑使用的佐劑。例 如，明抓是在人疫苗接種(包括對抗白喉-破傷風-百日咳、人乳頭瘤病毒的疫苗和肝炎疫 苗)中最通常使用的佐劑（MarrackP等人，（2009).化tRevImmunol.9(4):287-93)，其 主要引起強大的Th2應答，但是對于對抗需要的Thl-細胞介導的免疫的病原體是相當無效 的。化eund氏不完全佐劑（IFA)誘導主要偏向于化2的應答與一些Thl細胞應答。對于 MF59?，它是細胞（Thl)和體液（化2)兩者免疫應答的有效刺激物（OttG，（1995).化arm Biotechnol6: 277-96)。其它佐劑，基本上模式識別受體（PRR)的配體，通過誘導先天免 疫進行作用，主要祀向APC并且因此影響適應性免疫應答。PRR家族幾乎全部的成員是佐 劑潛在的目標。運些包括ToU-樣受體（TLR)、N0D-樣受體（化R)、RIG-I-樣受體（化R)和 C-型凝集素受體（CLR)。它們通過設及不同銜接分子的途徑信號傳遞，導致不同轉錄因子 的激活。運些轉錄因子（NF-kB、IRF3)誘導在免疫應答的引發、擴張和極化中起關鍵作用 的細胞因子和趨化因子的生產。
[0011] 由于經典的佐劑誘導強大的化2應答與較少或無Thl應答，因此目前的挑戰是 開發誘導對疫苗，諸如那些對抗癌癥、肝炎、流感、追疾和HIV的疫苗重要的強大Thl偏向 化ias)的佐劑。正在被開發的新佐劑是PRR的天然配體或合成激動劑，其是單獨的或與多 種制劑一同。PRR活化作用刺激了促炎性細胞因子/趨化因子和I類IFN的生產，其增加了 宿主消滅病原體的能力。因此，在疫苗制劑中滲入病原體相關分子模式（PAMP)可W改善和 促進疫苗特異性應答的誘導。 陽〇1引發明公開 本發明已開發了動物囊泡-細菌囊泡復合體，其可W在藥物組合物，例如疫苗中使用。 特別地，本發明人已展示當外來體皮力物囊泡)和0MV(細菌囊泡）一同混合(見例如，實施例 1)時，外來體-OMV復合體自發形成，并且本發明人假設形成了穩定的融合復合體。因此本 發明提供了用于基于動物囊泡和細菌囊泡的共同遞送的高免疫原性疫苗的開發的新平臺。 動物囊泡與細菌囊泡的組合遞送代表了通過利用兩種組分的主要性能引起先天免疫應答 的治療性疫苗有前景的策略： 由細菌囊泡提供的強大佐劑性；和 針對由動物囊泡呈遞的和與祀向疾病相關的抗原的特異性的適應性免疫應答。
[001引此外，本發明提供了囊泡(特別是外來體-0MV復合體)，其誘導對疫苗諸如那些針 對癌癥、肝炎、流感、追疾和HIV的疫苗重要的強大Thl偏向。
[0014] 本發明可用于其中抗原組合至患者免疫系統的呈遞可W是有利的任何治療。例 如，動物囊泡可W呈遞任何疾病相關抗原，諸如用于癌癥治療的一種或多種TAA，用于感染 治療的一種或多種病原體抗原，或與其它疾病相關的任何其它抗原或抗原的組合，特別是 對于免疫受損的狀況和/或其中需要免疫的強力增強的(例如，在老年人中）。與細菌囊泡 的細菌抗原的強大佐劑特性組合，運些通過動物囊泡呈遞的疾病相關抗原可W對疫苗接種 提供有效的方法。
