專利名稱：磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種多孔磷酸鈣陶瓷和膠原蛋白復合的生物陶瓷材料及其制備方法，屬于生物醫學材料領域。
背景技術：
憐酸I丐生物陶瓷材料(Calcium Phosphate Bioceramics, CaP),由于其具有和人體骨組織相似的無機成分，以及兼備多種優良的生物學特性而被廣泛用作骨修復材料。常見的磷酸I丐系生物陶瓷材料包括輕基磷灰石(Hydroxyapatite, ΗΑ)、β相磷酸三隹丐(beta-Tricalcium phosphate, β -TCP)以及它們的復合物雙相憐酸I丐陶瓷(Biphasiccalcium phosphate, BCP)等。已有研究證實,多孔磷酸|丐系生物陶瓷具備眾多骨修復材料所需求的生物學特性，如生物相容性、骨傳導及骨誘導能力、可生物降解吸收等。它們在臨床中以顆粒或小塊體的形式廣泛應用于非承力部位骨缺損的修復填充，然而因其在力學性能方面不能滿足負重骨缺損修復的應用要求，因此此類生物陶瓷材料用于承力部位骨組織的修復仍然是一個亟待解決的難點。在保證磷酸鈣生物陶瓷材料優良生物學性能的基礎上，進一步提高其力學性能，結合生物體內骨組織應力環境，快速誘導新骨形成并最終修復重建缺損部位骨組織，是有望解決承力部位骨缺損修復重建的一條理想途徑。理想的承力骨修復生物材料應同時兼備良好的生物學性能和力學性能。生物學性能主要希望其具有良好的生 物相容性、骨傳導性、骨誘導性和骨生成能力。力學性能包括抗壓、抗彎強度，彈性模量等多個綜合指標能夠最大限度地接近或與天然骨的力學性能相匹配。現有研究認為，材料的組成、界面和微觀孔隙結構對磷酸鈣陶瓷的骨誘導能力具有決定作用。臨床研究證實，盡管大部分磷酸鈣陶瓷表現出優良的生物學特性，能很好地與人體硬組織及軟組織生物相容，但研究結果同時表明致密磷酸鈣陶瓷不能夠有效誘導新骨組織的形成，只有具有多孔結構的磷酸鈣陶瓷才具備骨誘導生成能力。多孔磷酸鈣陶瓷植入生物體內后在其微觀孔隙中能夠吸附/富集新骨生成所需的相關基因和蛋白，同時促進新生毛細血管組織的生成，而早期血管化能夠提供成骨所需的養分條件和輸送代謝產物，利于成骨細胞的分化和增殖，進而誘導新骨組織的生成。因此，微孔結構對磷酸鈣系生物陶瓷材料的骨誘導性和骨生成能力至關重要。基于此，已有相關專利技術(制備多孔結構陶瓷人工骨的方法，專利號CN1903384 ;可控微結構的多孔生物陶瓷、其制備方法及應用，專利號CN1268583C)對磷酸鈣多孔結構的制備和優化進行了報道。顯而易見，由于孔隙結構的介入及磷酸鈣陶瓷自身的脆性特點，勢必會降低此類材料的力學性能，從而制約將此類生物陶瓷材料用作承力骨組織的修復應用。因此有技術報道通過材料復合技術以提高陶瓷材料的力學性能。例如專利CN1935270A報道了一種以羥基磷灰石為基體，透輝石和氧化鋁為增韌補強體的復合生物陶瓷材料及其制備技術，該技術制備的復合生物陶瓷具有比純HA更好的斷裂韌性、抗彎強度等力學性能。天然骨的主要成分包含無機磷酸鈣和有機膠原蛋白，其中無機磷酸鈣以生物礦化的磷灰石為主(Biological apatite),骨頭中含有約60 75質量百分比的生物磷灰石。膠原蛋白(Collagen)是一種天然的聚合物，它是人體皮膚和骨頭的主要有機成分，是骨基質中含量最豐富的蛋白質。膠原蛋白具有優良的生物相容性及低免疫力，適合作為新骨細胞貼附生長的基質，是一種用于骨組織修復的理想材料。最近已有研究致力于開發制備膠原蛋白基或以其作為添加相的生物材料用作骨組織的修復。外國專利WO 93/12736中公開了一種礦化膠原蛋白用作骨組織修復的方法。但其僅適用于非承力部位骨組織創傷修復。基于磷酸鈣系生物陶瓷的特性和缺點，本發明的目的在于提供一種制備磷酸鈣和膠原蛋白復合生物材料的方法。本發明制備的復合材料可提高生物陶瓷的力學性能，并能進一步模擬骨基質的成分，以此類陶瓷作為骨組織修復支架材料，將具有優良的力學性能和誘導組織再生的功能，有望促進承力部位骨組織的修復重建應用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種磷酸鈣和膠原蛋白復合生物材料。本發明是通過以下技術方案來實現的
