專利名稱:與hla-a2分子形成復合物的分離的mage-3衍生肽及其應用的制作方法
發明領域本發明涉及免疫遺傳學和肽化學,尤其涉及在各方面用途廣泛的九肽、十肽、十一肽等肽類,包括免疫原及HLA-A2分子的配位體。更具體地,本發明涉及所謂的“腫瘤排斥抗原”,它來源于MAGE-3基因編碼的腫瘤排斥抗原前體并由MHC I類分子HLA-A2所呈遞。
背景和現有技術有關癌細胞被宿主有機體識別或是這種識別作用的喪失的研究已在許多不同的方向上開展起來。對該領域的了解意味著對基礎的免疫學及腫瘤學的一些了解。在小鼠腫瘤方面的早期研究揭示出,這些被呈遞的分子能夠在把腫瘤細胞移植到同源動物體內時導致對這些腫瘤細胞的排斥作用。這些分子被受體動物的T-細胞“識別”,喚起一種細胞溶解性T-細胞反應,將移植的細胞溶解。這一證據的第一次獲得是在體外用化學致癌物質,例如甲基膽蒽誘發的腫瘤中。后來發現由腫瘤所表達的能引起T-細胞反應的抗原在每種腫瘤中是不同的。見以下有關講授用化學致癌物誘發腫瘤及細胞表面抗原差異的文獻普萊恩等,全國癌癥研究所雜志18769-778 (1957);克萊恩等,癌癥研究201561-1572(1960);格羅斯,癌癥研究3326-333(1943);巴索莫布里奧,癌癥研究302458-2462(1970)。這一類抗原后來被稱作“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTAS”。在觀察到當用化學致癌物誘導時這類抗原的存在以后,當在體外通過紫外照射誘發腫瘤時也得到了類似的結果。見克里普克,全國癌癥研究所雜志53333-1336(1974)。
當在上述類型的腫瘤中觀察到T-細胞介導的免疫反應時,自發性腫瘤通常被認為是非免疫原性的。因而相信在這些腫瘤攜帶者體內不會出現能引起針對這些腫瘤的反應的抗原。見惠特等,英國癌癥雜志33241-259(1976)。
tum-抗原呈遞細胞株家族是通過誘變小鼠腫瘤細胞或細胞株而得到的致免疫性突變體,如博恩等,實驗醫學雜志1521184-1193(1980)所述,該文獻引入本文作參考。為了驗證,通過突變在同源小鼠中不產生免疫應答并將形成腫瘤的腫瘤細胞(即“tum-”細胞)而獲得tum-抗原。當這些tum+細胞被誘變時,它們被同源小鼠排斥,不能形成腫瘤(因而叫“tum-”)。見博恩等,美國全國科學進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74272(1977)(引入本文作參考)許多種類型的腫瘤已被發現表現出這種現象。見弗羅斯特等,癌癥研究43125(1983)。
因為tum-突變體能產生一個免疫排斥過程,因而它們似乎不能形成進行性的腫瘤。支持該假說的證據包括,不能以正常方式形成腫瘤的“tum-”腫瘤突變體,在其免疫系統被亞致死量射線處理抑制過的小鼠中又恢復了形成腫瘤的能力。見范佩爾等,美國全國科學進展765282-5285(1979)。還包括觀察到的腹腔注射的肥大細胞瘤P815tum-細胞在以指數級數增殖12-15天后,在注入淋巴細胞及巨噬細胞僅僅幾天后就消失了。(烏滕霍夫等,實驗醫學雜志1521175-1183,1980)。更多的證據包括觀察到小鼠獲得了一種免疫記憶,這樣使得它們能抵抗隨后的同種tum-突變體的攻擊,即使是在給予同種tum-突變體之前給予免疫抑制量的射線時。見博恩等,美國全國科學進展74272-275(1977);范佩爾等,同上;烏滕霍夫等,同上。
后期的研究發現,當自發性腫瘤易被誘變時,就生產出能引起反應的致免疫性突變體。確實,這些突變體能夠引發一種針對原始腫瘤的免疫保護性反應。見范佩爾等,實驗醫學雜志1571992-2001(1983).由此可見在腫瘤中引起作為同源排斥反應的靶的物的“腫瘤排斥抗原”的呈遞是可能的。在外源基因轉染到自發性腫瘤中時也得到了類似的結果。見費爾龍等,癌癥研究482975-1980(1988)。
