本發(fa)明屬于生物(wu)醫藥材料(liao)領域，尤(you)其(qi)涉及一(yi)種鹿(lu)茸膠原蛋(dan)白(bai)復合生物(wu)玻璃修復材料(liao)的(de)制(zhi)備方法。
背景技術：
自發現(xian)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)玻(bo)(bo)(bo)璃(li)至今，人們更(geng)多關注(zhu)的(de)(de)(de)是生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)玻(bo)(bo)(bo)璃(li)組份對(dui)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)影響(xiang)(xiang)。納(na)米技術的(de)(de)(de)興起(qi)，使人們開始認識到結構對(dui)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)活(huo)性(xing)也有重要影響(xiang)(xiang)，更(geng)加注(zhu)重于(yu)尺(chi)寸(cun)效應、微觀精細結構對(dui)材料(liao)結構和性(xing)能(neng)的(de)(de)(de)影響(xiang)(xiang)。從納(na)米尺(chi)寸(cun)出(chu)發研發設計的(de)(de)(de)納(na)米生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)玻(bo)(bo)(bo)璃(li)、介孔生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)玻(bo)(bo)(bo)璃(li)更(geng)是備受國內外學者的(de)(de)(de)關注(zhu)。生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)玻(bo)(bo)(bo)璃(li)能(neng)激活(huo)細胞基因，有利于(yu)增強細胞的(de)(de)(de)增殖與分化，具有骨誘導和骨傳(chuan)導的(de)(de)(de)作用。但鑒(jian)于(yu)其(qi)無定(ding)形(xing)硅(gui)骨架的(de)(de)(de)存在(zai)，生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)玻(bo)(bo)(bo)璃(li)仍呈現(xian)為無定(ding)形(xing)態，機械性(xing)能(neng)差(cha)，且藥物(wu)(wu)(wu)附(fu)著性(xing)差(cha)，其(qi)在(zai)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)醫藥材料(liao)上的(de)(de)(de)應用還有待進一(yi)步(bu)開發。
技術實現要素：
為了解決現有技術(shu)中存在的(de)(de)(de)(de)問(wen)題(ti)，本發明提供了一種機械性(xing)能好(hao)，且具(ju)有優良的(de)(de)(de)(de)藥物(wu)附(fu)著性(xing)的(de)(de)(de)(de)鹿茸(rong)膠原蛋白復合生物(wu)玻璃修復材料的(de)(de)(de)(de)制備方法。
本發明采用以(yi)下技術方案：
一種鹿茸膠原蛋白復合生物玻璃修復材料的制備(bei)方(fang)法，包括(kuo)以下步驟：
步驟一：取(qu)鹿茸(rong)粉，按質(zhi)量(liang)比(bi)1:30的料液(ye)(ye)(ye)比(bi)加(jia)入到0.45mol/l、ph7.5的nacl溶(rong)液(ye)(ye)(ye)中，溶(rong)液(ye)(ye)(ye)提(ti)取(qu)24h，過濾后(hou)保留提(ti)取(qu)液(ye)(ye)(ye)，殘渣重復(fu)上述步驟1次，將(jiang)2次提(ti)取(qu)液(ye)(ye)(ye)合并，得鹿茸(rong)膠原蛋白粗提(ti)液(ye)(ye)(ye)；
步驟二：稱取鹿(lu)茸膠原(yuan)蛋(dan)白(bai)粗提液(ye)，加入0.02mol/l、ph7-7.5的磷酸鹽緩沖液(ye)中，制成(cheng)質量濃(nong)度(du)1％的溶液(ye)，同(tong)時加入質量百分比1％的蛋(dan)白(bai)酶(mei)，室溫下酶(mei)解反應2h，反應結束于(yu)100℃酶(mei)滅活10min，將酶(mei)解液(ye)離(li)心(xin)處(chu)理，取上清液(ye)凍干得(de)到鹿(lu)茸膠原(yuan)蛋(dan)白(bai)；