一種磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料，由多孔磷酸鈣陶瓷與膠原蛋白復合而成。作為優選方式，該復合生物陶瓷以多孔磷酸鈣陶瓷為基體，膠原蛋白為增韌補強相，各原料的質量百分比(wt%)為磷酸鈣陶瓷80% 98%，膠原蛋白2 20%。作為優選方式，所述多孔磷酸鈣陶瓷孔隙結構特征為陶瓷總體孔隙率為60% 95%，大孔孔徑為100 500微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內壁布滿毛細微孔。作為優選方式，所 述多孔磷酸鈣陶瓷采用雙氧水發泡法或微球占位法或注漿法制備，陶瓷材料成分為羥基磷灰石、β相磷酸三鈣或雙相磷酸鈣陶瓷。作為優選方式，所述膠原蛋白為1-型膠原蛋白。作為優選方式，所述膠原蛋白在陶瓷孔隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。本發明的另一目的在于提供一種上述的磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的制備方法，其操作步驟包括
(a)制備互穿貫通多孔磷酸鈣陶瓷制備陶瓷多孔結構胚體，然后經燒結成瓷。(b)灌注配制膠原蛋白溶液，以膠原蛋白溶液浸沒步驟(a)中制備的多孔陶瓷，常溫下進行真空灌注，然后，對產物進行超聲波震蕩攪拌。(C)交聯將灌注膠原蛋白的磷酸鈣陶瓷經物理或化學方法進行交聯，最后對產品進行冷凍干燥。作為優選方式，步驟(a)中所述胚體采用雙氧水發泡法或微球占位法或注漿法制備，所述燒結的溫度為1000 1200°C ;步驟(b)中所述的膠原蛋白溶液濃度為5 20mg/ml，所述真空灌注過程為抽真空至O 10 Pa，保壓I 3小時，所述真空灌注和超聲振蕩過程可根據需要重復進行，所述震蕩攪拌的時間為5 20分鐘；步驟(c)中所述的交聯方法為京尼平交聯(J Mech Behav Biomed, 2012，15:176-189.)、紫外交聯(J BiomedMater Res. 1995，29 (11) : 1373-1379)、輻照交聯(Radiat Res. 1964，22 (4) : 606-621)、戊二醛交聯(J Mater Sc1-Mater M, 1995，6:460-472 )中的一種，所述冷凍干燥的溫度為-60°C -20°C，時間為24 48小時。本發明還提供了一種所述的磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的用途將其用作人體硬組織缺損的修復或骨組織工程用支架材料。特別是將其用于承力部位骨組織創傷修復。本發明的有益效果1、本發明所述的復合材料模擬自然骨基質的成分，既顯著提高了生物陶瓷的力學性能，又促進了其骨組織修復再生功能。在生物醫學領域中具有巨大的應用前景，尤其是用于硬組織缺損的修復和重建，在硬骨缺損部位作為修復填充支架材料，迅速誘導新骨組織的生成，增強骨連接和愈合功能。2、所述復合材料采用已燒結成瓷的多孔磷酸鈣陶瓷作為基體，其大孔之間有微孔相互貫通，大孔內壁布滿毛細微孔，這種結構一方面使復合材料具有優良的骨誘導性和骨生成能力，另一方面有利于容納更多的膠原蛋白，使其進入材料內部，并形成三維網狀結構。3、所述復合材料中膠原蛋白在陶瓷孔隙中相互交聯形成三維膠原蛋白纖維網狀結構，這種結構一方面有利于提高材料的力學性能，提升增韌補強的效果，另一方面與陶瓷基體材料的多孔結構形成鎖合，使兩者的結合更牢固，材料更穩定，同時也有利于細胞其上黏附生長。4、采用1-型膠原蛋白。膠原蛋白是一種多糖蛋白，含有少量的半乳酸和葡萄糖，是細胞外基質的主要成分，同時也是人體中最重要的成分之一。它廣泛存在于人體的皮膚、骨骼、肌肉、軟骨、關節等組織之中。其中在人體硬骨組織中主要存在1-型膠原蛋白，它起著支撐、保護和修復等多重功效。1-型膠原蛋白主要由成纖維細胞或與其來源類似的細胞如成骨細胞合成，它在促進骨細胞增殖、分化，誘導骨組織再生重建方面有著重要的生物功效。5、本發明所述復合材料的制備方法中，通過真空負壓灌注一定粘度的膠原蛋白，實現多孔陶瓷與膠原蛋白的復合，整個工藝為物理復合過程，無化學反應及有機溶劑參與，避免了制備工藝中外摻和有毒、有害物質對生物陶瓷的污染。通過超聲波震蕩及重復灌注有利于提高膠原蛋白填充量，同時使其均勻地吸附填充于陶瓷孔隙之中。交聯過程有利于膠原蛋白形成三維纖維網狀結構。