已經辯認出一種抗原,它被呈遞于腫瘤細胞的表面,并被細胞溶解性T細胞所識別,從而導致溶解。后文中將把這類抗原稱作“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可能也可能不會引起抗體反應。有關這些抗原的進一步的研究是通過體外的細胞溶解性T細胞特征研究,例如通過特定細胞溶解性T細胞亞系(后文中稱之為“CTL”)對抗原的鑒定的研究而進行的。該亞系在識別被呈遞的腫瘤排斥抗原后增殖,呈遞抗原的細胞被溶解。特征性研究已經鑒別出特異性裂解表達該抗原的細胞的CTL克隆。這些工作的實例可見萊維等,最新癌癥研究241-59(1977);博恩等,實驗醫學雜志1521184-1193(1980);布魯納等,免疫學雜志1241627-1634 (1980);馬延可斯基等,歐洲免疫學雜志1241627-1634(1980);馬延可斯基等,歐洲免疫學雜志126406-412(1982);帕拉第諾等,癌癥研究475074-5079(1987)。其它類型的被CTLS識別的抗原也要求進行這類分析,包括次要組織相容性抗原,雄性特異性H-Y抗原,以及在此討論的被認為是“tum-”抗原的抗原。
以上所述的腫瘤的一個范例是P185。見德普林恩等,美國全國科學進展852274-2278(1988);茲科拉等,EMBO J.91041-1050(1990),以及西比爾等,實驗醫學雜志17235-45(1990),所述文獻引入本文作參考。P815腫瘤是一種肥大細胞瘤,用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘發,并以體外腫瘤及細胞株形式培養。P815株經過誘變后產生許多tum-突變體,包括P91A(德普林恩,同上),35B(茲科拉,同上)以及P198(西比爾,同上)突變體。與腫瘤排斥抗原形成對照的是-并且這是一個關鍵性的差別-tum-抗原僅僅在腫瘤細胞被誘變后才呈遞。腫瘤排斥抗原呈遞于給定的無須誘變的腫瘤細胞。因此,一種細胞株可以是tum+的,例如稱作P1的株,也能夠被引發而產生tum-突變體。由于tum-的表型與其父代細胞株有差異,因此可以預期這兩種細胞株的DNA也會有差別,這種差別就可以被開發來在tum-細胞中定位感興趣的基因。其結果是,已經發現tum-突變體,例如P91A,35B和P198,其基因與其正常等位基因的差別在于基因的編碼區域發生了點突變。見茲科拉和西比爾,同上,以及盧爾秦等,細胞58293-303(1989)。已證明本發明的TRAs不是這種情況。這些文獻還闡明了衍生于tum-抗原的肽為了被CTLs識別而被Ld分子呈遞。P91A被Ld呈遞。P35被Dd以及P198被Kd所呈遞。
于1992年5月22日申請的PCT申請PCT/US92/04354,講授了一個人的腫瘤排斥抗原前體編碼基因家族,稱作MAGE家族。這些基因中的幾個還在以下文獻中討論過范德布魯根等,科學2541643(1991)。現已清楚MAGE家族的各種基因在腫瘤細胞中表達,并可作為診斷這種腫瘤的標記,并用于該文討論的各種應用。另外參見特拉韋爾薩里等,免疫遺傳學35145(1992);范德布魯根等,科學2541643(1991)。有關某蛋白質被修飾及其在細胞表面呈遞的機制現在已得到很好的證明。對該領域發展的粗略的了解可參看巴林納戈“獲得一些‘基礎’MHC如何結合肽″,科學257880(1992);弗里蒙特等,科學257919(1992);馬茲目拉等,科學257927(1992),拉特恩等,科學257964 (1992)。這些文獻普遍地指出的一個要求是,這些結合到MHC/HLA分子的肽長度為9個氨基酸(一種“九肽”),而且九肽的第一個和第九個殘基很重要。
有關MAGE家族基因的研究現已揭示出,在一些腫瘤細胞的表面確實呈遞著某特定的九肽,而且要求呈遞九肽的分子是HLA-A1。MAGE-1腫瘤排斥抗原(TRAs或九肽)復合物導致呈遞它的細胞被細胞溶解性T細胞(“CTLs”)所溶解。
應注意的是,例如湯森德等的申請號___,申請日____,以及梅利夫的申請號___,申請日___中的其它MAGE衍生肽類。
美國專利申請Serial No.07/938,334(1992年8月31日申請)及073,103,(1993年6月7日申請)的研究表明,比較MAGE-1基因中編碼相關九肽的區域與各種MAGE基因的同源區域時,有著大量的同源性。實際上,這些觀察結果導致本發明的一個方面,即九肽家族中的所有成員具有相同的N-端和C-端氨基酸。這些九肽可用于各種目的,包括用作免疫原,無論是單獨使用還是與載體肽偶聯。九肽已有足夠的大小以構成抗原決定簇,由其而產生的抗體可用來鑒定這些九肽,無論其單獨存在,或者作為一個較大的多肽的一部分。