步驟三：稱取10g甲殼素置于三口燒瓶中，并加入3mol/l的鹽酸溶液，其中甲殼素與鹽酸溶液的投料比為1/30g·ml-1，將混合溶液煮沸回流，過程中不斷攪拌，反應持續6小時后，將混合溶液離心并去除上層液體，取下層沉淀物重新置于三口燒瓶中并按1/30g·ml-1投料比加入(ru)(ru)到(dao)(dao)3mol/l的(de)(de)(de)鹽酸溶液中(zhong)，繼續加熱回流6小時后，將混合溶液離(li)(li)(li)心并(bing)去(qu)除上層(ceng)液體，取下層(ceng)沉(chen)淀物用去(qu)離(li)(li)(li)子(zi)水反復沖洗(xi)直至ph值達到(dao)(dao)3-4之間，在沉(chen)淀物中(zhong)加入(ru)(ru)100ml去(qu)離(li)(li)(li)子(zi)水進(jin)行(xing)超聲(sheng)分散(san)，再(zai)將分散(san)均勻的(de)(de)(de)分散(san)液轉移到(dao)(dao)截留分子(zi)量(liang)為(wei)8000-14000的(de)(de)(de)透(tou)(tou)析(xi)袋(dai)中(zhong)，將其浸入(ru)(ru)去(qu)離(li)(li)(li)子(zi)水中(zhong)進(jin)行(xing)透(tou)(tou)析(xi)，每2h跟換一次去(qu)離(li)(li)(li)子(zi)水，直至透(tou)(tou)析(xi)袋(dai)內外溶液ph值均為(wei)7，透(tou)(tou)析(xi)好(hao)的(de)(de)(de)分散(san)液通過(guo)砂芯漏(lou)斗過(guo)濾(lv)，過(guo)濾(lv)后加入(ru)(ru)到(dao)(dao)50ml去(qu)離(li)(li)(li)子(zi)水中(zhong)進(jin)行(xing)超聲(sheng)分散(san)，分散(san)均勻后加入(ru)(ru)30ml丙酮進(jin)行(xing)離(li)(li)(li)心處理(li)，取下層(ceng)沉(chen)淀物超聲(sheng)分散(san)在三氟(fu)乙醇溶液中(zhong)，制成(cheng)質量(liang)濃度(du)12％的(de)(de)(de)甲殼素(su)溶液；
步驟四：將5g聚(ju)環氧乙烷-聚(ju)環氧丙烷-聚(ju)環氧乙烷三嵌段共聚(ju)物溶于62g體積濃度(du)為(wei)70％的(de)乙醇溶液(ye)中，充分攪拌后，依次(ci)加入(ru)6g硅酸(suan)(suan)乙酯(zhi)、0.7g磷(lin)酸(suan)(suan)三乙酯(zhi)、1.5gca(no3)2·4h2o、1g0.5m鹽酸(suan)(suan)溶液(ye)，得混合液(ye)；
步驟五：將混合(he)液(ye)在室溫(wen)下攪拌24h后靜置，當溶液(ye)呈粘稠狀溶液(ye)時，即制得(de)生物玻(bo)璃溶液(ye)；
步驟六：將鹿(lu)茸(rong)膠原蛋白、甲殼素溶液、生物玻璃溶液按質量比(bi)3:50:9混合均勻，使(shi)用(yong)(yong)超聲波震(zhen)蕩對(dui)其進(jin)行分散，50℃條件下磁(ci)力攪拌(ban)1h，再在(zai)室(shi)溫下繼(ji)續攪拌(ban)8h，得(de)到粘稠(chou)溶液置于與(yu)高壓裝(zhuang)置連接(jie)的(de)醫(yi)用(yong)(yong)針管中，通(tong)過靜電(dian)紡絲制(zhi)得(de)修復材料(liao)，高壓裝(zhuang)置電(dian)壓為20kv，將制(zhi)得(de)的(de)材料(liao)在(zai)40℃下真(zhen)空干燥(zao)。
優選的，步驟六中(zhong)所(suo)述的醫用針管(guan)的容量為20ml。
優選的，步驟六中所(suo)述的醫用針(zhen)管的針(zhen)頭固定在距離靜電紡(fang)絲接收(shou)板(ban)20cm處。
本發明(ming)的有益效果在于：
1)甲殼(ke)素具有(you)良好(hao)的生(sheng)物相容性(xing)、抗菌性(xing)及(ji)優良的機械性(xing)能。
2)生物玻璃具有良好的生物相容性，且具有組織修復的功能(neng)，能(neng)激活(huo)細胞基因(yin)，有利于增強細胞的增殖與分化，具有骨誘導和骨傳導的作用。
3)鹿茸膠原蛋白中含有(you)促細胞生長(chang)(chang)因子(zi)和表皮生長(chang)(chang)因子(zi)，對修復機體和護養皮膚大有(you)好處(chu)。
4)甲(jia)殼(ke)素可以(yi)(yi)改善材(cai)料的機械(xie)性(xing)能(neng)，生物玻璃可以(yi)(yi)改善材(cai)料的醫藥性(xing)能(neng)。
5)采用靜電紡絲技術制備的材料，具有(you)良(liang)好的孔隙率，有(you)利于藥(yao)物的附(fu)著。
具體實施方式
下(xia)面(mian)結合實(shi)施例(li)對本發明做進(jin)一步的描述(shu)。
實施例1
一種鹿茸膠(jiao)原(yuan)蛋白復合生(sheng)物玻璃(li)修(xiu)復材料的制備方(fang)法，包括以(yi)下步驟：
