本發明涉及一種脫細胞(bao)基(ji)質(zhi)(zhi)，特別涉及一種心(xin)臟全器官脫細胞(bao)基(ji)質(zhi)(zhi)的制備方法(fa)。

背景技術：

心血(xue)管病(bing)(bing)(bing)在(zai)我國(guo)乃至全世界(jie)已成為(wei)發(fa)病(bing)(bing)(bing)率及(ji)死亡(wang)率最(zui)高的(de)疾病(bing)(bing)(bing)之一(yi)(yi)，嚴(yan)重威脅人類健康。其中，終末(mo)期心臟病(bing)(bing)(bing)患病(bing)(bing)(bing)率的(de)增加已成為(wei)心血(xue)管疾病(bing)(bing)(bing)中重要的(de)醫(yi)療問題(ti)，而(er)(er)心臟的(de)原位異(yi)體(ti)移植是當前針對其唯一(yi)(yi)有效的(de)治療手段。然(ran)而(er)(er)，心臟移植手術目前卻(que)面臨著諸多挑戰，如工體(ti)嚴(yan)重不(bu)足以及(ji)移植后免疫排(pai)斥等問題(ti)，極大(da)限制了臨床應用。

心臟全器官脫(tuo)細胞(bao)(bao)機制處理的目的是在(zai)盡(jin)可能清楚細胞(bao)(bao)內物質(zhi)成(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)(fen)的情況下(xia)而(er)更多保留細胞(bao)(bao)外基質(zhi)有(you)效(xiao)成(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)(fen)(包括膠原(yuan)、糖(tang)胺聚糖(tang)、可溶性生長因子(zi)等)。在(zai)以往研究中，盡(jin)管不(bu)(bu)斷有(you)新的脫(tuo)細胞(bao)(bao)方法(fa)出現，但是由于不(bu)(bu)同(tong)脫(tuo)細胞(bao)(bao)方法(fa)對(dui)細胞(bao)(bao)外基質(zhi)各組分(fen)(fen)影響(xiang)不(bu)(bu)盡(jin)相同(tong)，迄(qi)今(jin)為止尚且沒有(you)一(yi)種理想的脫(tuo)細胞(bao)(bao)方法(fa)能夠完整保持細胞(bao)(bao)外基質(zhi)有(you)效(xiao)成(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)(fen)。

物理(li)洗(xi)脫(tuo)即利(li)用冷(leng)(leng)凍、直(zhi)接(jie)沖洗(xi)、超(chao)聲(sheng)(sheng)法(fa)(fa)(fa)和(he)攪(jiao)拌(ban)法(fa)(fa)(fa)等(deng)方法(fa)(fa)(fa)將細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)成(cheng)(cheng)分去除。對(dui)于(yu)較為(wei)堅韌的(de)(de)(de)組(zu)織(如肌(ji)腱、韌帶(dai)等(deng))，快(kuai)速(su)冷(leng)(leng)凍法(fa)(fa)(fa)最(zui)為(wei)常(chang)用。快(kuai)速(su)冷(leng)(leng)凍可以(yi)使(shi)組(zu)織和(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)內部形成(cheng)(cheng)大量冰晶，從(cong)而(er)(er)達到迅速(su)破(po)壞(huai)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜，使(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)溶(rong)解的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)。通過(guo)這種暴(bao)力(li)的(de)(de)(de)方法(fa)(fa)(fa)破(po)壞(huai)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)還不夠，要徹底洗(xi)脫(tuo)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)成(cheng)(cheng)分，還需再(zai)利(li)用沖洗(xi)法(fa)(fa)(fa)通過(guo)灌流(liu)液在(zai)器(qi)官(guan)脈管(guan)結構(gou)內不斷地循環沖洗(xi)，方可達到目的(de)(de)(de)。另(ling)外，超(chao)聲(sheng)(sheng)和(he)攪(jiao)拌(ban)法(fa)(fa)(fa)通常(chang)會結合(he)化學洗(xi)脫(tuo)法(fa)(fa)(fa)一起進行。利(li)用超(chao)聲(sheng)(sheng)或攪(jiao)拌(ban)首先使(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)物理(li)破(po)碎(sui)，再(zai)利(li)用化學洗(xi)滌劑將破(po)碎(sui)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)成(cheng)(cheng)分逐漸洗(xi)脫(tuo)。而(er)(er)心(xin)臟(zang)是(shi)介于(yu)堅韌和(he)柔(rou)軟之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)器(qi)官(guan)，其脫(tuo)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)通常(chang)不會采(cai)用過(guo)于(yu)暴(bao)力(li)的(de)(de)(de)方法(fa)(fa)(fa)，以(yi)免破(po)壞(huai)結構(gou)。