這些文獻,尤其是申請號為073,103的申請,顯示出在HLA-A1與MAGE-3之間的一種聯系;然而,僅僅有大約26%的白人和17%的黑人在其細胞表面呈遞HLA-A1分子。因此,尋找一些能被其它類型的MHC分子呈遞的肽的信息是極其有用的,這樣相當比例的人口將從以上的討論過的研究工作中受益。
現在已經發現,MAGE-3衍生肽的抗原呈遞并非僅僅局限于HLA-A1分子。本發明鑒定出了一些肽類,它們能與MHC I類分子HLA-A2形成復合物。這一發現的應用,包括在治療和診斷方面的用途,都在本發明的內容之內并在下文中描述。
優選實施方案的詳細描述實施例1如上文所述的申請No.073,230和PCT/US92/04354(引入本文作參考),MAGE-3基因序列已知。類似地,已知HLA-A2細胞由編碼MAGE-3的核酸分子轉染后被細胞溶解性T細胞溶解(參看申請No.037,230及申請No.073,103,全文引入本文作參考)。
這些發現建議了MAGE-3基因編碼的氨基酸序列以及尼吉曼等,歐洲免疫學雜志231215(1993)(引入本文作參考)所開發的計數系統以鑒定源自MAGE-3并推定結合HLA-A2 MHC分子的肽類。這篇文獻描述了一個系統,其中“錨著”(anchor),“強”和“弱”氨基酸沿多肽分布。錨著位在第二與第九氨基酸。強氨基酸可以分布在3個可能位置上,弱氨基酸可能分布在4個位置上。九肽的最大數目可能62.×43.×24或36,864。這種肽類已得到鑒定,并在下文進一步引用。
實施例2用蛋白合成儀合成了用前述方法鑒定的肽類,并以0.5mM溶解在0.9%NaCl,5%DMSO(或5%DMF,專為肽SEQ ID NO3)。這些肽溶液貯存在-80℃以備使用。
為測定肽類是否結合到HLA-A2分子,使用了細胞系174 CEM.T2。該細胞系在舍蘭德羅等,自然345449-452(1990)和斯派斯等,自然348744-747(1990)(引入本文作參考)中有述。這個細胞系在肽類向內質網即MHC I類異二聚體組裝場所轉移途徑中有缺陷,其可以組裝MHC I類分子但不穩定,當細胞溶解時經過夜培養而會分解成自由重鏈和輕鏈。然而,這種異二聚體會在體外因加入合適的肽配位體而穩定。參看湯森德等,自然340443-448(1989);湯森德等,細胞62285-195(1990);舍蘭德羅等,上述文獻;舒馬赫等,自然350703-706(1991);埃里奧特等,自然351402-406(1991);埃爾文等,歐洲免疫學雜志2172025-2031(1991)。這樣穩定下來的分子能用MHC I類分子專一的抗體免疫沉淀。
考慮到這一背景,用不含I MD M培養基的血清清洗T2細胞,然后每400ul不含I MD M培養基的血清中懸浮1.0×106個細胞,并加入100ul合成的多肽(終濃度0.1mM,1%DMSO)。所得混合物在37℃孵育過夜。孵育后,細胞先經清洗,然后依次用HLA-A2專一性單克隆抗體BB7.2和FITC標記的多克隆羊抗鼠IgG的結合片段染色。熒光比率用下述公式計算。
實驗樣品的平均熒光/背景的平均熒光這一公式的值稱為“平均熒光比率”或MF R。根據尼吉曼等,上述文獻,大于1.5的MFR表示可結合HLA-A2。
鑒定了5種預計可專一結合HLA-A2分子的肽類。用上述方法檢定,其中3種即SEQ ID NOS1,3和4可結合HLA-A2分子,其MFR值大于1.5,即肽 MFRM3-44.53 STLVEVTLGEV(SEQ ID NO1) 3.5M3-108.115 ALSRKVAEL (SEQ ID NO2) 2.17(也有小于1.5)M3-195.203 IMPKAGLLI (SEQ ID NO3) 2.37M3-220.228 KIWEELSVL (SEQ ID NO4) 2.37M3-227.286 ALVETSYVKV (SEQ ID NO5) 1.8(也有小于1.5)肽M3108.116和M3-277,286在某些實驗中MFR值小于1.5,未進一步研究。
實施例3根據實施例2中所得結果做了進一步實驗。肽M3-220-228用以產生細胞溶解性T細胞克隆,稱為CTL4.2。CTL克隆根據赫比爾斯等,歐洲免疫學雜志232072(1993)(引入本文作參考)用T2細胞得到。
