專利名稱：分離分子分析物的方法和裝置的制作方法
技術領域：
在一些實施方式中，本發明涉及分子分析和分離，更具體地，但不排他地，涉及使用電聚焦(電集中，electrofocusing)進行分子分析和分離的方法。
背景技術：
等電聚焦是一種通過利用分子的不同離子性質來分離分析物樣品中分子的分析技術。等電聚焦通常在電解液中進行，可選地為凝膠形式，例如基于聚丙烯酰胺、淀粉和 /或瓊脂糖，具有固定的質子濃度梯度，通常該質子濃度梯度在給定方向上從較高的PH向較低的PH變化。在一些實施方案中，溶液含有兩性電解質，其在電場下生成pH分布(pH分布圖，pH profile) 0在等電聚焦中，分離發生在占據了整個分離距離并被布置成使梯度中的PH從陽極向陰極增加的pH分布中。使用中，將分析物裝載到電解液的某個位置。根據分子的不同官能團的酸度(PKa)，每個不同分子的電荷響應于環境質子濃度而變化。將電勢平行地施加于等電聚焦陽極和等電聚焦陰極之間的質子濃度梯度。具有凈正電荷的分子穿過電解液陰極遷移，而具有凈負電荷的分子穿過電解液陽極遷移。隨著分子遷移，環境pH發生改變而降低分子上的凈電荷直到該分子到達等電點 (Pl)，在等電點處，由于環境PH，所以分子上的凈電荷為零。pi為特定分子或表面不攜帶凈電荷時的PH。在該點，由于具有零電荷，所以遷移的分子停止。以這樣的方式，等電聚焦將具有某一 Pi的分子聚焦到電解液的相對較窄容積中。等電聚焦通過根據蛋白質的酸度而表征它們低于蛋白質的分析很有用。更重要地，它對于蛋白質混合物的分離很有用。于2009年3月5日公開并以引用方式并入本文中的國際專利申請公開 NO.W02009/027970，描述了在包括電解質的環境，如電解液、凝膠等中，在產生質子的局部濃度、質子濃度梯度和期望質子濃度外形中有用的方法和裝置。這個申請還公開了用于等電聚焦的方法和裝置。

發明內容
根據本發明的一些實施方式，提供了一種分離具有不同等電點(Pl)的多種分子分析物的混合物的方法。所述方法包括將含有多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積(分離體積或分離容器，s^aration volume)中，沿(橫跨，across)該分離容積的軸生成具有多個PH區(pH帶，pHzone)的pH分布，以及調節該pH分布中的分布以誘導該多種分子分析物中的第一種沿所述軸遷移而與該多種分子分析物中的第二種分開，該第一和第二種分子分析物具有不同的Pi。可選地，pH分布包括至少兩個具有不同pH水平的pH梯級區(pH臺階區，pH step zone)，在所述調節之前，該多種分子分析物被限制(俘獲，trap)在具有基本均勻的pH的該至少兩個PH梯級區之間，所述調節包括改變該至少兩個pH梯級區之一中的pH。可選地，調節隨時間逐漸地進行。可選地，pH分布由至少一個坡臺區(匝道或過渡區，ramp或rampzone)限定(定義，define)，多種分子分析物聚集在該至少一個坡臺區中。可選地，生成包括沿所述軸對溶液施加電場，并在沿該軸的多個點處注入多個離子流以建立PH分布。可選地，所述方法包括向溶液中加入至少一種緩沖成分以穩定該pH分布。可選地，所述方法包括收集第一種分子分析物，而第二種分子分析物保留在分離容積中。可選地，所述方法包括調節所述分布以誘導第二種分子分析物沿所述軸遷移而與多種分子分析物中的第三種分開，該第二和第三種分子分析物具有不同的pi。可選地，調節包括調節所述分布以誘導所述第一和第二分子分析物沿所述軸在相反的方向上遷移。可選地，調節包括調節所述分布以改變沿所述軸的遷移的方向，以使第一分子分析物相繼(依次，sequentially)在兩個相反的方向上移動。可選地，多個pH區包括具有基本均勻的第一 pH的兩個梯級區，所述兩個梯級區由具有基本均勻的第二 pH的中間梯級區(middle step zone)分隔開，混合物被限制在該兩個梯級區之一和中間梯級區之間，調節包括改變該中間梯級區中的pH。 可選地，多個pH區包括至少三個不同的pH區，所述調節逐步進行以誘導第一分子分析物遷移至在多個PH區的第一對(pH區)之間的第一坡臺區，以及第二分子分析物遷移至在多個PH區的第二對(pH區)之間的第二坡臺區。可選地，對所述溶液進行緩沖。可選地，所述方法包括提供混合物中的一種或多種分子分析物的等電點，并根據等電點來設置溶液，其中根據等電點確定溶液的緩沖濃度，以及根據該確定來設置溶液。可選地，調節包括聚焦(集中)第一和第二種分子分析物以沿所述軸彼此分開。更加可選地，進一步包括從沿所述軸的不同位置分別收集第一和第二種經聚焦 (集中)的分子分析物。可選地，所述生成包括根據一組代數方程來計算pH分布。可選地，調節包括根據一組代數方程來計算對pH分布的至少一種調節，并根據該至少一種調節進行所述調節。根據本發明的一些實施方式，提供了一種分離具有不同等電點(pi)的多種分子分析物的混合物的方法。所述方法包括將含有多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中，將多種分子分析物限制在容納(含有，contain)所述溶液的分離容積中的兩個pH梯級區之間，每一個PH梯級區具有不同的基本均勻的pH，以及逐漸改變該兩個pH梯級區之一的PH以誘導多個分離組中的多種分子分析物相繼遷移，其中每個組具有不同的pi。可選地，所述限制包括對所述溶液施加電場并在沿其至少一個點處注入多個離子流以建立所述兩個PH梯級區。根據本發明的一些實施方式，提供了一種基于分子分析物的等電點來分離分子分析物的方法。所述方法包括在具有多種分子分析物的溶液中生成具有多個PH區的pH分布，并在一段時間內逐漸改變該PH分布的分布，從而根據它們各自的等電點來誘導多種分子分析物的空間分離。