可用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)(yu)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)的(de)化學(xue)物質種類(lei)繁(fan)多(duo)(duo)，最常見的(de)有(you)(you)酸(suan)堿(jian)(jian)(jian)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)法(fa)、高(gao)滲(shen)(shen)-低(di)滲(shen)(shen)溶(rong)液(ye)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)法(fa)和(he)(he)(he)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)劑(ji)(ji)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)法(fa)。酸(suan)堿(jian)(jian)(jian)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)的(de)原(yuan)理(li)均是(shi)利用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)化學(xue)酸(suan)/堿(jian)(jian)(jian)性環境破(po)(po)(po)(po)壞(huai)分(fen)子(zi)結構(gou)，最終達到清除(chu)細胞(bao)的(de)目(mu)(mu)的(de)。其中(zhong)，過氧(yang)乙酸(suan)是(shi)一(yi)種薄層組織常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)酸(suan)性洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)劑(ji)(ji)，它能夠在清除(chu)核酸(suan)成(cheng)分(fen)的(de)同時(shi)(shi)(shi)(shi)較(jiao)好地(di)保留細胞(bao)外基質成(cheng)分(fen)。而(er)(er)醋酸(suan)則(ze)會溶(rong)解膠原(yuan)成(cheng)分(fen)，但對(dui)(dui)gag保留較(jiao)為(wei)完整。另(ling)外，堿(jian)(jian)(jian)性洗(xi)(xi)(xi)劑(ji)(ji)(氫(qing)氧(yang)化鈣、氫(qing)氧(yang)化鈉、硫化鈉等(deng)(deng))作(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)強烈，對(dui)(dui)細胞(bao)和(he)(he)(he)ecm破(po)(po)(po)(po)壞(huai)較(jiao)大(da)，多(duo)(duo)被用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)在真(zhen)皮組織早(zao)期的(de)毛發脫(tuo)(tuo)除(chu)上。高(gao)滲(shen)(shen)-低(di)滲(shen)(shen)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)原(yuan)理(li)主(zhu)要是(shi)利用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)高(gao)滲(shen)(shen)鹽(yan)溶(rong)液(ye)溶(rong)解dna，而(er)(er)低(di)滲(shen)(shen)液(ye)使細胞(bao)溶(rong)解，從而(er)(er)清除(chu)細胞(bao)成(cheng)分(fen)。在實際應(ying)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)中(zhong)，經常將組織在高(gao)滲(shen)(shen)-低(di)滲(shen)(shen)液(ye)中(zhong)交替浸泡而(er)(er)達到洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)目(mu)(mu)的(de)。洗(xi)(xi)(xi)滌(di)劑(ji)(ji)是(shi)指非離子(zi)、離子(zi)和(he)(he)(he)兩(liang)性離子(zi)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)劑(ji)(ji)，包括triton-x100、十二烷基磺酸(suan)鈉(sodiumdodecylsulfonate，sds)等(deng)(deng)。其作(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)溫(wen)和(he)(he)(he)，易(yi)于(yu)(yu)操(cao)作(zuo)，是(shi)目(mu)(mu)前針(zhen)對(dui)(dui)心臟(zang)最常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)法(fa)。tritonx100是(shi)代表(biao)性非離子(zi)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)劑(ji)(ji)，它能有(you)(you)效地(di)分(fen)離細胞(bao)膜-膜連接(jie)和(he)(he)(he)膜-蛋(dan)(dan)白連接(jie)，而(er)(er)對(dui)(dui)蛋(dan)(dan)白-蛋(dan)(dan)白連接(jie)破(po)(po)(po)(po)壞(huai)較(jiao)小(xiao)。實驗中(zhong)應(ying)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)triton-x100洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)差異很大(da)，從幾個小(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)到幾天不等(deng)(deng)，這主(zhu)要是(shi)根據具體的(de)器官組織和(he)(he)(he)聯合(he)(he)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)效果而(er)(er)定，如(ru)果洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)過長(chang)，也會對(dui)(dui)層黏連蛋(dan)(dan)白和(he)(he)(he)gag造成(cheng)破(po)(po)(po)(po)壞(huai)。離子(zi)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)劑(ji)(ji)的(de)代表(biao)是(shi)sds，它對(dui)(dui)細胞(bao)的(de)破(po)(po)(po)(po)壞(huai)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)強于(yu)(yu)triton-x100，更適合(he)(he)洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)較(jiao)為(wei)堅韌的(de)器官。但是(shi)使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)sds洗(xi)(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)必須(xu)要更加嚴(yan)格地(di)控制時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)及濃度，否則(ze)sds容易(yi)破(po)(po)(po)(po)壞(huai)ecm的(de)超微(wei)結構(gou)并使生長(chang)因子(zi)大(da)量(liang)流(liu)失。目(mu)(mu)前心臟(zang)脫(tuo)(tuo)細胞(bao)多(duo)(duo)聯合(he)(he)應(ying)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)sds和(he)(he)(he)triton-x100。兩(liang)性洗(xi)(xi)(xi)滌(di)劑(ji)(ji)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)介(jie)于(yu)(yu)上述二者之間(jian)，常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)試劑(ji)(ji)有(you)(you)chaps、sb-10、sb16等(deng)(deng)，它們主(zhu)要用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)(yu)動(dong)脈(mo)和(he)(he)(he)神經的(de)脫(tuo)(tuo)細胞(bao)過程(cheng)，并且常與triton-x100聯合(he)(he)應(ying)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)。