一旦CTL克隆分離出來,即被用于鉻釋放檢測,方法按照博恩等,實驗醫學雜志1521184(1980)(引入本文作參考)。除了T2細胞,能呈遞HLA-A2的SK23細胞系也作了檢測,結果如下效應細胞(E)CTL4.2靶細胞(T)HLA-A2細胞加SEQ ID NO4
E/T比率 %51Cr釋放T2 T2+肽 SK23 SK23+肽30 0 91 0 357.5 0 88 -1 331.9 -1 84 -1 140.5 -1 57 -1 2這些數據表明用SEQ ID NO4脈沖的靶細胞可被細胞溶解性T細胞克隆4.2所專一性溶解。肽不存在時不會發生溶解。
以上描述了源自MAGE-3腫瘤排斥抗原前體而且能與MHC I類分子HLA-A2作用的肽類的鑒定。特別感興趣的并是本發明的一部分的是以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4為代表的肽。這些肽易于通過Mernfield或其它肽合成方法合成。因此SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的分離的肽是本發明的特征。
正如所指出的,這些肽能與HLA-A2結合,這些復合體已被免疫沉淀,導致了本發明的另一方面,即分離的由這些肽中的任何一個與HLA-A2分子形成的復合體。
這些肽及其復合體在多個方面都是有用的。正如所顯示出來的,這些肽與HLA-A2可結合,因而它們可用來分析在一個樣品中是否存在HLA-A2呈遞細胞。肽可以以某種可確定的形式與感興趣的樣品接觸,例如一種被標記的肽(放射性標記、顯色標記、等等),或結合到固相支持物上,例如一種柱子或瓊脂糖或SEPHAROSE微粒上,以及使用標準的分析方法,結合待確定的細胞。
這些肽及其分離的復合體均可用于生產對前面所提到的復合體有特異性的單克隆抗體或細胞溶解性T細胞克隆。完成此工作所需的方法對本領域熟練技術人員來說很熟悉,而且有關細胞溶解性T細胞克隆的生產在前面已有例子。由于某些癌癥細胞呈遞MAGE-3衍生肽如SEQ ID NOS3或SEQ ID NO4與HLA-A2的復合體,這些單克隆抗體和細胞溶解性T細胞克隆可做為試劑用于診斷癌癥。上述的鉻釋放分析是用CTLs確定感興趣的靶細胞的一種分析方法的范例,而且現有技術非常熟悉免疫分析及其操作方法。
如此衍生而來的細胞溶解性T細胞可用于諸如過繼轉移等方案。見格林伯格等,免疫學雜志136(5)1917(1986);瑞德爾等,科學257238(1992);林奇等,歐洲免疫學雜志211403(1991);開斯特等,細胞59603(1989)所有文獻引人本文作參考。在這種方法中,前面所列舉出的肽與抗原呈遞細胞(“APCS”)結合形成穩定的復合體。已知許多這類方法,例如,披露于劉舍爾等,自然35172-74(1991);羅美托等,實驗醫學雜志174603-612(1991);劉舍爾等,免疫學雜志1481003-1011(1992);羅美托等,免疫學雜志1503825-3831(1993);Romero et al.,J.Exp.Med.1771247-1256(1993);羅美托等,美國專利申請133,407(1993年10月5日申請)等文獻上的方法(所有文獻引入本文作參考)。隨后,使呈遞細胞接觸細胞溶解性T細胞(源),產生對感興趣的復合體有特異性的細胞溶解性T細胞克隆。較好的做法是使用發現于待用CTLs治療的患者血樣中的一種自體性T細胞克隆。CTLs產生之后,就重注入待治療的對象體內,其劑量應足以改善癌變的狀況,如通過溶解癌細胞,抑制其繁殖等。
本發明的其它方面對于熟練技術人員很清楚,在此無須重述。
在此處所用的一些術語與表達僅是出于描述的需要而非限制,并且這些術語和表達的使用不排除任意等價的被顯示或描述的特征或其部分,在本發明的范疇之內各種修改是可能的。
序列表(1)一般信息(i)申請人皮埃爾·范德布魯根蒂爾瑞·博恩-法勒爾卡蒂亞·特拉韋爾薩里凱瑟琳娜·弗萊舍爾(ii)發明名稱與HLA-A2分子形成復合物的分離的MAGE-3衍生肽及其應用(iii)序列數5(iv)聯系地址(A)聯系人Felfe & Lynch(B)街道805第3大道(C)城市紐約市(D)州紐約州(E)國家美國(F)郵編10022(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤5.25寸,360kb存儲量(B)計算機IBM