Dickkopf-3在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種Dickkopf-3（DKK3）在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用，屬于基因的功能與應用領域。本發明以ApoE-/-小鼠及DKK3-/-ApoE-/-小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導獲得動脈粥樣硬化模型，結果表明與ApoE-/-小鼠對比，DKK3基因缺陷顯著減少了主動脈的斑塊面積，增強主動脈竇斑塊的穩定性，顯著減輕了炎癥反應。這表明DKK3在動脈粥樣硬化中的功能主要體現為促進主動脈斑塊形成，特別是促進動脈粥樣硬化。針對DKK3的上述功能，DKK3可作為藥物靶標用于篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，DKK3的抑制劑可用于制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。
【專利說明】Dickkopf-3在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明屬于基因的功能與應用領域，具體涉及一種Dickkopf-3 (DKK3)在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用，具體是DKK3在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中應用。

【背景技術】
心腦血管疾病在許多發達國家中是主要致死性病因，在我國的發病率和致死率也逐年升高。心腦血管疾病的基礎是動脈粥樣硬化(Atheosclersisis, AS),動脈粥樣硬化可使動脈管壁增厚、變硬、管腔狹窄，導致很多心腦血管事件發生。而動脈粥樣硬化不穩定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動脈急性狹窄和閉塞是導致急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0003]動脈粥樣硬化是多種遺傳基因、危險因素及免疫機制共同參與的一種慢性炎癥性疾病，局部和全身的炎癥免疫反應在動脈粥樣硬化發生發展過程中起著重要作用，固有免疫和適應性免疫共同參與調節動脈粥樣硬化病變，病理上表現為大、中動脈多處斑塊形成，好發于血液分流、動脈彎曲及動脈分支等區域，其病變特征是血中脂質在動脈內膜沉積，弓丨起內膜灶性纖維性增厚，病灶深部為由壞死組織和細胞外脂質池形成的粥樣物質。動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細胞，其中以巨噬細胞和T細胞最為常見，此外還有少量的樹突狀細胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)和肥大細胞(mast cell)等,偶有B淋巴細胞。
[0004]動脈粥樣硬化最早期肉眼可見的損傷是脂質條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細胞源性泡沫細胞構成。血液循環中的單核細胞在動脈易損部位黏附到活性內皮細胞，啟動了脂質條紋的形成，黏附的單核細胞隨后受局部產生的化學趨附分子的吸引遷移到內膜下，并進一步分化為巨噬細胞。大量膽固醇脂在巨噬細胞內積聚，形成泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程。動脈粥樣硬化的發生是多因素共同作用的結果，目前已發現的動脈粥樣硬化危險性因素很多，但相關針對治療及控制效果均不理想，降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。
[0005]Wnt蛋白是一組富含半胱氨酸的糖基化蛋白，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及控制細胞的定位等過程。周細胞(pericytes)是主要的內皮支持細胞，緊靠EC，它有調控EC的成熟、穩定微血管壁及促進新生血管和血管出芽等功能。研究表明fct信號抑制周細胞向脂肪系分化而促進其向軟骨系分化，提示fct信號通路可能與AS的發生有關【I】。在載脂蛋白E (ApoE)基因缺陷小鼠和接受動脈內膜切除術的病人的頸動脈內膜下發現在巨噬細胞積累的區域有大量Wnt5a，表明Wnt5a在人類和小鼠AS病變中有表達【2】。DKK3是DKK家族成員之一。DKK家族由5個成員組成:DKK1、DKK2、DKK3、DKK4以及DKK3相關蛋白soggy (sgy)，是Wnt信號途徑的拮抗因子，通過與其相應的受體結合來調控細胞內的信號傳導。DKK1-4均含有兩個富含半胱氨酸區域，區域中含有家族成員間高度保守的10個半胱氨酸殘基，此區域是DKK蛋白的標志性結構【3】。Dickkopf-3 (DKK3)是Dickkopf家族的一種分泌蛋白，有研究表明DKK3在調控組織的發育、凋亡、增殖及免疫方面發揮著重要的作用。DKK3可廣泛表達在不同的組織，包括心臟組織，已被證實在心臟組織中，DKK3通過調節ASKl-JNK/p38信號通路，從而保護病理性心肌肥厚【4】。基于上述研究基礎，我們認為DKK3在動脈粥樣硬化形成的特征性病理生理過程中可能扮演著重要角色，但其在動脈粥樣硬化形成的特征性病理生理過程中的生物學功能和可能的作用機制尚未闡明。
[0006]小鼠和基因工程小鼠資源是目前疾病機制研究、基因功能研究、藥物創制等領域最重要的動物模型之一，也是這些領域創新研究的必須條件。利用基因工程小鼠針對動脈粥樣硬化病理過程中的各個分子環節進行研究，對闡明動脈粥樣硬化發生發展過程中的分子機制，尋找動脈粥樣硬化治療的分子靶點具有重要的意義。
[0007]【參考文獻】