圖1為本發明的制備工藝流程 圖2為本發明制備的部分產品圖，共3組，每組兩個樣品，從左至右分別為磷酸三鈣/膠原蛋白復合陶瓷、雙相磷酸鈣/膠原蛋白復合陶瓷和羥基磷灰石/膠原蛋白復合陶瓷；圖3為實施例中磷酸鈣/膠原蛋白復合陶瓷材料的SEM形貌圖，其中(a)微純羥基磷灰石多孔陶瓷的SEM形貌圖；(b)為實施例1羥基磷灰石/膠原蛋白復合陶瓷生物材料的SEM形貌圖；(c)為實施例2磷酸三鈣/膠原蛋白復合陶瓷生物材料的SEM形貌圖；(d)為實施例3雙相磷酸鈣/膠原蛋白復合陶瓷生物材料的SEM形貌 圖4為磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的力學性能測試 圖5為雙相磷酸鈣/膠原蛋白復合陶瓷材料體外培養骨髓間充質干細胞(MSCs)激光共聚焦顯微圖片，其中(a)為細胞種植I天；(b)為細胞種植3天；(c)為細胞種植7天；(d)為細胞種植21天。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明工藝作進一步詳述。本發明的制備工藝流程如圖1所示。原材料的準備分為兩方面，其一是適宜孔隙的磷酸鈣陶瓷體的準備，其二是I型膠原蛋白溶液的配制準備。本發明所適用的磷酸鈣陶瓷主要包括下列三類輕基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)、磷酸三|丐(beta-Tricalciumphosphate, β-TCP)、以及雙相憐酸I丐陶瓷(Biphasic calcium phosphate, BCP),涉及的多孔陶瓷體的制作可經由雙氧水發泡法(中國專利CN1903384)、微粒占位法(中國專利CN1268583C)、注漿法(美國專利No. 3090094)或其他方法制備多孔陶瓷胚體，然后經煅燒形成的多孔磷酸鈣陶瓷。本發明實施例使用的陶瓷由雙氧水發泡法制備胚體，陶瓷總體孔隙率為60% 95%，大孔孔徑為100 500微米，大孔之間有微孔相互貫通。本發明適用的膠原蛋白為所有種類膠原蛋白，本發明實施例使用經滅菌、純化、去免疫端氨基酸的第一型小牛牛皮膠原蛋白來示范本發明。復合物陶瓷體中所使用的膠原蛋白含量為5 20%質量百分比，按5 20 mg/ml的濃度來配制使用膠原蛋白溶液。以下所列為本發明的幾個最佳實施例，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。實施例1
以羥基磷灰石粉末為原料，制備5X5X20 _的長方體多孔磷酸鈣陶瓷產品。產品孔隙結構要求整體孔隙率85%±5%、大孔孔徑為400 ±50 μ m、互穿貫通微孔孔徑為80 ±20 μ m。具體步驟如下
1)將經濕法反應制得的羥基磷灰石粉末用標準型號篩子，篩選出直徑為80 160μ m的羥基磷灰石干粉，隨后采用雙氧水發泡法制備出多孔陶瓷胚體，低溫< 100 °C烘干；
2)將陶瓷胚體放入馬弗爐 中燒結，從常溫以5°C/min的速率升溫至1100 °C持續2小時燒結，然后隨爐冷卻。隨后將得到多孔羥基磷灰石陶瓷切割成5X5X20 mm的長方體；
3)將經滅菌、純化、去免疫端氨基酸的1-型小牛牛皮膠原蛋白，以去離子水稀釋并按5mg/ml的濃度配制膠原蛋白溶液；