PS/2(C)操作系統PC-DOS(D)軟件Wordperfect(vi)本申請資料(A)申請號08/217,187(B)申請日1994年3月24日(C)分類435(viii)代理人/代理信息(A)姓名諾曼·D·漢森(B)登記號30,946(C)案號/文檔號LUD 5344(ix)電信資料(A)電話(212)688-9200(B)傳真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO1Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val5 10(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu5(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO3Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile5(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO4Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val5 10
權利要求
1.分離的肽,選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4組成的一組。
2.權利要求
1的分離的肽,命名為SEQ ID NO3。
3.權利要求
1的分離的肽,命名為SEQ ID NO4。
4.HLA-A2與權利要求
1的分離的肽形成的分離的復合物。
5.權利要求
4的分離的復合物,其中所述的肽命名為SEQ ID NO3。
6.權利要求
4的分離的復合物,其中所述的肽命名為SEQ ID NO4。
7.特異于HLA-A2與選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的肽所形成復合物的分離的細胞溶解性T細胞克隆。
8.權利要求
7的分離的細胞溶解性T細胞克隆,其中所述的肽是SEQ ID NO3。
9.權利要求
7的分離的細胞溶解性T細胞克隆,其中所述的肽是SEQ ID NO4。
10.特異于HLA-A2與選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的肽所形成的復合物的單克隆抗體。
11.權利要求
10的單克隆抗體,其中所述的肽是SEQ ID NO3。
12.權利要求
10的單克隆抗體,其中所述的肽是SEQ ID NO4。
13.權利要求
7的分離的細胞溶解性T細胞克隆在制備用于治療癌癥的藥物中的用途,其中所述癌癥的特征是在癌細胞表面呈遞HLA-A2與選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的肽所形成的復合物。
14.權利要求
13的用途,其中所述的肽是SEQ ID NO3。
15.權利要求
13的用途,其中所述的肽是SEQ ID NO4。
16.權利要求
13的用途,其中所述的細胞溶解性T細胞來源于自體細胞溶解性T細胞。
17.對HLA-A2和選自SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的肽形成的復合物有特異性的試劑在制備用于診斷癌癥的診斷劑中的用途。
18.權利要求
17的用途,其中所述試劑是細胞溶解性T細胞克隆。
19.權利要求
17的用途,其中所述試劑是單克隆抗體。
專利摘要
本發明鑒定了源于腫瘤排斥抗原前體MAGE-3的腫瘤排斥抗原。這些“TRAs”結合到MHCI類分子HLA-A2,形成的復合物刺激溶解呈遞細胞的細胞溶解性T細胞的產生。肽與復合物可在診斷、治療中使用,可作為生產抗體的免疫原,或作為生成細胞溶解性T細胞克隆的靶。
文檔編號G01N33/577GKCN1142177SQ95192260
公開日2004年3月17日 申請日期1995年3月21日
發明者皮埃爾·范德布魯根, 皮埃爾 范德布魯根, 博恩-法勒爾, 蒂爾瑞·博恩-法勒爾, 特拉韋爾薩里, 卡蒂亞·特拉韋爾薩里, 凱瑟琳娜·弗萊舍爾, 娜 弗萊舍爾 申請人:路德維格癌癥研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan