用于引發對免疫原的免疫響應的方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的奪叉參考
[0002] 本申請要求于2012年11月19日提交的新加坡專利申請第201208483-6號的優 先權的權益，出于所有目的其內容在此通過引用以其整體并入。
技術領域
[0003] 本發明涉及用于引發對免疫原的免疫響應的方法，特別是，涉及使用聚合物囊泡 (polymersome)作為免疫原的載體的這樣的方法。
【背景技術】
[0004] 雖然免疫是一個成熟的過程，然而在不同的免疫原或抗原（本文可互換使用）之 間引發的響應水平存在差異。有趣的是，膜蛋白形成一類產生低響應水平的抗原，這又意味 著需要大量的膜蛋白以便產生或誘發達到所要求的水平的免疫響應。膜蛋白是眾所周知地 難以合成并且在不存在洗滌劑的情況下不溶于水。這使得它昂貴且難以獲得足夠用于免疫 用途的量的膜蛋白。
[0005] 此外，膜蛋白質需要適當的折疊以便正常地發揮功能。正確折疊的膜蛋白的免疫 原性比未以生理相關的方式折疊的溶解的膜蛋白更好。因此，即使佐劑可用于增強這種溶 解的膜蛋白的免疫原性，它仍是一種不提供過多的優點的低效的方法。
[0006] 此外，產生針對膜蛋白的抗體的普通程序通常需要它們在膜內的天然結構的先驗 知識以便設計可用于免疫的合適的表位。這種免疫通常利用分離的肽獨立地實施，該分離 的肽可以采用與在其天然的膜產地中的完整的蛋白質中出現的構象非常不同的構象。因 此，存在很高的風險，即由分離的肽產生的抗體可能終宄無法識別體內的靶蛋白。
[0007] 雖然轉染的細胞和基于脂質的系統已被用于呈遞膜蛋白抗原以增加分離可能在 體內有效的抗體的機會，然而這些系統經常不穩定，冗長和昂貴。再者，這種膜蛋白抗原的 本領域當前狀態是使用無活性的病毒樣顆粒來免疫。
[0008] 因此，仍然需要提供克服或至少減輕上述問題的替代方法。

【發明內容】

[0009] 本文描述的發明提供了一種利用蛋白聚合物囊泡（proteopolymersome)呈遞膜 蛋白以誘發免疫響應而無需添加已知的佐劑的方法。本發明人驚奇地發現，通過提供聚合 物囊泡的周膜（circumferential membrane)以允許膜蛋白抗原適當地折疊，可以誘發相比 于游離膜蛋白抗原更強的免疫響應。結果，實現受試者如哺乳動物中抗體產生的效率增加。 可以使用或不使用佐劑達到效率的增加。由于呈遞全長和適當地折疊的膜蛋白抗原，通過 利用本文描述的發明產生的抗體也會對體內膜蛋白靶具有更高的親和力，并且如果產生針 對病毒抗原的抗體，那么可能能夠中和病毒。
[0010] 因此，根據本發明的一個方面，它公開了一種用于在受試者中引發對免疫原的免 疫響應的方法。該方法可以包括用包含具有兩親聚合物的周膜的聚合物囊泡載體的組合物 注射所述受試者。所述組合物還包含整合到所述聚合物囊泡載體的所述兩親聚合物的周膜 內的免疫原。所述免疫原可以為膜相關蛋白或脂質抗原。
[0011] 在本發明的另一個方面，提供了一種用于免疫原的皮內，腹腔內，皮下，靜脈內，或 肌內注射，或非侵入性給藥的組合物。所述組合物可以包含具有兩親聚合物的周膜的聚合 物囊泡載體。所述組合物還可以包含整合到所述聚合物囊泡載體的所述兩親聚合物的周膜 內的免疫原。所述免疫原可以是膜相關蛋白或脂質抗原。所述組合物可以用在抗體發現， 疫苗發現，或靶向遞送中。
【附圖說明】
[0012] 在附圖中，不同視圖中的類似的參考字符通常指相同的部件。附圖不一定按比例 繪制，相反，重點通常放在說明各種實施方案的原理。在下面的描述中，參照下列【附圖說明】 本發明的各種實施方案。
[0013] 圖1示出α -溶血素濃度的標準曲線。
[0014] 圖2Α示出使用α -溶血素包被的板的抗體滴度〇. D.測量的光密度測量。用α -溶 血素呈遞聚合物囊泡注射3只小鼠（標記為"Ves-Hemo"的實心方塊），而另外3只小鼠接 受空聚合物囊泡（標記為"Ves.單獨"的空心三角形）。稀釋血清（I :1000)并且抗小鼠 HRP偶聯抗體用作第二抗體。伴隨著反復免疫隨著時間觀察到增加的抗α溶血素滴度。
[0015] 圖2Β示出使用非包被的板的與圖2Α同樣的實驗程序。未檢測到抗體結合。
[0016] 圖3示出免疫響應的光密度測量。直到第三次放血，α-溶血素呈遞聚合物囊泡 (標記為"Ves+Hemo"的實心方塊）產生比游離的α-溶血素（標記為"Hemo"的空心方塊） 更高的響應，之后兩者都實現免疫響應的飽和。有趣的是，具有佐劑的α-溶血素（標記為 "Hemo+adj"的空心圓）產生比游離的α-溶血素低的免疫響應。空聚合物囊泡（標記為 "Ves"的空心三角形）仍然無免疫原性。