根據本發明的一些實施方式，提供了一種分離具有不同等電點(pi)的多種分子分析物的混合物的裝置。所述裝置包括一個大小和形狀確定(尺寸化和成一定形狀， sized and shaped)的容器，該容器沿軸容納具有多種分子分析物的溶液；在溶液中沿所述軸施加電場的電源；用于在溶液中沿所述軸建立PH分布的多個離子源，其中通過注入多個離子流以對所述溶液的多個區域進行質子化和去質子化中的至少一種；以及控制器，其操作所述多個離子源以逐漸調節PH分布從而誘導每個分子分析物分別沿所述軸的遷移。可選地，所述裝置進一步包括用于接收來自計算單元和用戶(使用者)中的至少一個的多個指令的界面(接口，interface)，所述控制器根據所述多個指令來操作所述多個離子源。可選地，所述容器具有至少一個小于1毫米的維度(尺寸，dimension)。可選地，所述溶液是非凝膠溶液。除非另有定義，本文中所使用的所有技術和/或科學術語的含義與由本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。盡管與本文所述類似或等同的方法或材料可在本發明的實施方式的實施或測試中使用中，但是以下描述了示例性方法和/或材料。在沖突的情況下，參考本發明的說明書，包括定義。另外，這些材料、方法和實施例僅是舉例說明性的，而不用于必要性的限制。


本文僅以舉例的方式，參照附圖描述了本發明的一些實施方式。具體參照附圖的詳細內容，強調了以舉例的方式顯示細節，并用于對本發明的實施方式進行舉例說明性的討論。在這方面，參考附圖的描述使得對于本領域技術人員來說如何實施本發明的實施方式是顯而易見的。在附圖中圖1為根據本發明的一些實施方式，基于分子分析物的等電點來分離它們的方法的流程圖；圖2A-2E為根據本發明的一些實施方式，在一段時間內的動態pH分布及其對容器內的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖；圖3A為根據本發明的一些實施方式，基于分子分析物的等電點在分離容積中分離它們的示例性分離裝置的側視圖的示意圖；圖;3B為根據本發明的一些實施方式，如圖3A所示的示例性分離裝置的側視圖的示意圖，其中沿其通道具有PH傳感器的陣列；
圖4A和4B為根據本發明的一些實施方式的pH分布的示意圖，調節所述pH分布以誘導分子分析物向與圖2A-2E所示的遷移相反的方向遷移；圖4C-4E為根據本發明的一些實施方式的pH分布的示意圖，調節所述pH分布以誘導分子分析物的雙向移動；圖4G-4K為根據本發明的一些實施方式，在一段時間內的動態多階PH分布及其對容器內的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖；圖5A-5G為根據本發明的一些實施方式的曲線地示出了分子分析物如何相繼向著位于PH分布的末端附近的pH坡臺區移動的示意圖；圖6為根據本發明的一些實施方式的使具有不同pi的分子分析物分別以相對較高的速度沿PH分布移動的方法；圖7A-7E為根據本發明的一些實施方式的曲線地示出如何使分子分析物以相對較高的速度沿動態PH分布移動的示意圖；圖8A-8E為根據本發明的一些實施方式的曲線地示出如何使分子分析物以相對較高的速度沿動態PH分布移動的另一示意圖；圖9A為根據本發明的一些實施方式，基于分子分析物的pi來分離它們的示例性裝置的示意圖。圖9B-9D為根據本發明的一些實施方式，可以用于圖9A的示例性裝置的示例性離子源的示意圖；圖IOA和圖IOE示出了根據本發明的一些實施方式的一個容器，例如圖3所示的， 在質子和氫氧根注入的情況下，具有非緩沖溶液和相關的電流密度；圖10B-D和圖10F-H分別示出了根據本發明的一些實施方式的沿一個軸的動態pH 分布，例如圖IOA和圖IOE所示的；圖IlA和圖IlC示出了根據本發明的一些實施方式的一個容器，例如圖3所示的容器，在質子和氫氧根注入的情況下，具有緩沖溶液，連同相關的電流密度；圖IlB和圖IlD示出了根據本發明的一些實施方式的沿一個軸的pH分布，例如圖 IlA和圖IlC所示的；圖12為示出了根據本發明的一些實施方式的電流的變化與緩沖溶液和非緩沖溶液的PH之間的相關性的曲線圖；和圖13為示出了根據本發明的一些實施方式的電流的變化和具有三種緩沖劑的溶液的PH之間的相關性的曲線圖，其中的兩種緩沖劑具有兩種質子化狀態，而另一種具有三種質子化狀態；以及圖14為根據本發明的一些實施方式的對一種或多種分子分析物設置緩沖溶液的方法的流程圖1400。
具體實施例方式在一些實施方式中，本發明涉及分子分析和分離，并且更具體地但不排他地，涉及利用電聚焦來進行分子分析和分離的方法。根據本發明的一些實施方式，提供了時間上分離具有不同等電點(pi)的分子分析物的混合物的方法和裝置。所述方法基于在分離容積中生成具有不同PH區的pH分布， 其中該分離容積包括具有分子分析物(如蛋白質)的混合物的溶液。在PH分布之后，可選地形成梯度，其分布在一段時間內逐漸改變以根據它們各自的Pi誘導分子分析物的空間分離。可選地，改變該分布以便誘導具有不同Pl的分子分析物沿共同軸(如PH分布軸) 分離移動。具有不同Pl的分子分析物可同時或相繼向著相反方向和/或相繼向著相同方向移動。可選地，通過逐漸增加或降低一個或多個具有基本穩定的PH分布的pH的梯級區的PH而改變該分布。根據本發明的一些實施方式，公開了一種分離具有不同pi的多種分子分析物的混合物的裝置。所述裝置包括大小和形狀確定的容器，用于包含沿軸具有多種分子分析物的溶液，例如平均直徑為約1毫米或更小的通道，例如切割輪廓為100x3x0. 3mm的通道。所述裝置進一步包括在溶液中沿軸施加電場的高壓電源，例如沿通道的軸。所述裝置進一步包括離子源，被設置成通過注入可降低或增高分離容積的某些區域的PH的離子流而在溶液中沿該軸建立PH分布，例如該離子源可以是如提交于2009年8月18日的美國臨時專利申請No. 