步(bu)驟(zou)一(yi)：取(qu)鹿茸粉，按(an)質量比(bi)1:30的料液(ye)比(bi)加入(ru)到0.45mol/l、ph7.5的nacl溶液(ye)中，溶液(ye)提取(qu)24h，過濾后(hou)保(bao)留提取(qu)液(ye)，殘渣重復上(shang)述步(bu)驟(zou)1次，將2次提取(qu)液(ye)合并，得鹿茸膠(jiao)原蛋白(bai)粗提液(ye)；
步驟二：稱取(qu)鹿茸(rong)膠(jiao)原(yuan)蛋(dan)(dan)白粗提液(ye)，加入(ru)0.02mol/l、ph7-7.5的磷(lin)酸鹽緩沖液(ye)中，制成質(zhi)量濃度1％的溶液(ye)，同時(shi)加入(ru)質(zhi)量百分比1％的蛋(dan)(dan)白酶(mei)，室(shi)溫(wen)下酶(mei)解反(fan)應(ying)(ying)2h，反(fan)應(ying)(ying)結束于100℃酶(mei)滅(mie)活10min，將酶(mei)解液(ye)離心處理，取(qu)上清液(ye)凍干(gan)得到(dao)鹿茸(rong)膠(jiao)原(yuan)蛋(dan)(dan)白；
步驟三：稱取10g甲殼素置于三口燒瓶中，并加入3mol/l的鹽酸溶液，其中甲殼素與鹽酸溶液的投料比為1/30g·ml-1，將混合溶液煮沸回流，過程中不斷攪拌，反應持續6小時后，將混合溶液離心并去除上層液體，取下層沉淀物重新置于三口燒瓶中并按1/30g·ml-1投料比(bi)加(jia)(jia)入(ru)到(dao)3mol/l的(de)鹽酸溶液中(zhong)，繼續加(jia)(jia)熱回流6小時后，將混合溶液離(li)心(xin)并去(qu)(qu)除(chu)上層(ceng)(ceng)液體，取(qu)下層(ceng)(ceng)沉(chen)淀物(wu)用(yong)去(qu)(qu)離(li)子(zi)水(shui)反復沖洗直至ph值達(da)到(dao)3-4之間，在(zai)沉(chen)淀物(wu)中(zhong)加(jia)(jia)入(ru)100ml去(qu)(qu)離(li)子(zi)水(shui)進行超(chao)(chao)聲分散，再將分散均(jun)勻的(de)分散液轉(zhuan)移到(dao)截留分子(zi)量為8000-14000的(de)透析(xi)袋中(zhong)，將其浸入(ru)去(qu)(qu)離(li)子(zi)水(shui)中(zhong)進行透析(xi)，每2h跟換一次去(qu)(qu)離(li)子(zi)水(shui)，直至透析(xi)袋內外溶液ph值均(jun)為7，透析(xi)好的(de)分散液通過砂芯漏斗過濾(lv)，過濾(lv)后加(jia)(jia)入(ru)到(dao)50ml去(qu)(qu)離(li)子(zi)水(shui)中(zhong)進行超(chao)(chao)聲分散，分散均(jun)勻后加(jia)(jia)入(ru)30ml丙酮進行離(li)心(xin)處(chu)理，取(qu)下層(ceng)(ceng)沉(chen)淀物(wu)超(chao)(chao)聲分散在(zai)三氟乙醇(chun)溶液中(zhong)，制成(cheng)質量濃度(du)12％的(de)甲殼(ke)素溶液；
步驟四(si)：將5g聚(ju)環(huan)氧(yang)乙(yi)(yi)烷-聚(ju)環(huan)氧(yang)丙烷-聚(ju)環(huan)氧(yang)乙(yi)(yi)烷三(san)嵌(qian)段共聚(ju)物溶于(yu)62g體(ti)積濃度為70％的乙(yi)(yi)醇溶液(ye)中，充分攪拌后，依次(ci)加(jia)入6g硅酸(suan)乙(yi)(yi)酯(zhi)(zhi)、0.7g磷(lin)酸(suan)三(san)乙(yi)(yi)酯(zhi)(zhi)、1.5gca(no3)2·4h2o、1g0.5m鹽酸(suan)溶液(ye)，得混合液(ye)；
步驟五：將(jiang)混(hun)合液(ye)在室溫下攪拌24h后靜置，當溶(rong)液(ye)呈粘稠狀溶(rong)液(ye)時，即制得生物玻璃溶(rong)液(ye)；
步驟六：將(jiang)鹿(lu)茸膠(jiao)原(yuan)蛋白(bai)、甲殼素溶(rong)液(ye)、生物玻璃溶(rong)液(ye)按質量(liang)比3:50:9混(hun)合均(jun)勻，使用超聲(sheng)波震(zhen)蕩對其進行分(fen)散(san)，50℃條件下(xia)磁(ci)力(li)攪拌1h，再在室(shi)溫(wen)下(xia)繼(ji)續攪拌8h，得到粘稠溶(rong)液(ye)置于(yu)與高壓(ya)(ya)裝(zhuang)置連接的(de)醫用針管中，通過靜電(dian)紡絲制得修復材料(liao)，高壓(ya)(ya)裝(zhuang)置電(dian)壓(ya)(ya)為20kv，將(jiang)制得的(de)材料(liao)在40℃下(xia)真(zhen)空干(gan)燥(zao)。
步驟六中所述(shu)的醫(yi)用針(zhen)管(guan)的容量為20ml，步驟六中所述(shu)的醫(yi)用針(zhen)管(guan)的針(zhen)頭固定在距離(li)靜電紡絲接(jie)收板20cm處。