[0017] 圖4示出免疫響應的光密度測量。當實施皮內注射時，在第二次和第三次放血兩 者中α-溶血素呈遞聚合物囊泡（標記為"Ves-Hemo"的實心方塊）引發比游離的α-溶 血素（標記為"游離Hemo"的空心方塊）更高的免疫響應。
[0018] 圖5示出血凝素（HA)濃度的標準曲線。
[0019] 圖6示出用于HA-插入的和空（對照）的聚合物囊泡的ELISA。
[0020] 圖7示出抗體滴度的光密度測量。在IOOng HA的等效劑量下，加強（第二次放 血）之后，HA聚合物囊泡（三角形）引發比游離HA(圓圈）更高的免疫響應（#*Ρ〈0· 001 相對于PBS組）。未包被的孔沒有檢測到抗體結合。
[0021] 描沭
[0022] 下面的詳細描述以說明的方式引用顯示具體細節和其中可以實踐本發明的實施 方案的附圖。這些實施方案被足夠詳細地描述以使本領域的技術人員能夠實踐本發明。可 以利用其他實施方案并且可以進行結構，邏輯及電方面的改變而不偏離本發明的范圍。各 種實施方案并不一定是相互排斥的，因為一些實施方案可以與一個或多個其它實施方案結 合以形成新的實施方案。
[0023] 在本文中，聚合物囊泡是具有聚合物膜的囊泡，其通常但不一定總是由兩親嵌段 共聚物的稀溶液自組裝形成，該兩親嵌段共聚物可以是不同的類型，如二嵌段和三嵌段 (A-B-A或A-B-C)。聚合物囊泡也可以由四嵌段或五嵌段共聚物形成。對于三嵌段共聚物， 中央嵌段通常通過其側翼的嵌段從環境屏蔽，而二嵌段共聚物自組裝成雙層，尾對尾放置 兩個疏水性嵌段，很大程度上是為了達到同樣的效果。在大多數情況下，囊泡膜具有不溶性 中間層和可溶性外層。自組裝誘發的聚合物囊泡形成的驅動力被認為是不溶性嵌段的微相 分離，所述不溶性嵌段為了保護自身不與水接觸而易于結合（associate)。由于組分共聚物 的大分子量，聚合物囊泡具有顯著的特性。嵌段共聚物的總分子量的增加有利于囊泡形成。 其結果是，與通過脂質和表面活性劑形成的囊泡相比，（聚合的）兩親物在這些囊泡中的擴 散非常低。由于聚集在囊泡結構中的聚合物鏈的這種較小的流動性，能夠獲得穩定的聚合 物囊泡形態。除非另有明確說明，否則術語"聚合物囊泡"和"囊泡"，如下文所用，視為類似 的并且可以互換使用。
[0024] 在本文中，抗原是可以被免疫系統的成分特異性地結合的任何物質并且只有能夠 引發（或誘發或誘導）免疫響應的抗原被認為是免疫原性的并且被稱為免疫原。膜蛋白形 成一類產生低響應水平的抗原。特別有趣的是，膜相關蛋白（即，本文所述的抗原）被整 合（或摻入或攜帶）到聚合物囊泡的壁內，從而允許所述膜相關蛋白以生理相關的方式被 折疊（即，目前被稱為聚合物囊泡載體或抗原呈遞聚合物囊泡，本文可互換使用這兩個術 語）。這極大地提高膜蛋白的免疫原性，從而當與游離膜蛋白相比時，較少量的膜蛋白可用 于產生相同水平的免疫響應。此外，聚合物囊泡的較大尺寸（與游離膜蛋白相比）允許它 們更容易地被免疫系統檢測到。
[0025] 由于在允許其適當地折疊的合成環境中使用完整蛋白質（而不是其片段）進行免 疫，分離能夠檢測體內的膜蛋白的抗體的可能性會更高。再者，可以進行免疫和抗體產生而 不需要膜蛋白結構的任何先驗知識，否則，當使用基于肽的免疫方法時，膜蛋白結構的先驗 知識是必要的。
[0026] 此外，與其他技術相比，本方法允許在穩定的膜環境中插入的膜蛋白的快速和具 有成本效益的生產。
[0027] 因此，根據本發明的一個方面，公開了一種用于在受試者中引發對免疫原的免疫 響應的方法。該方法可以包括用包含具有兩親聚合物的周膜的聚合物囊泡載體的組合物注 射所述受試者。所述組合物還包含整合到所述聚合物囊泡載體的所述兩親聚合物的周膜內 的免疫原。所述免疫原是膜相關蛋白。可選地，所述免疫原也可以是脂質抗原。在這樣的 實施方案中，所述免疫原可以是合成的脂質或天然的脂質。
[0028] 注射的頻率可以由本領域的技術人員確定和調整，取決于所需的響應水平。例如， 可以將聚合物囊泡載體的每周一次或每兩周一次的注射給予受試者，所述受試者可以包括 哺乳動物。免疫響應可以通過相對于由聚合物囊泡載體攜帶的免疫原的初始量定量哺乳動 物中的抗體的血液濃度水平而測量。聚合物囊泡的結構可包括自組裝成囊泡形式的兩親嵌 段共聚物和跨越囊泡的壁的整合的膜蛋白，由此膜蛋白是將被呈遞的抗原，并且通過重組 或體外合成或自發插入的方法并入。膜蛋白可以在洗滌劑，表面活性劑，溫度變化或PH變 化的幫助下重構。由兩親嵌段共聚物提供的囊泡結構允許膜蛋白抗原以生理上正確和功能 性的方式被折疊，從而允許靶哺乳動物的免疫系統檢測所述抗原，從而產生強烈的免疫響 應。
[0029] 在各種實施方案中，組合物的注射可以包括腹腔內，皮下，或靜脈內，肌肉內注射， 或非侵入性給藥。
[0030] 在可選實施方案中，組合物的注射可以包括皮內注射。已經令人驚奇地由本發明 人在涉及皮內注射的小鼠的實驗中發現，α-溶血素呈遞聚合物囊泡在引發免疫響應方面 比游離α-