4)以配制好的膠原蛋白溶液浸沒多孔陶瓷，常溫抽真空至<10 Pa進行灌注，保壓3小時，再經超聲波震蕩攪拌10分鐘,重復抽真空負壓灌注過程一次。5)將灌注膠原蛋白的陶瓷用10 mg/ml的京尼平交聯48小時，再以_20 °C溫度冷凍干燥24小時。所得的羥基磷灰石/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的掃描電鏡圖片如圖3所示，經萬能材料試驗機測得其最大抗壓強度為8. 7 MPa (測試方法參見GB/T 1964-1996)，較純羥基磷灰石多孔生物陶瓷材料提升3.1倍。實施例2
以多孔β-磷酸三鈣陶瓷為基體，制備磷酸三鈣/膠原蛋白(TCP/Collagen)復合陶瓷材料。陶瓷整體孔隙率85%±5%、大孔孔徑為400±50 μ m、互穿貫通微孔孔徑為80±20 μ m,其余產品制備工藝及步驟與實施例1相同。所得的磷酸三鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的掃描電鏡圖片如圖3所示，經萬能材料試驗機測得其最大抗壓強度為5. 4 MPa，較復合膠原蛋白前的多孔β -磷酸三鈣陶瓷材料的力學性能提升約2. 9倍，比實施例1中羥基磷灰石/膠原蛋白(HA/Collagen)復合陶瓷的抗壓強度低3. 8 MPa，這是因為純磷酸三鈣陶瓷本身力學性能就比純羥基磷灰石陶瓷差。實施例3
以多孔雙相磷酸鈣陶瓷為基體，制備雙相磷酸鈣/膠原蛋白(BCP/Collagen)復合陶瓷材料。陶瓷整體孔隙率85%±5%、大孔孔徑為400±50 μ m、互穿貫通微孔孔徑為80±20 μ m,其余產品制備工藝及步驟與實施例1相同。所得的雙相磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的掃描電鏡圖片如圖3所示，經萬能材料試驗機測得其最大抗壓強度為6. 7 MPa，較復合膠原蛋白前的多孔雙相磷酸鈣陶瓷材料的力學性能提升約3. O倍，比實施例1中羥基磷灰石/膠原蛋白(HA/Collagen)復合陶瓷的抗壓強度低，但比實施例2中磷酸三鈣/膠原蛋白(TCP/Collagen)復合陶瓷的抗壓強度高，這是因為純磷酸鈣陶瓷的力學性能在相同條件下，其機械強度排序為HA > BCP > TCP。實施例4
其它條件及工藝同實施例1，不同之處在于采用不同孔隙結構的羥基磷灰石陶瓷為基體進行膠原蛋白灌注復合，其陶瓷孔隙率95%±5%、大孔孔徑為500±100μπι、互穿貫通微孔孔徑為100±20μπι。所得的羥基磷灰石/膠原蛋白復合生物陶瓷材料經萬能材料試驗機測得最大其抗壓強度為8. 2 MPa，較復合膠原蛋白前的羥基磷灰石陶瓷材料的力學性能提升約2. 9倍，但較實施例1中所得的羥基磷灰石/膠原蛋白復合陶瓷的抗壓強度低O. 5MPa,該結果說明磷酸鈣陶瓷的多孔骨架結構在復合材料的力學性能方面具有重要作用。盡管陶瓷整體孔隙率和孔徑的增大，促進了復合材料中膠原蛋白含量的增加，因其孔隙率與孔徑增加的同時，犧牲了材料本身的力學強度，因而最終復合后的材料的力學性能較實施例I有所下降。

實施例5
其它條件及工藝同實施例1，不同之處在于采用不同濃度的膠原蛋白進行灌注復合，其膠原蛋白濃度為20 mg/ml，并經京尼平交聯72小時。所得的羥基磷灰石/膠原蛋白復合生物陶瓷材料，經萬能材料試驗機測得其最大抗壓強度為9.1 MPa，較為復合膠原蛋白前陶瓷材料的力學性能提升約3. 3倍，該結果說明磷酸鈣陶瓷孔隙結構中復合較多的膠原蛋白有利于材料最終力學性能的提升。實施例6
將實施例3制備的雙相磷酸鈣/膠原蛋白復合陶瓷材料滅菌后與骨髓間充質干細胞(MSCs)在體外共培養3周，分別在培養I天、3天、7天和21天時，采用二乙酸熒光素/碘化丙啶(FDA/PI)對細胞進行染色，然后采用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，結果顯示(如圖5所示)，細胞貼附于陶瓷/膠原內壁生長，在該材料上分化、增殖明顯。材料具有誘導骨組織再生和增快骨缺損修補重建的功能。以本發明的方法，制備出的磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料，大為提升了純磷酸鈣多孔陶瓷材料的力學性能。經交聯后的膠原蛋白，在陶瓷孔隙內呈三維的膠原蛋白纖維網狀結構，賦予材料足夠的機械強度和韌度，同時通過復合膠原蛋白模擬骨基質的成分，使材料具有較好的生物相容性和生物活性。以上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料，其特征在于它是由多孔磷酸鈣陶瓷與膠原蛋白復合而成。