[0015] 因此，本發明提供藥物組合物，其包含：（a)動物囊泡和（b)細菌囊泡。在一些實 施方案中，動物囊泡和細菌囊泡是一同處于復合體中的，例如通過脂雙層的融合或通過表 面分子附著。在一些實施方案中，動物囊泡包含疾病相關抗原，諸如一種或多種TAA、一種或 多種病原體相關抗原或一種或多種退行性病癥相關抗原。在優選的實施方案中，動物囊泡 包含TAA。例如，在一些實施方案中，動物囊泡是腫瘤來源的。在一些實施方案中，動物囊泡 是腫瘤來源的外來體。在一些實施方案中，細菌囊泡是外膜囊泡（0MV)、微泡（MVs[1])或 "天然0MV" ("N0MV")。因此，在一個實施方案中，本發明提供了包含腫瘤來源的外來體和 0MV的藥物組合物。
[0016] 本發明還提供了用于制備一種或多種復合體的方法，其中方法包括混合（a)動物 囊泡和（b)細菌囊泡的步驟。
[0017] 本發明還提供了包含（a)動物囊泡和（b)細菌囊泡的復合體。在一些實施方案中， 復合體是可獲得的或通過本發明的方法獲得。在一些實施方案中復合體是融合復合體。
[0018] 本發明還提供了用于制備藥物組合物的方法，其中方法包括混合（a)動物囊泡和 (b)細菌囊泡的步驟。在優選的實施方案中，藥物組合物是免疫原性組合物。
[0019] 相似地，本發明提供了用于制備藥物組合物的方法，其中方法包括混合第一組合 物和第二組合物的步驟，其中第一組合物包含動物囊泡并且第二組合物包含細菌囊泡。混 合后，方法可W包括允許來自第一和第二組合物的囊泡彼此相互作用的步驟，從而產生本 發明的藥物組合物。
[0020] 本發明還提供了用于在藥物中使用的組合物，其中組合物包含（a)動物囊泡和 (b)細菌囊泡。該組合物可W在例如，治療或預防癌癥中使用，例如其中動物囊泡包括TAA。
[0021] 本發明還提供了在哺乳動物中提高免疫應答的方法，其包括對哺乳動物施用本發 明的藥物組合物。該免疫應答可W是抗腫瘤應答，例如其中動物囊泡包括TAA。
[0022] 本發明還提供了動物囊泡和細菌囊泡兩者在藥物生產中的用途，例如，用于在治 療或預防癌癥中使用。
[0023] 本發明還提供了用于制備藥物組合物的方法，其包括步驟：（a)從哺乳動物主體 提取腫瘤細胞；（b)從提取的腫瘤細胞獲得囊泡；和（c)將獲得的囊泡與細菌囊泡混合W提 供藥物組合物。可W隨后將該組合物施用至在步驟（a)中提取的腫瘤細胞所來自的哺乳動 物主體。
[0024] 本發明還提供了用于制備藥物組合物的方法，其包括步驟：（a)從自哺乳動物主 體獲得的腫瘤細胞獲得囊泡；和（b)將獲得的囊泡與細菌囊泡混合W提供藥物組合物。可 W隨后將該組合物施用至在步驟（a)之前已獲得的腫瘤細胞所來自的哺乳動物主體。 陽〇2引動物囊泡 可用于本發明的動物囊泡是從動物細胞釋放的胞外囊泡。動物囊泡由包含生物分子的 脂雙層限制，并且通常具有20至1000nm的直徑。在本領域中已知動物囊泡的多種類型， 其包括膜顆粒、膜囊泡、微泡、外來體樣囊泡、外來體、核外粒體樣囊泡、核外粒體或外囊泡 (exovesicle)。!!!紅y等人（F1000BiolRep.2011;3:巧）提供了外來體和其它相似分 泌囊泡的一般性綜述。動物囊泡的不同類型基于直徑、亞細胞來源、它們在薦糖中的密度、 形狀、沉降速率、脂質組合物、蛋白質標記物和分泌模式（即根據信號(可誘導的）或自發地 (組成型的)）進行區分。四種常