專利名稱：：治療和/或預防動脈粥樣硬化的免疫調節方法和系統，以及相關蛋白、肽和組合物的制作方法
技術領域：
：本公開物涉及特別適于治療和/或預防動脈粥樣硬化和/或與其相關的病癥的免疫調節方法和系統，以及相關蛋白、肽和組合物。
背景技術：
：動脈粥樣硬化現在被看作是一種與脂質相關的和免疫調節性的慢性動脈壁炎性疾病。已經鑒定了參與動脈粥樣硬化的很多免疫成分，并且臨床前研究已取得令人滿意的結果，該結果提示靶向這些成分的免疫調節療法可以減少動脈粥樣硬化。MM本文提供了誘導個體免疫調節反應的方法和系統。在幾個實施方案中，本公開物的方法和系統誘導的免疫調節反應對個體動脈粥樣硬化或與其相關的病癥產生了治療或預防作用。根據第一個方面，描述了治療和/或預防個體動脈粥樣硬化的方法和系統。該方法包括抑制個體針對Ap0BlOO的CD4+T細胞反應，特別是通過施用治療有效量的能夠抑制所述反應的化合物。該系統包括適于抑制個體針對Ap0BlOO的CD4+T細胞反應的一種或多種試劑和適于檢測個體中反應降低的一種或多種試劑。根據第二個方面，描述了治療和/或預防個體動脈粥樣硬化的方法和系統。該方法包括抑制個體T細胞受體β鏈可變區(Τcellreceptorbetavariable)31(TCRTRBV31)，特別是通過施用治療有效量的能夠抑制所述受體的化合物進行抑制。該系統包括適于抑制個體中T細胞受體β鏈可變區31的一種或多種試劑和適于檢測個體中這種抑制的一種或多種試劑。可供選擇地，該方法包括抑制個體的T細胞受體，該受體具有與TRBV31的序列高度同源的DNA序列，特別是通過施用治療有效量的能夠抑制所述受體的化合物進行抑制。該系統包括適于抑制個體中這種T細胞受體的一種或多種試劑和適于檢測個體中這種抑制的一種或多種試劑。根據第三個方面，描述了治療和/或預防個體動脈粥樣硬化的方法和系統。該方法包括針對τ細胞受體β鏈可變區31免疫個體，所述免疫例如通過施用TCRTRBV31肽SEQIDNO1或其它TCRTRBV31免疫原性片段，尤其是來自CDR2可變區的TCRTRBV31免疫原性片段進行。該系統包括適于針對個體的T細胞受體β鏈可變區31免疫個體的一種或多種試劑和適于檢測個體中這種免疫的一種或多種試劑。可供選擇地，該方法包括針對與TRBV31高度同源的T細胞受體免疫個體，所述免疫例如通過施用同源(人)TCRTRBV304或TCRTRBV30免疫原性片段，尤其是來自⑶R2可變區的TCRTRBV30免疫原性片段進行。則該系統包括適于針對該個體的這種T細胞受體免疫個體的一種或多種試劑和適于檢測個體中這種免疫的一種或多種試劑。根據第四個方面，描述了T細胞受體β鏈可變區31或其免疫原性片段，該T細胞受體β鏈可變區31，其用作藥物。根據第五個方面，描述了T細胞受體β鏈可變區31或其免疫原性片段，該T細胞受體β鏈可變區31，其用于治療動脈粥樣硬化。根據第六個方面，與TRBV31的序列高度同源的T細胞受體，如同源人TCRTRBV30或TCRTRBV30免疫原性片段，尤其是來自⑶R2可變區的TCRTRBV30免疫原性片段，用于治療動脈粥樣硬化。根據第七個方面，與T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其免疫原性片段具有反應性的抗體，其用作藥物。根據第八個方面，與TRBV31的序列高度同源的T細胞受體具有反應性的抗體，例如同源人TCRTRBV30或TCRTRBV30免疫原性片段，尤其是來自CDR2可變區的TCRTRBV30免疫原性片段，用作藥物。根據第九個方面，與T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其免疫原性片段具有反應性的抗體用于治療動脈粥樣硬化。根據第十和第十一個方面，一種抗體用于治療動脈粥樣硬化，該抗體是與TRBV31的序列高度同源的τ細胞受體具有反應性的抗體，所述T細胞受體如同源人TCRTRBV30或TCRTRBV30免疫原性片段，尤其是來自⑶R2可變區的TCRTRBV30免疫原性片段。根據第十一個方面，描述了一種組合物，特別是疫苗，該組合物包含至少一個T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)，其免疫原性片段或抗體，連同佐劑和/或賦形劑。在一些實施方案中，該佐劑和/或賦形劑是藥用的并且該組合物是藥物組合物。根據第十二個方面，描述了一種組合物，特別是疫苗，該組合物包含至少一個T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)，其免疫原性片段或抗體，連同佐劑和/或賦形劑。在一些實施方案中，該佐劑和/或賦形劑是藥用的并且該組合物是藥物組合物。根據第十三個方面，描述了一種雜交瘤，其來自用oxLDL免疫且攜帶人類Ap0BlOO作為轉基因(huB100t9)的小鼠，特別是已根據布達佩斯條約于2009年1月22日保藏TDSMZ-^MMWM^UMrjP'ij·(DeutscheSammlungvonMikro-organismenundZellkulturenGmbH),Inhofftenstrasse7B，38124不倫瑞克(Braunschweig)，德國，保藏號為DSMACC2986的雜交瘤克隆48_5。根據第十四個方面，使用已根據布達佩斯條約于2009年1月22日保藏于DSMZ-德國微生物菌種保藏中心，hhofftenstrasse7B，381不倫瑞克，德國，保藏號為DSMACC2986的雜交瘤克隆48-5鑒定抑制針對Ap0BlOO的⑶4+T細胞反應的化合物。根據其阻止48-5暴露于apoBlOO或其片段時活化的能力來鑒定該化合物。本文描述的方法和系統可用于這些應用，其中所述應用期望在個體中抑制針對ApoBlOO的CD4+T細胞反應，抑制⑶4+TRVB31與ApoBlOO結合，和/或對個體的動脈粥樣硬化具有治療或預防作用。附圖和以下說明書中闡明了本發明公開內容的一個或多個實施方案的詳情。根據說明書和附圖，以及權利要求書，其它特征、目的和優點將很明顯。附圖簡述引入附圖并且其構成本說明書的一部分，和用來解釋本發明公開內容的原理和實施過程的詳細說明書和實施例部分，闡明本發明公開內容的一個或多個實施方案。ai顯示了舉例說明根據本文描述的實施方案，與T細胞識別天然LDL和Ap0BlOO相關的結果的圖表。圖2顯示了舉例說明根據本文描沭的實施方案，證明LDL的氧化和T細胞活化之間反相關的結果的圖表。_顯示了舉例說明證明在本文所述的實施方案中雜交瘤反應是I-Ab限制性的結果的圖表。Si顯示了這樣的圖表，其舉例說明證明在本文描述的實施方案中雜交瘤反應不依賴⑶1和MHC-I呈遞的結果。_顯示了證明在本文描述的實施方案中T細胞受體(TCR)基因型的實驗的結^ο_顯示了這樣的圖表，其舉例說明在本文描述的實施方案中，與FACS評估的TCR表達相關的結果。Sl顯示了這樣的圖表，其舉例說明了根據本文描述的實施方案，表明膽固醇和甘油三酯血漿水平的結果。圖8顯示了這樣的圖表，其舉例說明在本文描述的實施方案中，表明針對oxLDL和LDL的抗體滴度的結果。圖9顯示了這樣的圖表和相片，其表明在本文描述的實施方案中，TRVB31+細胞耗盡降低針對Ap0BlOO的T細胞反應。圖10顯示了這樣的圖表，其舉例說明表明在本文描述的實施方案中，針對TRBV31的免疫誘導封閉性抗體的結果。圖11顯示了這樣的圖表，其舉例說明表明在本文描述的實施方案中，針對TRBV31的免疫減少動脈粥樣硬化的結果。優詵實施方案的詳細說明本文提供了治療和/或預防個體的動脈粥樣硬化或與其相關的病癥的方法和系統和相關產品和組合物。本文使用的術語“治療(treating)或治療(treatment)”表示任何這樣的活動，該活動是以醫藥(medically)或外科手術方式對病癥進行醫療護理的一部分，或以醫藥或外科手術方式處理病癥。本文使用的術語“預防(preventing)或預防(prevention)”表示降低個體的病癥死亡率或發病率負擔的任何活動。這在一級、二級和三級預防水平進行，其中a)—級預防避免發生疾病；b)二級預防活動旨在疾病早期治療，由此增加干預的機會來預防疾病進展和出現癥狀；和c)三級預防通過恢復功能和減少疾病相關并發癥來降低已有疾病的負面影響。本文使用的術語“病癥”通常表示個體身體的這樣的身體狀況(總體上或其一個或多個部位)，其不符合與完全的身體、精神以及可能地社會福利的狀況有關的個體的身體狀況(總體上或其一個或多個部位)。本文描述的狀況包括但不限于紊亂和疾病，其中術語“紊亂”表示與身體或其任何部位的功能異常相關的有生命個體的狀況，術語“疾病”表示有生命個體的這樣的狀況，該狀況損害了身體或其任何部位的正常功能，并且典型地表現出顯著的體征和癥狀。示例性的狀況包括但不限于個體的損傷、失能、紊亂(包括精神和身體紊亂)、綜合征、感染、異常行為，和個體的身體或身體部位的結構和功能的不典型變化。本文使用的關于兩個項目的措辭“與……相關”表示兩個項目之間的關系，以致于第一項的發生伴有第二項的發生，包括但不限于因-果關系和征兆/癥狀-疾病的關系。本文使用的術語“個體”表示單個生物體，如高等動物，特別是脊椎動物，如哺乳動物，更特別的是人類。動脈粥樣硬化現在被看作是一種與脂質相關的和免疫調節性的慢性動脈壁炎性疾病。已經鑒定了參與動脈粥樣化形成的很多免疫成分，并且臨床前研究已經取得有前景的結果，該結果提示靶向這些成分的免疫調節療法可以減少動脈粥樣硬化。本文使用的術語“動脈粥樣硬化”表示心血管病癥，尤其是慢性炎性疾病，其特征為引起動脈壁內膜中炎性反應的脂蛋白累積。血管內膜(tunicaintima)(或僅內膜)是動脈或靜脈的最內層。內膜典型地由一層內皮細胞構成并由內側彈性膜(lamina)支撐。在內膜中，內皮細胞直接接觸血流。使用克隆擴充T細胞群的適應性免疫反應有助于這個炎性過程，由巨噬細胞和其它細胞支持的先天免疫反應亦然。幾個證據線索指向低密度脂蛋白(LDL)顆粒成分作為血管炎癥觸發物。本文使用的術語“低密度脂蛋白，，或“LDL”表示將膽固醇和甘油三酯從肝臟輸送到外周組織的那種類型的脂蛋白。LDL是脂蛋白五個主族之一；這些族包括乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、中等密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(HDL)。如同所有的脂蛋白一樣，LDL能夠使脂肪和膽固醇在血流的基于水的溶液中移動。典型地，天然LDL顆粒含有單個載脂蛋白B(apoB)分子，其使脂肪酸循環起來，保持它們溶于水性環境。LDL顆粒上的apoB在遍及全身的各種細胞中作為LDL受體的配體。該蛋白在血漿中主要以兩種同工型ApoB48和Ap0BlOO存在。第一種只由小腸合成，第二種由肝臟合成。載脂蛋白B-100分子具有4536個氨基酸殘基和約514kD的分子量。另外，LDL典型地具有高度疏水核心，該核心由被稱為亞油酸的多不飽和脂肪酸和約1500個酯化膽固醇分子組成。這個核心被磷脂和未酯化膽固醇以及單一拷貝的ApoB-IOO的外殼圍繞。LDL顆粒直徑為大約22nm，質量有約3百萬道爾頓。低密度脂蛋白受體位于多種類型細胞的外表面上，它們在那里接受在血流中循環的低密度脂蛋白并將它們輸送到細胞中。一旦進入細胞，低密度脂蛋白就分解而釋放膽固醇。然后膽固醇被細胞利用、儲存或從身體清除掉。低密度脂蛋白受體脫離它們的負載物后，循環返回到細胞表面以接受更多低密度脂蛋白。當LDL顆粒滲入內膜，它們易于遭受氧化修飾。這種變化可能包括被髓過氧化物酶和脂肪加氧酶進行酶學攻擊，以及非酶學氧化反應。作為氧化的最初結果，磷脂、膽留醇酯和甘油三酯中脂肪酸殘基的雙鍵被切開，產生反應性醛類和截短的脂類。在后者當中，修飾的磷脂如溶血卵磷脂和氧化的1-棕櫚酰-2-花生四烯基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(ox-PAPC)可以活化內皮細胞、巨噬細胞和Bl型B細胞，從而啟動先天免疫反應，包括粘附分子表達、產生趨化因子和分泌天然抗體。LDL的蛋白結構部分也是氧化修飾的目標。它們包括載脂蛋白B-100(Ap0BlOO)的賴氨酰殘基上丙二醛(MDA)、4_羥基壬烯醛和其它分子種類的加合物形成。形成針對LDL顆粒的MDA-賴氨酸和其它氧化產生的表位的抗體(Ketelhuth，D.F.，Tonini,G.C.，Carvalho,M.D.,Ramos,R.F.,Boschcov,P.,禾口Gidlund,M.(2008).AutoantibodyresponsetochromatographicfractionsfromoxidizedLDLinunstableanginapatientsandhealthycontrols(在不穩定的絞痛患者和健康對照中針對來自氧化的LDL的色譜級分的自身抗體反應那個).kandJImmunol68，456-462)。這種抗體在外周血中循環，也可以在動脈粥樣硬化病變中發現。與Bl細胞產生的氧化磷脂的天然抗體相比，抗MDA-ApoBlOO抗體主要是IgG分子(Yla-Herttuala,S.，Palinski,W.，Butler,S.W.，Picard,S.，Steinberg,D.,禾口Witztum,J.L.(1994).RabbitandhumanatheroscleroticlesionscontainIgGthatrecognizesepitopesofoxidizedLDL(兔禾口人的動脈粥樣硬化病變包含識別氧化的LDL的表位的IgG)·ArteriosclerThromb14，32-40.)。這暗示T細胞的參與有助于激活B細胞同種型轉變。在一些實施方案中，本文描述的治療和/或預防個體動脈粥樣硬化的方法包括抑制個體中針對ΑροΒΙΟΟ的⑶4+T細胞反應。本文使用的術語“T細胞”表示一組被稱為淋巴細胞的白細胞，它們在細胞介導的免疫中起著重要作用，并且在它們的細胞表面存在一種稱作T細胞受體(TCR)的特殊受體，由此可以與其他類型淋巴細胞，如B細胞和天然殺傷細胞區分開來。T細胞中縮寫T代表胸腺，因為它是T細胞發育的主要器官。在高膽固醇血癥小鼠和從人動脈粥樣硬化病變分離的克隆中已經鑒定到T細胞，由于LDL顆粒和氧化過程的生化復雜性，對T細胞表位的分子特性了解甚少。抗體通常由漿細胞產生，漿細胞是在活化CD4+T淋巴細胞產生的各種細胞因子存在下，和通過T淋巴細胞-B淋巴細胞的直接相互作用，由B淋巴細胞成熟而來。當⑶4+T淋巴細胞遇到具有主要組織相容性復合體II類抗原呈遞細胞例如B淋巴細胞和巨噬細胞的抗原性肽時，它們被活化。因此，T淋巴細胞識別主要組織相容性復合體II類肽復合體對于免疫反應的發展和抗體產生尤為重要。主要組織相容性復合體II類分子是高度多態的異源二聚膜糖蛋白，由α和β鏈組成。主要組織相容性復合體II類分子的功能是結合主要由胞外蛋白衍生的短肽結合，接著形成主要組織相容性復合體II類肽復合體，該復合體與CD4+T淋巴細胞合適的T細胞受體相互作用。成熟時，MHC分子錨定在細胞膜中，在那里它們通過T細胞受體(TCRs)對T細胞展示短多肽。所有MHC分子接受來自它們所屬細胞內部的多肽，并在細胞外表面上展示它們，用于被T細胞識別。術語“Τ細胞受體或TCR”表示T淋巴細胞(或T細胞)表面發現的分子，通常它負責識別與主要組織相容性復合體(MHC)分子結合的抗原。TCR是異源二聚體，在95%的T細胞中，其由α和β鏈組成，而5%的T細胞的TCRs由γ和6鏈組成。TCR與抗原和MHC的接合通過由相關酶、共同受體和特異性輔助分子介導的一系列生化事件引起它的T淋巴細胞活化。TCRα鏈和β鏈的可變結構域都具有三個高變區或互補性決定區(CDRs)，而β鏈可變區具有另外的高變區域(HV4)，該區正常不接觸抗原，因此不認為是CDR。CDR3是負責識別加工抗原的主要CDR，盡管α鏈的CDRl也可以與抗原性肽的N末端部分相互作用，以及β鏈的⑶Rl與該肽的C末端部分相互作用。⑶R2區與呈遞該肽的MHC分子相互作用。MHC分子同時結合特異性共同受體增強了來自T細胞復合體的信號。本文使用的術語“CD4+T細胞”表示T細胞，尤其是輔助T細胞和調節T細胞，它們的細胞表面存在共同受體CD4。在輔助T細胞上，CD4只與II類MHC結合。共同受體不僅確保TCR對于正確呈遞的抗原的特異性，而且允許延長抗原呈遞細胞和T細胞之間接合，由此增加必需分子(例如Lck)在涉及活化T淋巴細胞的信號傳導的細胞內募集。例如，抗原與T細胞受體(TCR)結合刺激IL-2和一些其它細胞因子的分泌，以及IL-2受體(IL-2R)表達。在一些實施方案中，⑶4+T細胞是存在T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)的⑶4+Τ細胞。本文使用的關于化合物或功能基團的術語“呈遞”表示實施連接以保持所連接的該化合物或功能基團的化學和/或生物學反應性。因此，細胞上呈遞的蛋白在合適的條件下能夠執行一個或多個化學和/或生物學反應，該反應從化學和/或生物學上表征該蛋白。本文使用的術語“Τ細胞受體β鏈可變區31”或“TRVB31”表示攜帶T細胞受體β鏈可變區31的T細胞，本領域技術人員閱讀本發明公開內容后可以認識到。本文使用的術語“Τ細胞受體β鏈可變區30”或“TRVB30”表示攜帶T細胞受體β鏈可變區30的T細胞，本領域技術人員閱讀本發明公開內容時可以認識到。本文使用的術語“具有與TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T細胞受體”表示其β鏈可變結構域是TRBV31的直向同源物的T細胞受體，TRBV31如www.treefam.org中所限定。例如，在人類中，TRBV31的直向同源物是TRBV30。在一些實施方案中，使用抑制針對Ap0BlOO的⑶4+T細胞反應的化合物。這種化合物可以是根據其防止雜交瘤克隆48-5暴露于apoBlOO或其片段時被活化的能力而鑒定的化合物。雜交瘤克隆48-5已經根據布達佩斯條約于2009年1月22日保藏在DSMZ-德國微生物菌禾中保藏中心(DeutscheSammlungvonMikro-organismenundZellkulturenGmbH),Inhofftenstrasse7B，38124不倫瑞克，德國，保藏號DSMACC2986。在一些實施方案中，抑制針對ApoBlOO的⑶4+T細胞反應通過抑制TCRTRVB31來進行。在一些實施方案中，抑制針對ApoBlOO的⑶4+T細胞反應通過抑制具有與TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T細胞受體來進行。在一些實施方案中，治療和/或預防個體的動脈粥樣硬化和/或與其相關的病癥可以通過施用治療有效量的化合物來進行，該化合物抑制T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)與包含載脂蛋白B-100或其片段的分子結合。