61/272，110中所定義的。離子源與控制器連接，該控制器操作多個離子源以逐漸調節PH分布從而誘導每一個分子分析物分別沿軸遷移，可選地相繼遷移。可選地，控制器連接于計算單元和/或界面，如手動界面，其允許使用者提供用于生成PH分布的指令以及動態地改變其以誘導分子分析物遷移。在詳細解釋本發明的至少一個實施方式前，應理解，本發明在其應用上不必局限于在以下描述和/或附圖所示和/或實施例中提供的部件和/或方法的構建和布置的細節。本發明能夠是其它實施方式或以不同方式被實施或實現。現在參考圖1，其為根據本發明的一些實施方式，基于分子分析物的等電點(pi) 來分離它們的方法50的流程圖。如本文中所使用的，分子分析物是指分子，生物分子，如蛋白質，肽，基于肽的藥物化合物，和基于生物分子的藥物化合物，以及PH依賴性目標物如膠體或任何其他帶電荷分子，其可以經歷質子化/去質子化。分離沿分離容積進行，可選地在包括分子分析物的溶液，如電解液中進行。首先，如在51處所示的，在具有分子分析物的混合物的溶液中生成具有不同pH梯級區的PH分布。該pH分布沿某一軸形成，該軸在本文中可以稱為pH分布軸。沿該pH分布軸施加一個電勢以誘導離子流，例如，如下所述的。形成該PH分布以便于將混合物的分子限制(俘獲，trap)在不同pH梯級區之間的pH坡臺區中。例如，圖2A示出了這樣的pH 分布，其中以帶圓圈的數字1、2和3標記的三種分子分析物處于高pH梯級區和低pH梯級區之間的坡臺區。可選地，使用如下關于圖3A和圖;3B所述的裝置生成pH分布。假定分子分析物如蛋白質在低PH值(其中質子濃度較高)下具有正電荷，并且在高pH值(其中質子濃度較低)下具有負電荷。可通過控制沿著含有上述溶液的容器的不同區域的PH水平而建立PH分布，例如在圖3A和圖;3B中的數字102所示的。通過調節pH梯級區中的質子濃度而實現控制。現在，如在52處所示的，調節pH分布的分布以基于分子分析物的等電點而誘導一種或多種分子分析物的遷移，例如沿著PH分布軸的遷移。pH分布的調節使分子分析物基于它們的Pl移動。每種分子分析物沿PH分布軸移動直到它到達其中其pH不攜帶凈電荷的 PH區。在這個區域中，局部pH等于其pi使得分子分析物的移動速度被降至大致為零，并且分子分析物處于停止。如以下進一步描述的，這樣的移動沿PH分布軸形成具有不同pi的分子分析物的多個分離組。可選地，在外電場存在下，該分離基于帶電分子分析物的移動特性，例如其遷移速度。這些特性與其電荷成正比，并且因此隨著沿該PH分布軸的區域中的 PH改變而變化。可選地，pH分布是時間上控制的。例如，隨時間在監控時間間隔內逐漸調節PH分布。由于具有不同Pi的不同分子分析物具有不同的遷移速度，所以它們沿PH分布的遷移速度是不同的。同樣地，分子分析物在某種分布中沿PH分布移動某一距離所花費的時間是其Pi的指示。同樣地，不同分子分析物沿具有某種分布的PH分布到達某一目標區域位置的順序是其相關Pi值的指示。此外，由于不同分子分析物的遷移速度不同，所以可以通過在分離容積中使其以不同速度沿PH分布軸移動而分離分子分析物的組。如本文所使用的，在一段時間期間被可控調節的pH分布稱為動態pH分布。通過在分離容積中建立動態PH分布，分子分析物不但可在空間上分離，即分離至不同pH區，而且可在時間上分離，即在不同時間槽分別到達分離容積中的相同位置。例如，如上所述的PH 分布的改變允許在時間上將分子分析物到達分離容積中的某一區域分開。如以下進一步描述的，這允許放置探針單元以探測或放置診斷單元以診斷在其前面移動的分子分析物。當將pH分布設置為某種靜態分布時，分子分析物沿著所述分布停在某一位置上。當逐漸動態地改變PH分布的分布時，由于在特定區域中的時間依賴性pH變化實現不同分子之間在時間上的分離，所以相繼釋放分子分析物。通過緩慢改變PH分布，可以使pi值接近的兩種分子從某個PH坡臺區(在分離前，蛋白質濃集在坡臺區中)在釋放時間上的分離任意大，產生特征在于任意小Pl差異的蛋白質的分離。這樣的分離是在空間上實現的。現在參照圖3A，其是根據本發明的一些實施方式，基于分子分析物的等電點(pi) 而在分離容積中分離它們的示例性分離裝置100的側視圖的示意圖。這種分離允許分別診斷和/或收集分子分析物。分離裝置100建立了空間-時間PH分布，一種動態PH分布，在溶液中具有時間依賴性PH限制區。當通過改變pH梯級區之一的pH來調節pH分布時，一些分子分析物從限制區釋放，而其它仍保持受限制。以這樣的方式，可使不同的分子分析物彼此分離。分離裝置100包括多個離子源101，其可選地被布置為靠近容器102的陣列，該容器102限定分離容積并容納溶液，如電解液。容器102在本文可稱為通道和/或聚焦通道。如以下進一步描述的，通過在容器102的多個不同區域向容器102中提供多個離子流， 其中每個離子流改變不同區域的pH水平，離子源101被設置成在溶液中建立pH分布。在其中建立PH分布的容器102的分離容積中，每個離子源101改變各自pH區域的pH。可選地，離子源101通過生成離子流并將其注入聚焦通道102中，沿著與容器102的縱軸99平行的PH分布軸、或與其平行的任意其它軸而控制不同區域處的pH水平。可選地，離子源 101為pH發生器，容器為聚焦通道，例如如在提交于2009年8月18日的美國臨時專利申請 No. 61/272，110中描述的，將其以引用方式并入本文。如圖3A所示的，容器102的左側和右側分別連接于可稱為原料儲罐的溶液容器 103、104。電解液容器之一 103連接于陰極105，而另一個104連接于陽極106，它們與高壓電源108連接并設置成在容器102中沿分離容積施加高壓(HV)。可選地，系統100進一步包括控制器110，其控制主電流源108和/或離子源101，可選地分別進行控制。控制器110 可通過指令一些或所有離子源101改變各個區域的pH而改變pH分布。應主意，雖然僅示出了三個離子源101，但分離裝置100可具有任意數量的離子源 101，例如，4、8、12、16、20、100個或任意中間值或更大數值。
可選地，如圖:3B所示以及在以引用方式并入本文的提交于2009年8月18日的臨時專利申請No. 61/272，110中描述的，將pH傳感器313的陣列沿通道放置，以連同控制器 110及質子/氫氧根源101 —起閉合反饋環。使用中，用溶液填充通道102，可選地如下所述地進行選擇。然后，向控制器提供指令以形成期望的動態PH分布，適用于分離加入到該溶液中的某種混合物。可選地，控制器110連接于允許手動提供動態pH分布的用戶(使用者)接口。在另一個實施方式中，連接于控制器110的計算單元(未顯示)自動地計算動態PH分布，可選地使用以下方程，例如基于所探測的分子分析物的pi。接下來，接通HV電源108以在分離容積中維持如300V的電勢差。然后控制器110根據使用者的輸入/或計算單元來操作離子源110，并且，如果存在pH傳感器313，則激活反饋環，以隨時間維持期望的PH分布。當后者已建立時，將混合物通過裝載器插入通道102中，該裝載器可選地位于容器102的一側。分子分析物隨后根據通道102內的pH和電場進行遷移。隨著后者移動并聚焦，使用者可根據期望的動態PH分布重新設置pH分布。然后控制器110根據實時接收的指令來操作離子源101。如本文所使用的，實時是指在沒有超過幾秒的計算延遲下調節 PH分布。最后，如以下進一步所述的，遷移的分子分析物通過收獲單元分別收集或在沿通道的某一位置進行探測。與現有的等電聚焦裝置相比，這種分離裝置100具有許多有利的特征。例如，所述裝置允許使用無凝膠和/或兩性電解質的溶液，有利于更高的純化產率和更短的純化時間。此外，分離裝置100可以被設計成使每個逃逸的分子直到其被純化而僅移動約為1毫米(mm)的短距離，使得純化時間相對較短。另外，在一些分離策略中，分子沿共同的軌跡移動，使得收獲和/或診斷單元的設計和/或操作簡單。這些單元可以被定位在指定的點，從那里可收回或探測到所有分子。最后，PH分布可以適合時間和/或空間方式， 從而為每種生物分子混合物形成最佳的純化過程。這樣的分離裝置100可通過誘導分子分析物中的一些沿著在容器102的分離容積中形成的PH分布的遷移而用于分離分子分析物。例如，現在參照圖2A-2E，其是根據本發明的一些實施方式的動態pH分布及其隨時間推移對在容器102的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖。設置兩個離子源 101以建立如2A所示的PH分布。如上所述的，圖2A示出了在pH分布的高pH梯級區和低 PH梯級區之間的pH坡臺區處的三種不同的分子分析物。三個區域的空間尺寸可選擇為10 微米至數厘米(cm)，例如10cm，20cm, 50cm或任意中間值或更大的數值，而pH坡臺區的典型尺寸為數十微米。通過陰極105和陽極106以數字201所示的方向施加電場。通過改變容器的不同區域中的PH來限定pH分布中的pH坡臺區202，以使pH水平限定如下pH(I) > pll > pI2 > pI3 > pH(III)以及 pH(I) > pH(II) > pH(III)其中pH(I)-pH(III)分別表示高pH梯級區、pH坡臺區和低pH梯級區的pH水平， PI1-PI3分別表示第一、第二和第三分子分析物的pi。在圖2A中，在注入到梯級區I或梯級區III中之后，三種分子分析物(例如三種蛋白質)的混合物濃集于PH坡臺區II，。如果插入高PH梯級區如區域I，假定分子分析物具有負電荷，并因此會以與電場方向相反的方向朝向低PH梯級區移動。如果將分子分析物注入低pH梯級區如區域III，假定它們具有正電荷，并因此會以電場的方向朝向較高PH梯級區移動。在任一種情況下，分子分析物在溶液中形成的電場中朝向標記為PH坡臺區II的pH坡臺區移動，在那里由于它們的pi在其PH水平處并因此它們未攜帶凈電荷，所以受到限制。當低pH梯級區誘導分子分析物獲得正電荷，而高PH穩定水平誘導它們獲得負電荷時，分子分析物的分子被限制。現在，如圖2B所示，調節pH分布以誘導分子分析物中的一種遷移。在所示的實例中，改變PH分布以使區域III中的pH增加至在pI3和pI2之間的中間值，即至其中pH⑴ > pll >pI2> pH(III) >pI3的一個點。在這種分布下，第三分子分析物帶負電，以便其以與電場流動相反的方向，從PH坡臺區朝向pH分布的低pH梯級區的右端移動，例如如圖 2C所示。為清晰起見，用實線箭頭標記圖2A-2E中的移動方向，并用具有標記E的箭頭標記電場。同時，第一和第二分子分析物仍保留在PH坡臺區中。現在可例如在容器102的分離容積的右手側收集和/或探測第三分子分析物。為了使第二分子分析物與第一分子分析物分離，將低PH梯級區的pH進一步升高至在pHl和pH2之間的中間值，即至pH(I) > pll >pH(III) >pI2>pI3的一個點，例如圖2D所示。現在，使第二分子分析物帶負電以使其朝向PH分布的右端移動，在那里它可以單獨地從第一和第三分子分析物被收集和/或診斷。最后，如圖2E所示，將高pH梯級區的pH值升高至高于pll的值，并且使第一分子分析物帶負電以使其朝向PH分布的右端移動，在那里它可以單獨地從第三和第二分子分析物被收集和/或診斷。顯然，以這種方式，可單獨地收集和/或診斷任意數量的分子分析物， 其中收集和/或診斷時間可與所收集和/或所診斷的分子分析物的Pl在時間上同步。根據本發明的一些實施方式，分離裝置100隨時間單一地例如線性地逐漸改變pH 分布，例如升高區域中的一個，例如高PH梯級區中的pH。以這樣的方式，將分子分析物相繼釋放，在形成分離的遷移帶中，這可稱為組，如圖2E所示。可通過任意慢地升高某一區域如低PH區域的pH，使這些帶之間的空間分離任意大，從而在帶之間的pi分離中產生任意高的分辨率。可選地，可通過傳統餾分收集器和/或通過其它蛋白質收獲技術，在與PH分布的右端相對應的區域右端上，將三個帶作為獨立的組收集。另外地或可替換地，可通過傳統分子探針和/或通過其它分子探測技術，在與PH分布的右端相對應的區域右端上分別診斷三個帶。應注意，可通過降低一個或多個區域的pH來調節pH分布，可選地逐漸進行調節， 以誘導分子分析物向相反方向遷移，例如如圖4A和4B所示。例如，通過降低區域I的pH 來調節PH分布以誘導分子分析物，例如第一和第二上述分子分析物的遷移。在所示的實例中，改變PH分布以使區域I中的pH降低至在pll和pI2之間的中間值，隨后降低至在pI2 和pI3之間的中間值，即先降低至其中pll >pH(I) >pI2 >pI3 >pH(III)的一個點，然后降低至其中Pll > pI2 > pH(I) > pI3 > pH(III)的一個點。可選地，如圖4C所示，改變pH分布以誘導分子分析物向兩個相反的方向遷移。例如，通過同時和/或逐步降低區域I中的PH和升高區域III的pH，調節圖IA所示的上述pH 分布以誘導分子分析物向相反方向遷移，例如上述分子分析物中第一和第三分子分析物。應注意，分子分析物可以在沒有濃集在某個區域中的情況下被分離。例如，如圖4D 所示，當PH梯級區中的pH與其內分子分析物的pi不相同時，在該pH梯級區中可發生分離。 由于分子分析物I為電正性，而分子分析物II和III為電負性，并因此向不同方向遷移，所以在分子分析物I與分子分析物II和III之間形成分離。相同的策略可應用于例如將第一分子分析物釋放至左側，將第三分子分析物釋放至右側，并在如圖4E所示的不同pH坡臺區中將它們捕獲，同時將第二分子分析物保留在中間PH坡臺區。
現在參照圖4G-4K，其是根據本發明的一些實施方式的動態多級pH分布以及它們隨時間推移對容器的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖。在所示的實施方式中， 在基于PH相繼布置的不同pH梯級區之間形成多個pH坡臺區。這允許從和/或在沿pH分布軸的不同位置收獲和/或診斷具有不同Pl的分子分析物。這樣的多級PH分布允許形成良好限定的蛋白質帶，其適合通過傳統蛋白質帶收獲方法進行收獲。圖4G與圖2A相同，其滿足PH(I) > pll > pI2 > pI3 > pH(III)。在圖4H中，將標記為區域III的低pH梯級區升高至在PI3和pI2之間的中間值，即至其中pH(I) >pll > pI2 > pH(III) > pI3的一個點。如圖4H所示，標示為IV的另外的pH坡臺區及標示為V的另一個pH梯級區在區域III的右側形成，以使pI3> pH(V)。如圖41所示，在這樣的pH模式下，pH(I) >pll > pI2 > pH(III) > pI3 > pH(V)，并且第三分子分析物帶負電，以向右端移動并被限制在pH 坡臺區IV中。第一和第二分子分析物仍保持限制在pH坡臺區II中。在圖2J中，在進一步將PH梯級區III的pH升高至其中pH⑴>pll > pH(III) > pI2 > pI3的一個點，并且形成分別標記為VI和VII的第三pH坡臺區和第三pH梯級區后，使得pH(I) > pll > PH(III) >pI2> pH(VII) >pI3>pH(V)。第二分子分析物從限制區釋放并向著右端移動，直到在PH坡臺區VI中被捕獲。現在，三種分子分析物中的每一種分別在不同的pH坡臺區中被捕獲，如圖4K所示，并可以直接被診斷和/或收獲，和/或可選地分別在不同時間被釋放，以在右側邊緣處被收集。在這樣的實施方式中，根據某種模式，通過簡單地將離子注入通道中而進行分離。 這允許分子分析物如蛋白質在沿通道的多個位置聚焦，分別在PH坡臺區中。在單獨地收集和/或診斷分子分析物之前進行聚焦。以這樣的方式，可提高產率，并且不同蛋白質可反復聚焦于不同的預設位置，以使收獲單元可在固定位置進行收獲。應注意，當降低一個或多個區域的pH時，可以類似地進行誘導分子分析物向pH分布的左端的遷移。例如，圖5A-5G示出了分子分析物如不同的蛋白質如何相繼向著位于pH 分布的左端附近的坡臺區移動。通過降低PH梯級區V中的pH，可進行這些圖中所示的逐步遷移。現在參照圖6，其是根據本發明的一些實施方式，使具有不同pi的分子分析物以相對較高的速度沿PH分布分別遷移的方法700。如上所述，分子分析物沿pH分布軸遷移直到它們到達其中它們不攜帶凈電荷的區域。每種分子分析物的遷移速度與其電荷成正比， 該電荷是溶液中集合區域(hosting zone)的pH的派生物。首先，如在701處所示，形成具有在兩個高/低PH梯級區之間的中間梯級區的pH分布。該pH分布可包括由較低的中間 PH梯級區分開的兩個高pH梯級區，或具有由較高的中間pH梯級區分開的兩個低pH梯級區的PH分布。簡言之，具有這樣的分布的pH分布在本文中分別稱為高-低-高pH分布和低-高-低PH分布。圖7A和圖8A分別示出了這樣的用于三種示例性分子分析物的分布。現在，如在702處所示，根據pH分布的模式，從pH分布軸的一側，例如容器102的一側，例如左側，提供分子分析物。進行注入以將分子分析物限制在PH坡臺區。如果分布為高-低-高，那么可從任意部位將分子分析物注入通道中，除了在高電勢側的高梯級區， 例如，在圖7中的右側。否則，分子分析物可能不聚焦(集中)。在這種情況下，分子分析物聚焦(集中)于位于較低電勢側的坡臺區，例如圖7中所示的左側。可替換地，如果分布為低-高-低，那么可從任意部位將分析物注入通道中，除了低電勢側的低梯級區，例如圖8中所示的左側。在這種情況下，分子分析物聚焦于位于較高電勢側的坡臺區，例如圖8中所示的右側。分子分析物遷移，直到被限制在高梯級區和低梯級區之間的PH坡臺區，例如圖7A和8A所示的。如上所述，當遷移至一側的嘗試通過將分子分析物推回限制區域的負電荷慢慢地形成并且遷移至另一側的嘗試通過類似地將分子分析物推回限制區域的正電荷慢慢地形成時，受限制的分子分析物被限制。最初，如圖7A所示，限定分布以使pH(I) =pH(V) > pll > pI2 > pI3 > pH(III)， 并且三種示例性分子分析物如蛋白質被捕獲在PH坡臺區II。使梯級區III盡可能短，優選在約10微米至1000微米的范圍內，以將蛋白質在其中它們的電荷相對較小的區域III中的移動時間最小化。現在，如在703處所示，對pH分布的中間梯級區進行調節以誘導一種或多種受限制的分子分析物的遷移。例如，圖7B示出了通過升高中間穩定區的pH至其中pH(I)= PH(V) > pll > pI2 > pH(III) > pI3的一個點，而調節pH分布以誘導標記為pI3的第三分子分析物的遷移。與之前的一樣，這種增加使第三分子分析物從PH坡臺區II釋放，同時其他分子分析物仍保持受限制。輕微帶負電的第三分子分析物移動至右端直到到達PH坡臺區IV。在該點，并因此第三分子分析物的pH的負電荷顯著增加。因此，如圖7C所示，第三分子分析物的遷移速度顯著加快，例如快10倍、100倍或1000倍，縮短了相對于根據圖1 中所示的方法進行的分離的分離時間。為簡略，使用雙箭頭標記更高的速度。如在704處所示，可在多個階段調節分布從而以相繼的方式釋放分子分析物。例如，以相繼的方式增加和/或降低中間PH梯級區的pH，例如如圖7A-7E和圖8A-8E所示。在圖8A-8E中，以pi 降低的順序進行分離。三種示例性分子分析物的起始PH分布為pH(III) >pll>pl2> P13SPi^1) =pH(V)，并且限制在pH坡臺區IV中的三種分子分析物在圖8A中示出。使用中，作為時間的函數將PH梯級區III的pH慢慢降低至其中pll >pH(III) > pI2 > pI3 > PH(I) =pH(V)的一個點。在這種情況下，第一分子分析物帶正電并開始向左側移動。在到達PH坡臺區II時，pH下降，并且第一分子分析物的正電荷及其遷移速度顯著增加，例如如圖8C所示。第二和第三分子分析物相繼重復同樣的過程，如圖8D和8E所示。現在參照圖9A，其是根據本發明的一些實施方式，基于分子分析物的pi分離它們的示例性裝置900的示意圖，用于收集和/或診斷具有一種或多種分子分析物的混合物。圖 9A進一步示出了在示例性裝置900的容器102中生成的pH分布的示意性曲線。示例性裝置900與圖3A所示的一樣，然而，離子源101基于離子注入，如以下進一步描述的。具有適當電解液的容器102限定密閉的分離容積，在其中生成pH分布并對其進行調節，例如如上所述。電場橫穿該分離容積，例如如上所述。離子源101被設置成以可控方式將質子和/或氫氧根離子注入沿著在分離容積中形成的PH分布軸的特定區域。該容器包括用于引入分子分析物(如蛋白質)的混合物和收獲分離過程的產物的裝置。在所示的實施方式中，裝置的容器102將分離限定在由兩個儲罐供料的細長通道中。通道102的長度可在數十微米(如果由微機械加工制造)至數毫米、厘米或數十厘米 (如果由常規方法制造)變化。通道的平均直徑和厚度可在1微米和數厘米之間變化，例如寬度在1微米和/或1毫米之間。質子和氫氧根離子源101沿通道分布，并設置成將離子注入通道中的區域。例如，分別使用三個氫氧根源和兩個質子源來形成圖4和圖5所示的 PH分布。這樣的離子源的實例示于圖9B-9D，其是根據本發明的一些實施方式，在示例性裝置900中可以同時或可交還地使用的不同示例性離子源的示意圖。圖9B示出了質子/氫氧根源911，其包括通過開口 913和透析膜914連接至分離通道102的小室912。透析膜防止或降低蛋白質從分離通道102至小室912的泄漏，同時允許在這些容積之間的離子交換。 質子/氫氧根源911通過在室912中混合酸和堿溶液，而在分離容積的鄰近區域中設置pH。 例如，如果離子源為質子源，則過量的酸溶液與堿溶液混合而得到總體PH < 7的區域。如果離子源為氫氧根源，則進行相反的操作并在區域中形成PH > 7。可選地，將酸和堿溶液置于獨立的容器中，并以期望的量供給相應的質子/氫氧根源室。圖9C示出了基于電解的離子源921，其通過使用雙極膜922和電壓來裂解水而產生質子，其中所述電壓沿在分離通道102和浸沒在質子源室924中的鉬電極923之間的膜施加。可選地，基于電解的離子源921是如以引用方式并入本文的提交于2009年8月18日的臨時專利申請No. 61/272，110中所定義的。選擇雙極膜922的極性以使質子在膜922的通道側上生成，而氫氧根離子在室側上生成。選擇施加于膜922的偏壓以使負端(negative terminal)提供給膜的通道側，而正端提供給鉬電極。在這些條件下，水在膜中裂解。將所生成的質子注入通道中，并且氫氧根離子從膜注入到室中，在那里它們與在鉬電極923上生成的質子重新結合而產生水。顯然，并且如在臨時專利申請No. 61/272，110中所述的，可類似地構建氫氧根離子源。為此目的，將雙極膜與電壓源的極性一起反轉。在這種構造中， 在膜922中由水裂解生成的氫氧根離子注入分離通道，而質子注入氫氧根源室擬4中，在那里它們與在鉬電極上生成的氫氧根離子重新結合而產生水。圖9D示出了另一個離子源931，其中通過在浸沒在源室936中的兩個鉬電極932、 933之間施加電壓而電解水。可對通道935附近的鉬電極933進行穿孔以改善離子傳輸至通道。在其中陰極電極更靠近分離通道的情況下，將氫氧根離子注入該通道中。為了將質子注入通道，可將偏壓極性反轉以使現在的陽極鄰近該通道。現在參照對形成和調節pH分布以誘導分子分析物沿pH分布軸遷移的方法的描述。通過將質子和/或氫氧根離子注入承載電場的通道中來實施該方法，其用來生成PH分布，如容器102。本文的描述也教導了合適電解質及注入流的選擇以實現在空間上的期望 PH分布，并可選地及時對其進行改變。完整計算的簡單近似作為算法在本文中公開，用于模擬通過以上關于圖9A所述的裝置的分離過程的涉及的裝置操作。沿通道(如102)中的分離容積的PH分布，可以通過以下對于所有涉及的離子的遷移方程加以描述方程1 SCi / a + 孓(-D1 · VC1 + ZiFpiC1E) = R1在合適的邊界和起始條件下與以下泊松-波爾茲曼方程(Poisson-Boltzmarm equation)聯合方程2^4 = 14χ1014·ΣΖΑ
i以米、千克和/或秒(MKS)為單位，Ci表示物質i的離子的摩爾濃度，Di表示i的擴散系數，Pi表示i的電遷移率，Zi表示i的質子電荷單元中的電荷，F表示法拉第常數， Ri表示物質i的反應期間(reaction terms)，而云表示聚焦通道如容器102中的電場。應注意，雖然本文中的實例與蛋白質相關，但可以使用任意分子分析物。可選地，后一方程考慮到在溶液中發生的化學反應，從而形成一組多個非線性微
14分方程，這允許計算出數值解。可選地，以下允許對生成用于上述分離過程的動態pH分布的pH分布發生器進行編程。利用化學反應(如質子-氫氧根重組)相對較快的事實和外電場中的離子遷移比某些離子擴散占優勢的事實(除了緊鄰質子/氫氧根注入附近)，可制定出在穩態下捕獲本質物理現象的分析易處理模型。該模型闡明上述裝置在分離過程期間的工作方式，并提供用于選擇生成期望的PH分布的參數的工具。因此該簡化的模型公開了用于對裝置規劃分子分析物分離測定，如蛋白質測定的模擬裝置的算法。為簡明起見，限定兩種類型的pH變化操作，一種聚焦PH坡臺區和一種散焦 (defocusing) pH坡臺區。聚焦pH坡臺區的特征為在pH坡臺區的低電勢側具有較高的pH 值，以及在PH坡臺區的高電勢側具有較低的pH值，例如如圖2A所示的。散焦pH坡臺區則相反，即特征為在PH坡臺區的低電勢側具有較低的pH值，而在pH坡臺區的高電勢側具有較高的PH值，例如圖7A中所示的pH坡臺區IV。聚焦pH坡臺區捕獲pi在pH坡臺區的高 PH值和低pH值之間的所有蛋白質。散焦pH坡臺區在延長時間后仍不會捕獲蛋白質。根據本發明的一些實施方式，在不攜帶緩沖分子的鹽水溶液中形成PH分布。圖 IOA和圖IOE示出了分別將質子和氫氧根離子注入分離通道1000，如上述裝置100，900的分離通道。由左右儲罐供料的分離通道1000的特征為具有兩個pH值，本文分別標記為pHA 和pHB，其中pHA>pHB。示出了通道中相關的離子(粒子)流密度連同到通道1000中的注入流1001，以及電場1002的方向。圖10B-10D和10F-10H示出了在不同注入條件下沿pH 分布軸的示例性PH分布。在圖IOA和IOE中將pH分布軸標記為A-A虛線。在圖10B-10D 中，PHa= 11，pHB = 5。圖IOB示出了無注入流時的pH分布，其中Jh = 0。由左側儲罐供給的氫氧根流比由右側儲罐供給的質子流占優勢，并且質子-氫氧根重組可穩定分離通道和右側儲罐之間的界面。整個通道中的PH與左側儲罐中的pH相同。圖IOC示出了在一些質子注入通道后的pH分布。pH梯級區III中的注入點右側的PH降低，如圖IOC中實線所示，從而形成聚焦pH坡臺區。對于增加的質子注入，聚焦pH 坡臺區變陡直到它達到其最大值，例如在圖IOC中由虛點線所標記的。當將注入升高超過離子流的這個極限值時，會導致PH坡臺區的翻轉，將其從聚焦pH坡臺區轉變為散焦pH坡臺區。結果如圖IOD所示。要提及的是，在聚焦pH坡臺區中，區域I的pH保持不變而區域 III的PH隨電流而改變。在散焦pH坡臺區中則相反，即區域III的pH保持不變而其區域 I中的相應值隨施加的電流而改變。例如，當生成如圖2A所示的動態pH分布時，所得到的圖IOC中的虛點線聚焦pH 坡臺區使Pl在PH 11和pH 7之間的所有蛋白質聚焦。當降低質子注入流減少而產生由圖 IOC中的實線所示的pH坡臺區時，pi在pH 7和pH 9之間的所有蛋白質被釋放。相對于圖7A，圖IOD中所示的散焦pH坡臺區可加快pi < 3的蛋白質向右遷移。 過量質子注入下產生的散焦PH坡臺區可用于實現圖7A-7E所示的動態pH分布，其中需要聚焦和散焦PH坡臺區。圖IOF示出了對于其中pHA = 9、pHB = 3及Jqh = 0情況的pH分布。由于通過右側儲罐供給的質子流比通過左側儲罐供給的氫氧根流占優勢，所以通道102中的pH等于 PHb0在圖IOG中，與圖IOC所示的類似，氫氧根離子的少量注入產生由實線所示的聚焦pH 坡臺區，而虛點線舉例說明了當施加極限電流時達到的最大聚焦PH坡臺區。超過這個電流會引起PH坡臺區翻轉，如圖IOH中所示。對于等電點在pH 3和pH 7之間的蛋白質，在這種構造中可以實現圖4A-4E中所示的順序。 可使用如下方程來計算圖10A-10D的區域I和III中的穩態pH值方程
權利要求
1. 一種分離具有不同等電點(pi)的多種分子分析物的混合物的方法，包括將包含多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中；沿所述分離容積的軸生成具有多個PH區的pH分布；以及調節所述PH分布的分布以誘導所述多種分子分析物中的第一種沿所述軸遷移而與所述多種分子分析物中的第二種分開，所述第一和第二種分子分析物具有不同的Pi。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PH分布包括至少兩個具有不同pH水平的 PH梯級區，在所述調節之前，所述多種分子分析物被限制在具有基本均勻的pH的所述至少兩個PH梯級區之間，所述調節包括改變所述至少兩個pH梯級區的一個中的pH。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述調節隨時間逐漸地進行。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述pH分布由至少一個坡臺區限定，所述多種分子分析物聚集在所述至少一個坡臺區中。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述生成包括沿所述軸對所述溶液施加電場，并在沿所述軸的多個點處注入多個離子流以建立所述PH分布。
6.根據權利要求1所述的方法，進一步包括將至少一種緩沖成分加入到所述溶液中以使所述PH分布穩定。
7.根據權利要求1所述的方法，進一步包括收集所述第一種分子分析物，而所述第二種分子分析物保留在所述分離容積中。
8.根據權利要求1所述的方法，進一步包括調節所述分布以誘導所述第二種分子分析物沿所述軸遷移而與所述多種分子分析物中的第三種分開，所述第二和第三種分子分析物具有不同的Pl。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述調節包括調節所述分布以誘導所述第一和第二種分子分析物沿所述軸在相反的方向上遷移。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述調節包括調節所述分布以改變沿所述軸的所述遷移的方向，以使所述第一種分子分析物相繼在兩個相反的方向上移動。
11.根據權利要求1所述的方法，其中，所述多個PH區包括具有基本均勻的第一pH的兩個梯級區，所述兩個梯級區由具有基本均勻的第二 PH的中間梯級區分隔開，所述混合物被限制在所述兩個梯級區中的一個和所述中間梯級區之間，所述調節包括改變所述中間梯級區中的pH。
12.根據權利要求1所述的方法，其中，所述多個pH區包括至少三個不同的pH區，所述調節逐漸地進行以誘導所述第一種分子分析物遷移至在所述多個PH區的第一對之間的第一坡臺區，以及所述第二種分子分析物遷移至在所述多個PH區的第二對之間的第二坡臺區。
13.根據權利要求1所述的方法，其中，對所述溶液進行緩沖。
14.根據權利要求13所述的方法，進一步包括提供所述混合物中的一種或多種分子分析物的等電點，并根據等電點設置所述溶液， 其中根據所述等電點確定所述溶液的緩沖濃度；和根據所述確定來設置所述溶液。
15.根據權利要求1所述的方法，其中，所述調節包括聚焦所述第一和第二種分子分析物以沿所述軸彼此分開。
16.根據權利要求15所述的方法，進一步包括在沿所述軸的不同位置分別收集所述第一和第二種經聚焦的分子分析物。
17.根據權利要求1所述的方法，其中，所述生成包括根據一組代數方程來計算所述PH 分布。
18.根據權利要求1所述的方法，其中，所述調節包括根據一組代數方程來計算對于所述PH分布的至少一種調節，并根據所述至少一種調節進行所述調節。
19.一種分離具有不同等電點(pi)的多種分子分析物的混合物的方法， 其包括將包含多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中；將所述多種分子分析物限制在容納所述溶液的分離容積中的兩個PH梯級區之間，每個所述PH梯級區具有不同的基本均勻的pH ；以及逐漸改變所述兩個PH梯級區的一個中的pH，以誘導在多個分離組中的所述多種分子分析物的相繼遷移，其中每個所述分離組具有不同的pi。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述限制包括對所述溶液施加電場并在沿至少一個點處注入多個離子流，以建立所述兩個PH梯級區。
21.一種基于分子分析物的等電點來分離所述分子分析物的方法，包括 在具有多種分子分析物的溶液中生成具有多個PH區的pH分布；在一段時間內逐漸地改變所述PH分布的分布，以根據所述多種分子分析物各自的等電點誘導所述多種分子分析物的空間分離。
22.—種分離具有不同等電點(pi)的多種分子分析物的混合物的裝置， 包括大小和形狀確定的容器，其沿軸容納具有多種分子分析物的溶液； 在所述溶液中沿軸施加電場的電源；用于在所述溶液中沿所述軸建立PH分布的多個離子源，其中通過注入多個離子流以對所述溶液的多個區進行質子化和去質子化中的至少一種；以及控制器，其操作所述多個離子源以逐漸地調節所述PH分布，從而誘導每一種所述分子分析物單獨地沿所述軸遷移。
23.根據權利要求22所述的裝置，進一步包括用于接收來自計算單元和用戶中的至少一個的多個指令的界面，所述控制器根據所述多個指令來操作所述多個離子源。
24.根據權利要求22所述的裝置，其中，所述容器具有至少一個小于1毫米的維度。
25.根據權利要求22所述的裝置，其中，所述溶液是非凝膠溶液。
全文摘要
一種分離具有不同等電點(pI)的多種分子分析物的混合物的方法。所述方法包括將含有多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中，沿該分離容積的軸生成具有多個pH區的pH分布，以及調節該pH分布的分布以誘導第一分子分析物沿所述軸遷移而與第二分子分析物分開。該第一和第二分子分析物具有不同的pI。
文檔編號G01N27/447GK102472724SQ201080036972
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月18日 優先權日2009年8月18日
發明者烏里·西萬, 埃拉德·布羅德 申請人:工業研究與發展基金會有限公司