生物酶(mei)(mei)洗脫(tuo)(tuo)是(shi)利(li)(li)用(yong)(yong)(yong)(yong)酶(mei)(mei)解作用(yong)(yong)(yong)(yong)破壞細(xi)胞膜從而(er)清除(chu)細(xi)胞成(cheng)分的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。常(chang)見的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)試(shi)劑有核(he)酸(suan)酶(mei)(mei)、胰酶(mei)(mei)、膠原(yuan)酶(mei)(mei)、dispase酶(mei)(mei)等。通常(chang)針對不(bu)同(tong)細(xi)胞成(cheng)分使用(yong)(yong)(yong)(yong)對應(ying)的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)能夠使其(qi)(qi)高(gao)效(xiao)(xiao)降解，另(ling)外還可(ke)以清除(chu)不(bu)需要的(de)(de)(de)ecm組(zu)分。然而(er)需要注意的(de)(de)(de)是(shi)，殘(can)留的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)成(cheng)分會降解ecm，甚至引起繼發的(de)(de)(de)免疫(yi)反應(ying)。核(he)酸(suan)酶(mei)(mei)包括dna酶(mei)(mei)和rna酶(mei)(mei)，是(shi)對核(he)苷酸(suan)序列的(de)(de)(de)高(gao)效(xiao)(xiao)酶(mei)(mei)，主(zhu)要用(yong)(yong)(yong)(yong)于組(zu)織溶(rong)解后(hou)核(he)酸(suan)成(cheng)分清除(chu)。胰酶(mei)(mei)是(shi)一種強(qiang)效(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)絲氨酸(suan)蛋白酶(mei)(mei)，對于細(xi)胞和gag破壞效(xiao)(xiao)果(guo)小，但(dan)對膠原(yuan)和彈力蛋白作用(yong)(yong)(yong)(yong)強(qiang)烈，可(ke)用(yong)(yong)(yong)(yong)于洗脫(tuo)(tuo)的(de)(de)(de)初始(shi)階(jie)段，用(yong)(yong)(yong)(yong)來(lai)破壞組(zu)織超(chao)微(wei)結構(gou)，以利(li)(li)于其(qi)(qi)他洗脫(tuo)(tuo)劑的(de)(de)(de)滲入，但(dan)要避免其(qi)(qi)對組(zu)織的(de)(de)(de)過度(du)破壞。膠原(yuan)酶(mei)(mei)可(ke)破壞組(zu)織結構(gou)，只用(yong)(yong)(yong)(yong)于不(bu)需要保留組(zu)織結構(gou)的(de)(de)(de)洗脫(tuo)(tuo)。