2.根據權利要求1所述的復合生物陶瓷材料，其特征在于，各原料的質量百分比(wt%)為磷酸鈣陶瓷80% 98%，膠原蛋白2 20%。
3.根據權利要求1所述的復合生物陶瓷材料，其特征在于，所述多孔磷酸鈣陶瓷孔隙結構特征為陶瓷總體孔隙率為60% 95%，大孔孔徑為100 500微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內壁布滿毛細微孔。
4.根據權利要求1所述的復合生物陶瓷材料，其特征在于，所述多孔磷酸鈣陶瓷采用雙氧水發泡法或微球占位法或注漿法制備，陶瓷材料成分為羥基磷灰石、β相磷酸三鈣或雙相磷酸鈣陶瓷。
5.根據權利要求1所述的復合生物陶瓷材料，其特征在于，所述膠原蛋白在陶瓷孔隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。
6.根據權利要求1所述的復合生物陶瓷材料，其特征在于，所述膠原蛋白為1-型膠原蛋白。
7.—種如權利要求1所述的磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的制備方法，其特征在于，其操作步驟包括 Ca)制備互穿貫通多孔磷酸鈣陶瓷制備陶瓷多孔結構胚體，然后經燒結成瓷。
(b)灌注配制膠原蛋白溶液，以膠原蛋白溶液浸沒步驟(a)中制備的多孔陶瓷，常溫下進行真空灌注，然后，對產物進行超聲波震蕩攪拌。
(C)交聯將灌注膠原蛋白的磷酸鈣陶瓷經物理或化學方法進行交聯，最后對產品進行冷凍干燥。
8.根據權利要求7所述的磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的制備方法，其特征在于，步驟(a)中所述胚體采用雙氧水發泡法或微球占位法或注漿法制備，所述燒結的溫度為1000 1200°C;步驟(b)中所述的膠原蛋白溶液濃度為5 20 mg/ml，所述真空灌注過程為抽真空至O 10 Pa，保壓I 3小時，所述真空灌注和超聲振蕩過程至少進行一次，所述震蕩攪拌的時間為5 20分鐘；步驟(c)中所述的交聯方法為京尼平交聯、紫外交聯、輻照交聯、戊二醛交聯中的一種，所述冷凍干燥的溫度為_60°C _20°C，時間為24 48小時。
9.一種如權利要求1所述的磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的用途，其特征在于，將其用作人體硬組織缺損的修復或骨組織工程用支架材料。
10.根據權利要求9所述的磷酸鈣/膠原蛋白復合生物陶瓷材料的用途，其特征在于，將其用于承力部位骨組織創傷修復。
全文摘要
本發明涉及一種磷酸鈣陶瓷(CaP)與膠原蛋白(Collagen)復合的生物活性陶瓷材料及其制備工藝。該復合生物陶瓷以多孔磷酸鈣陶瓷為基體，I-型膠原蛋白為增韌補強相，經真空負壓灌注交聯而成。其工藝過程如下首先制備一類互穿貫通的多孔磷酸鈣陶瓷，孔隙率60%～95%。將多孔磷酸鈣陶瓷浸沒于5～20mg/ml濃度的膠原蛋白溶液中，常溫抽真空至0～10Pa進行灌注，保壓1～3小時后，經超聲波震蕩。真空負壓灌注過程可根據需要重復進行。灌注膠原蛋白的磷酸鈣陶瓷經交聯后，再冷凍干燥制得復合生物陶瓷。本發明制備的生物陶瓷具有良好的生物相容性和生物活性，同時具有比純磷酸鈣陶瓷材料更好的力學強度，可用作人工骨以及骨組織工程支架材料，在骨科臨床上具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61L27/42GK103055352SQ20131002210
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者周長春, 樊渝江, 葉興江, 朱向東, 張興棟 申請人:四川大學