1、 Kirton JP,Crofts NJ, George SJ,et al.ffnt/ beta catenin signalingstimulates chondrogenic and inhibits adipogenic differentiat1n of pericytes:potential relevance to vascular disease ? Circ Res, 2007; 101(6): 581-9.2>Christman MA 2nd,Goetz DJ,Dickerson E, et al.Wnt5a is expressed in murineand human atherosclerotic les1ns.Am J Phys1l Heart Circ Phys1l, 2008;294(6): 2864-70.3、Niehrs C.Funct1n and b1logical roles of the Dickkopf family of Wntmodulators.0ncogene.2006; 25(57): 7469-81.4、ZhangY, Liu Y, Zhu XH, et al.Dickkopf-3 attenuates pressureoverload-1nduced cardiac remodelling.Card1vasc Res.2014; 102(1): 35-45。


【發明內容】

[0008]本發明的目的在于確定DKK3的表達和動脈粥樣硬化的相互關系，提供一個用于預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的靶基因DKK3的新用途。
[0009]本發明的目的通過下述技術方案實現:
本發明確定的DKK3的表達和動脈粥樣硬化的關系如下:
1.DKK3基因敲除顯著減少了動脈粥樣硬化的斑塊面積
本發明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與DKK3/ApoE雙基因敲除(DKD+ApoE+)小鼠為實驗對象，分別通過低脂飼料和高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)。結果表明ApoE+和DKK3+APOE+小鼠通過低脂飼料飲食，主動脈樹有少量斑塊形成；通過高脂飼料飲食后，斑塊面積顯著增加，DKK3+APOE+小鼠的主動脈樹、主動脈竇的斑塊面積均顯著小于ApoE+小鼠(圖1-2)。
[0010]2.DKK3基因敲除顯著增強主動脈竇斑塊的穩定性
本發明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與DKK3/ApoE雙基因敲除(DKD+ApoE+)小鼠為實驗對象，通過高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對主動脈竇斑塊的穩定性進行研究。結果表明DKK3基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量，增強了主動脈竇斑塊的穩定性(圖3)。
[0011]3.DKK3基因敲除顯著減輕了炎癥反應
本發明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與DKK3/ApoE雙基因敲除(DKD+ApoE+)小鼠為實驗對象，通過高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對主動脈竇斑塊的炎癥因子的表達進行研究。結果表明DKK3基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊的ICAM-1和IL-6等促炎因子，升高了 IL-1O等抑炎因子的表達水平(圖4)。
[0012]由以上結果可知發生動脈粥樣硬化時，DKK3基因缺陷減少了斑塊面積，增強主動脈竇斑塊的穩定性，顯著減輕了炎癥反應。因此DKK3具有促進動脈粥樣硬化發生發展的作用，為研究防治動脈粥樣硬化的新靶點和新策略提供了理論依據和臨床基礎。
[0013]因此，DKK3基因可作為藥物靶點，構建DKK3基因過表達的體外細胞模型或動物模型，用于篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物；DKK3基因也可作為基因治療中的靶基因，設計并制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物和/或生物學試劑，通過基因工程技術達到預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的目的。例如以DKK3為靶基因，設計可干擾DKK3表達的雙鏈siRNA，通過化學方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使DKK3基因沉默來治療動脈粥樣硬化；還可以設計并構建DKK3的突變體，注射后進入細胞，競爭DKK3原形的作用底物，從而抑制DKK3的功能，起到治療目的；此外，還可以以DKK3為靶點設計小分子化合物抑制劑，利用DKK3基因過表達的體外細胞模型或動物模型，通過篩選，發現其中能夠特異性抑制DKK3的分子，從而為動脈粥樣硬化的治療提供新的治療性分子。
[0014]針對DKK3的上述功能，提供DKK3作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
[0015]針對DKK3的上述功能，提供DKK3的抑制劑在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
[0016]一種預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，包含DKK3的抑制劑。
[0017]所述的DKK3的抑制劑優選為DKK3基因的siRNA、DKK3基因的RNA干擾載體，DKK3的抗體及其他能夠抑制DKK3表達的抑制劑中的一種。
[0018]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