物理(li)法(fa)脫(tuo)(tuo)細胞(bao)由于(yu)心(xin)臟屬于(yu)比較柔軟的(de)組織(zhi)器(qi)官，不(bu)(bu)(bu)適于(yu)暴力的(de)脫(tuo)(tuo)細胞(bao)處理(li)方(fang)法(fa)，其組織(zhi)完(wan)整性、脈管(guan)(guan)(guan)結(jie)構(gou)及微構(gou)象易(yi)被(bei)破壞(huai)。單純的(de)tritonx100處理(li)方(fang)式幾乎無(wu)法(fa)對(dui)大鼠(shu)心(xin)臟進行脫(tuo)(tuo)細胞(bao)處理(li)，細胞(bao)結(jie)構(gou)保存相對(dui)良好。利用胰蛋白酶方(fang)法(fa)制(zhi)備的(de)脫(tuo)(tuo)細胞(bao)基質，脈管(guan)(guan)(guan)結(jie)構(gou)很大程(cheng)度上被(bei)破壞(huai)，不(bu)(bu)(bu)利于(yu)組織(zhi)再(zai)生。盡(jin)管(guan)(guan)(guan)脫(tuo)(tuo)細胞(bao)領域不(bu)(bu)(bu)斷取得新的(de)進展，但(dan)是仍舊沒有(you)適用于(yu)心(xin)臟全器(qi)官脫(tuo)(tuo)細胞(bao)的(de)方(fang)法(fa)，以(yi)求盡(jin)可(ke)能去除器(qi)官內駐留細胞(bao)的(de)情況下，減少對(dui)細胞(bao)外各種基質成(cheng)分的(de)影響，從而獲得具(ju)有(you)組織(zhi)特異性、三維超(chao)微結(jie)構(gou)、脈管(guan)(guan)(guan)結(jie)構(gou)和一定生物活(huo)性的(de)良好支架材(cai)料。

技術實現要素：

本發明的(de)(de)目的(de)(de)在(zai)于提供一種(zhong)心臟全器(qi)官脫細胞基質(zhi)的(de)(de)制備方法和(he)應用。

一種心臟全(quan)器官(guan)脫(tuo)細胞基質的(de)制備方法，按照如下步驟(zou)進行(xing)：

(1)首先獲取動(dong)物心臟，并置于含有肝素pbs溶液的玻璃器皿內，-70℃冷凍處理(li)24h備用；

(2)將上述動物心臟放入4℃冰箱中緩慢解凍完全(quan)后，將16g規格的鈍性(xing)針頭插入主(zhu)動脈(mo)，用線繩于心臟根部結(jie)扎系住；

(3)將心臟(zang)接入脫細胞灌(guan)(guan)流(liu)(liu)裝置中(zhong)，首(shou)先利用肝素pbs灌(guan)(guan)流(liu)(liu)5-15min，之(zhi)后灌(guan)(guan)流(liu)(liu)1％sds溶液(ye)10-15h，去離子水沖洗30min后，1％ttiton灌(guan)(guan)流(liu)(liu)15-30min，之(zhi)后利用pbs沖洗，每天換液(ye)4-5次，共清洗72-128h，上述灌(guan)(guan)流(liu)(liu)速(su)度3ml/min；