1.本發明發現DKK3基因的新功能，即DKK3能夠促進動脈粥樣硬化的作用。
[0019]2.基于DKK3促進動脈粥樣硬化的功能，為研制動脈粥樣硬化的藥物提供靶標。
[0020]3.DKK3的抑制劑可用于制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1是ApoE+和DKK3+APOE+小鼠的主動脈樹油紅O染色及斑塊面積統計圖，結果表明DKK3基因敲除顯著減少了主動脈樹的斑塊面積(NS:無顯著性差異)。
[0022]圖2是ApoE+和DKD+ApoE+小鼠主動脈竇HE染色及斑塊面積統計柱狀圖，結果表明DKK3基因敲除顯著減少了主動脈竇的斑塊面積(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+組)。
[0023]圖3是ApoE+和DKD+ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內壞死中心、膠原成分、巨噬細胞及平滑肌細胞含量染色及結果統計柱狀圖，結果表明DKK3基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 組)。
[0024]圖4是ApoE+和DKI^—ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎癥因子的表達水平免疫熒光染色及結果統計柱狀圖，結果表明DKK3基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊的促炎因子ICAM-1和IL-6的表達水平，升高了抗炎因子IL-1O的表達水平(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 組)。

【具體實施方式】
[0025]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0026]實驗用動物及飼養
實驗動物種屬，性別，周齡及來源=ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與DKK3/ApoE雙基因敲除(DKK3+AP0E+)小鼠，雄性，8周齡，體重19_25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE+，購自Jackson Laboratory,貨號002052) ；DKK3 7 ApoE 7小鼠由DKK3基因敲除小鼠(購自日本RIKEN公司，貨號:RBRC02847)和ApoE基因敲除小鼠雜交得到。
[0027]實驗動物飼料配方:高脂飼料(HFD，購自北京華阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，熱量百分比:蛋白質15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%);低脂飼料(NC，購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B):熱量百分比:蛋白質20%，碳水化合物70%，脂肪10%。
[0028]動物飼養及環境條件:所有的實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級動物房(許可證號=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2°C，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進食。
[0029]實施例1小鼠動脈粥樣硬化模型(AS)獲得
1.實驗動物分組:選用8周齡，體重19-25g，雄性，ApoE+小鼠和DKD+ApoE+小鼠，分別給予高脂飼料(Western Diets, HFD)和低脂飼料(Normal chow, NC)飼養,ApoE+ HFD組，ApoE+ NC 組，DKK3+AP0E+ HFD 組，DKD+ApoE+ NC 組共 4 個組別，每組各 20 只。
[0030]2.動脈粥樣硬化模型通過高脂飼料誘導操作流程:
采用ApoE+小鼠和DKK3+APOE+小鼠，建立AS模型，進行表型相關分析，明確DKK3基因對動脈粥樣硬化疾病發揮的作用。小鼠從8周齡開始，HFD組全程高脂飼料喂養28周處死并收集樣本，NC組全程低脂飼料喂養28周處死并收集樣本。
[0031 ] 實施例2 AS模型小鼠斑塊面積測定 1.小鼠終末組織取材
小鼠喂養高脂或低脂飼料直至28周時，稱重，用3%戊巴比妥鈉，90mg/kg麻醉小鼠，用針頭固定于取材板，用紗布濕潤小鼠胸腹部皮膚，用眼科剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，把輸液器的針頭刺進左心室，用50mL注射器緩慢推注10-15mL PBS緩沖液，待右心耳流出液清亮，換上4%多聚甲醛繼續推注10-15mL。灌流結束后，清除胸腹腔臟器，僅保留心臟。將小鼠置于顯微鏡下，分離主動脈弓周圍筋膜、脂肪組織，在升主動脈起始部剪下心臟，在胸主動脈中部剪斷，并在頸總和鎖骨下約3mm處剪斷，把主動脈弓放入上述EP管中。
[0032]2.主動脈樹斑塊面積測定
主動脈樹置于4%多聚甲醛中隔夜固定一純水漂洗30min — 60%異丙醇處理10 min —油紅O染液(公司sigma，貨號00625)染色60min — 60%異丙醇漂洗IminX 3次至背景干凈一解剖鏡下去除殘余外壁脂肪一將染色好的動脈平鋪于黑色解剖蠟板上，染色后用數碼相機拍照，并使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行斑塊面積定量測定(油紅O原液=0.5克油紅0+100毫升100%異丙醇，油紅O染液(工作液)=V (油紅O原液)/ V (H2O)=3/2)。
[0033]主動脈樹斑塊面積(％)=斑塊總面積/主動脈樹總面積*100%。