(4)灌流(liu)后經過鈷6o照(zhao)射滅菌處理。

所述動物為(wei)鼠，人，羊，馬，牛，駱駝(tuo)或豬(zhu)。

與現(xian)有(you)(you)技術相比(bi)，本(ben)(ben)發明(ming)具有(you)(you)如(ru)下有(you)(you)益效果：本(ben)(ben)發明(ming)設計(ji)合理(li)的(de)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)全(quan)器官(guan)脫(tuo)(tuo)(tuo)細(xi)胞體(ti)系(xi)，并對現(xian)有(you)(you)的(de)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)全(quan)器官(guan)脫(tuo)(tuo)(tuo)細(xi)胞方(fang)法進行(xing)改進和優(you)化，結(jie)合sds洗滌劑、tritonx100等按照不同(tong)洗脫(tuo)(tuo)(tuo)順序和時(shi)間配(pei)比(bi)進行(xing)脫(tuo)(tuo)(tuo)細(xi)胞處理(li)，以(yi)(yi)提高灌流液在(zai)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)器官(guan)中(zhong)的(de)洗脫(tuo)(tuo)(tuo)效果，為后期脫(tuo)(tuo)(tuo)細(xi)胞基質的(de)評價以(yi)(yi)及組織工程再造(zao)中(zhong)的(de)應用奠(dian)定基礎。由本(ben)(ben)方(fang)法制備而成的(de)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)全(quan)器官(guan)脫(tuo)(tuo)(tuo)細(xi)胞基質可以(yi)(yi)在(zai)去除心(xin)臟(zang)(zang)(zang)組織原有(you)(you)駐留細(xi)胞的(de)條件下，保留了心(xin)臟(zang)(zang)(zang)原有(you)(you)的(de)二級、三級脈(mo)管結(jie)構(gou)(gou)，超微構(gou)(gou)象以(yi)(yi)及細(xi)胞外基質組分。

附圖說明

圖(tu)1是大(da)鼠心臟灌流脫細胞(bao)過(guo)程變化圖(tu)。

圖2是心臟全器官脫細胞基(ji)質與天然心臟對比電(dian)鏡圖。

圖3是本(ben)發(fa)明(ming)心臟全器官脫細(xi)胞基質(zhi)的細(xi)胞外基質(zhi)檢(jian)測圖。

具體實施方式

下(xia)面結合(he)附圖(tu)，對本發明的(de)具體實施方(fang)式進(jin)行詳細描述(shu)，但應當理解本發明的(de)保護范(fan)圍并不受具體實施方(fang)式的(de)限制。

一(yi)種心臟全器官(guan)脫細胞基質(zhi)的制(zhi)備方(fang)法，按照如下步驟進行：

(1)首先獲(huo)取(qu)大(da)鼠心臟(zang)，置于含肝(gan)素pbs溶液的玻璃器皿內，-70℃冷凍處(chu)理(li)24h備用(yong)；

(2)將上(shang)述大鼠心臟(zang)(zang)放入4℃冰箱(xiang)中緩慢解凍完全后，將16g規格的(de)鈍性(xing)針頭插入主動脈，用線繩于心臟(zang)(zang)根(gen)部(bu)結扎系住(zhu)；

(3)將心(xin)臟接入脫細胞灌(guan)(guan)流裝置中，首先(xian)利用(yong)肝(gan)素pbs灌(guan)(guan)流5min，之(zhi)后(hou)灌(guan)(guan)流1％sds溶液10h，去離(li)子水沖洗30min后(hou)，1％ttiton灌(guan)(guan)流15min，之(zhi)后(hou)利用(yong)pbs沖洗，每天(tian)換(huan)液4-5次，共清洗72h，灌(guan)(guan)流速度3ml/min；

(4)灌流后經過鈷(gu)6o照射(she)滅菌(jun)處理。(輻(fu)射(she)強度10kgy，1-10min)。

不同(tong)灌流(liu)階段的(de)大(da)鼠心臟(zang)(zang)如圖1-3所示，經過1％sds溶液灌流(liu)，1％ttiton灌流(liu)，pbs沖洗(xi)的(de)處理步驟，心臟(zang)(zang)全器官脫細(xi)胞(bao)基質可以在去除心臟(zang)(zang)組織原有(you)(you)駐留細(xi)胞(bao)的(de)條件下，保留心臟(zang)(zang)原有(you)(you)的(de)二級、三級脈管(guan)結(jie)構(gou)，以及細(xi)胞(bao)外基質(組分膠原、可溶性生長因子、糖(tang)胺聚糖(tang)等)。

以上公開的(de)(de)僅為(wei)本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)具(ju)體(ti)實施例，但是，本(ben)(ben)發(fa)明并非局限于此，任何(he)本(ben)(ben)領域(yu)的(de)(de)技術(shu)人員能思之的(de)(de)變(bian)化(hua)都應落入(ru)本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)保護范圍。