[0034]3.病理組織處理 3.1石蠟標本制備
4%多聚甲醛中隔夜固定后，將主動脈弓用濾紙小心包好，以防從包埋框間隙中漏出。流水沖洗30min后放入脫水機，30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75%乙醇15min — 85%乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 二甲苯 15min —二甲苯15min —石臘30min —石臘30min。主動脈弓脫水完成后,從脫水機拿出，主動脈弓平躺于石蠟中。
[0035]3.2主動脈組織切片
使用切片機對主動脈竇石蠟標本切片(切片厚度5 μ m)。
[0036]4.主動脈竇斑塊面積測定
蘇木素伊紅染色(HE染色):取主動脈竇石蠟白片65°C烘烤30分鐘一二甲苯5分鐘X 3次一100%乙醇I分鐘一95%乙醇I分鐘一70%乙醇I分鐘一純水漂洗(以玻片上不掛有水珠為標準)一甩盡載玻片上的水分，蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)浸染5分鐘一自來水漂洗(去除玻片上蘇木素的浮色)一1%鹽酸乙醇1-3秒一自來水漂洗(去除玻片上鹽酸乙醇)一Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水10mDl分鐘一自來水浸洗(去除玻片上的Scott液)一甩盡在玻片上的水分，伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)染色10秒鐘一純水漂洗(去除玻片上伊紅的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分鐘，3次一趁二甲苯未干時封片(以切片無氣泡為原則)一通風櫥內吹干，顯微鏡拍照。
[0037]HE染色圖片統計:直接用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈主動脈竇斑塊面積。
[0038]通過主動脈樹油紅O染色可大體評估整條血管上動脈粥樣硬化斑塊形成的多少、分布情況及斑塊面積的大小。圖1是小鼠AS模型后主動脈樹油紅O染色結果圖，頭臂干和主動脈竇是動脈粥樣硬化斑塊最明顯的部位，ApoE+和DKK3+APOE+小鼠通過低脂飼料飲食，主動脈樹就有少量斑塊形成，且DKK3+APOE+小鼠的斑塊面積和ApoE+小鼠無顯著差異；通過高脂飲食后，斑塊含量顯著增加，DKK3+APOE+小鼠的主動脈樹斑塊面積顯著小于ApoE+小鼠。圖2是小鼠AS模型后主動脈竇HE染色結果圖，結果表明經高脂飲食后DKK3+APOE+小鼠的主動脈竇的斑塊面積顯著小于ApoE+小鼠。以上結果表明DKK3基因敲除顯著降低了動脈粥樣硬化的斑塊面積。
[0039]實施例3 AS模型小鼠斑塊穩定性的測定 1.主動脈竇壞死中心的面積大小測定
蘇木素伊紅染色(HE染色)，方法同實施例2.4，選取含膽固醇結晶、無細胞核纖維結構的組織顯微鏡拍照。
[0040]壞死中心的面積測定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈壞死中心面積。
[0041]2.主動脈竇膠原成分含量測定:
天狼星紅(PSR)染色，主要步驟為:取主動脈竇石蠟白片55°C烘烤30min—二甲苯2min, 3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —流水沖洗1min —雙蒸水Imin —質量分數0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上,濕盒中染色90min —去除殘液一0.0lN鹽酸4s — 70%酒精I次一90%酒精I次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0042]膠原比例測定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈紅色膠原面積,膠原比例(％)=膠原面積/斑塊面積*100%。
[0043]3.巨噬細胞及平滑肌細胞標志物的表達測定
免疫熒光染色檢測主動脈竇巨噬細胞標志物⑶68、平滑肌細胞標志物SMA (SmoothMuscle Actin)的表達。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec),SMA(ab5694; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG(Al1077 ；Invitrogen), Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (Al1008 ；Invitrogen)。
[0044]主要步驟為:
I)烤片:將主動脈竇石蠟白片置于烤箱中30min以上。
[0045]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0046]3)水合:100% 乙醇 5minX 2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20 浸洗 5minX 2次。
[0047]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(高壓修復):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復工作液于修復盒中，放入高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于修復盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，開始計時5min后，取出修復盒；室溫放置20min，自然冷卻后取出切片。
[0048]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0049]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0050]7)棄封閉液,滴加適當比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復溫30min,棄去一抗，PBS 洗 1minX 3 次。
[0051]8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0052]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0053]10)熒光鏡下觀察，拍照。
[0054]突光定量統計:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對陽性細胞計數測定，CD68/SMA (%)=陽性細胞數/斑塊面積*100%。
[0055]巨噬細胞是斑塊內最重要的細胞成分，它主要有血液循環單核細胞進入內皮下后分化而來，單核/巨噬細胞可分泌多種粘附、趨化因子如細胞黏附分子(ICAM-1)、單核細胞趨化和激活因子(MCP-1)等，增進斑塊內細胞的進入，此外巨噬細胞還可分泌多種基質金屬蛋白酶(MMPs)，降低斑塊內膠原面積，從而破壞斑塊的穩定性；平滑肌細胞可分泌多種細胞基質，是動脈粥樣硬化斑塊內分泌膠原的細胞源，主要作用是修復被破壞的細胞基質成分從而起到保護作用；膠原成分是斑塊內最重要的細胞外基質，也是纖維帽的主要成分，具有抗血流沖擊防止斑塊破裂的作用，也是維護斑塊穩定性的重要評估指標。
[0056]圖3是ApoE+小鼠和DKD+ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內含物的分析結果圖。主動脈竇HE染色可見DKK3+AP0E+小鼠的壞死中心面積明顯小于ApoE+小鼠；PSR染色結果表明高脂飲食后的模型，DKK3+AP0E+組小鼠的膠原比例明顯高于ApoE+小鼠；免疫熒光發觀察巨噬細胞標志物⑶68在DKK3+AP0E+小鼠斑塊內的表達量則顯著低于ApoE+小鼠；平滑肌細胞標志物SMA在DKK3+AP0E+小鼠斑塊內的表達量明顯高于ApoE+小鼠。以上結果表明DKK3基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量；因此DKK3基因敲除可以增強主動脈竇斑塊的穩定性(圖3)。
[0057]實施例4 AS模型小鼠斑塊內炎癥因子表達的測定
免疫熒光染色檢測主動脈竇ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎癥因子的表達。所需一抗信息:ICAM-1CAF796 ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-6(AF-406_NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-1O (AF-217-NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 donkeyant1-goat IgG (A11057 ;Invitrogen)。
[0058]主要步驟為:參見實施例3.3。
[0059]熒光定量統計:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對陽性細胞進行吸光度(1D)測定。
[0060]炎癥反應是導致動脈粥樣硬化斑塊破裂的主要因素之一。炎性細胞分泌大量細胞因子如白細胞介素6 (IL-6)，白細胞介素10 (IL-1O)等可導致內皮細胞的活化、平滑肌細胞的增生凋亡及粥樣病變的進展。受損的內皮細胞和單核/巨噬細胞分泌的粘附、趨化因子是介導炎癥細胞向動脈粥樣硬化斑塊聚集的關鍵因子。通過免疫熒光染色觀察ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎癥因子的表達變化，結果表明DKK3基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊內促炎因子ICAM-1、IL-6的表達水平，升高了 IL-1O抗炎癥因子的表達水平(圖4)。
[0061 ] 上述實施例結果顯示，ApoE+小鼠及DKK3+APOE+小鼠在高脂飲食的誘導下發生動脈粥樣硬化，和ApoE+小鼠相比，DKK3/ApoE雙基因敲除后小鼠的主動脈斑塊面積顯著減少，斑塊穩定性也增加，炎癥反應明顯減輕。這些結果表明，DKK3可顯著促進主動脈斑塊的形成和動脈粥樣硬化的發生發展。本發明證明了 DKK3在動脈粥樣硬化模型中有著重要的惡化作用，其抑制劑可用于制備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物。
[0062]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.DKK3作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
2.DKK3的抑制劑在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
3.一種預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，其特征在于:包含DKK3的抑制劑。
4.根據權利要求2所述的應用或權利要求3所述的藥物，其特征在于:所述的DKK3的抑制劑為DKK3基因的siRNA、DKK3基因的RNA干擾載體或DKK3的抗體及其他能夠抑制DKK3表達的抑制劑中的一種。
【文檔編號】A61K39/395GK104258397SQ201410520359
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月29日 優先權日:2014年9月29日
【發明者】李紅良, 朱麗華, 王丕曉, 向梅 申請人:武漢大學