在一些實施方案中，治療和/或預防個體的動脈粥樣硬化和/或與其相關的病癥可以通過施用治療有效量的化合物來進行，該化合物抑制具有與TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T細胞受體與包含載脂蛋白B-100或其片段的分子結合。在一些實施方案中，T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)與包含載脂蛋白Β-100或其片段的分子的結合被抑制。在一些實施方案中，具有與TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T細胞受體與包含載脂蛋白Β-100或其片段的分子的結合被抑制。在一些實施方案中，抑制針對ApoBlOO的⑶4+T細胞反應通過針對TCRTVB31或其免疫原性片段免疫個體來進行。接種疫苗引起抗原特異性免疫調節是預防或治療慢性炎性疾病的具有吸引力的方法。以抗原特異性方式動員保護性免疫反應，避免了由于宿主抗感染的防御受阻造成的副作用。因此，在慢性炎癥性疾病，如動脈粥樣硬化中，抗原特異性抑制病理性自身免疫性是令人感興趣的。通過幾種不同機制可以實現抗原特異性免疫保護，如產生保護性抗體，致病性T細胞克隆缺損或失活(無反應性)，或誘導由調節性T細胞(Treg)家族介導的抑制性細胞免疫。在一些實施方案中，可以用TCRTRVB31蛋白進行免疫。在一些實施方案中，可以用TCRTRVB31的片段，尤其是包括TCRβ鏈⑶R2可變區的部分(氨基酸殘基45-62，ATGGTLQQLFYSITVGQV-SEQIDNO1)的TRBV31肽進行免疫，其在本文也表示為TRVB31肽。本文使用的術語“蛋白”或“多肽”表示由兩個或更多氨基酸單體和/或其類似物組成的有機聚合物。術語“多肽”包括任何長度的氨基酸聚合物，包括全長蛋白和肽，以及其類似物和片段。三個或更多氨基酸的多肽也稱作寡肽。本文使用的術語“氨基酸”、“氨基酸性單體”或“氨基酸殘基”是指二十個天然存在的氨基酸中任何一個，包括具有非天然側鏈的合成的氨基酸并且包括D和L光學異構體二者。術語“氨基酸類似物”是指其中一個或多個個體原子已經被不同的原子、同位素，或不同的功能基團所取代，但在其他方面等同于其天然氨基酸類似物的氨基酸。本文使用的術語“片段”表示任何長度的多肽的一部分。因此TCRTVBR31的抗原性片段是表現出抗原性特性的TCRTVBR31的一部分。本文描述的TCRTVBR31的抗原性片段也包括無論是合成的還是可能是其衍生的任何肽。本文使用的關于第一多肽的術語“衍生物”(例如TCRTVBR31抗原性片段)表示第二多肽，該第二多肽結構上與第一多肽有關并且通過修飾而衍生自第一多肽，這種修飾引入了第一多肽中不存在的特征，同時保留了第一多肽的功能特性。因此，TCRTVBR31的抗原性片段的衍生多肽，通過氨基酸序列的修飾，通常不同于原始多肽或其部分，這種修飾可能伴有或可能不伴有原始多肽或其部分中不存在的額外功能。然而TCRTVBR31的抗原性片段的衍生多肽保留了可與對于TCRTVBR31或其抗原性片段所描述的抗原特性相媲美的抗原特性。在一些實施方案中，描述了TCRTRBV31肽或其片段用作藥物，尤其是用于治療動脈粥樣硬化。在一些實施方案中，可以用與T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其片段具有反應性的抗體進行免疫。在一些實施方案中，描述了與T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其片段具有反應性的抗體用作藥物，尤其是用于治療動脈粥樣硬化。本文使用的術語“抗體”是指一種類型蛋白，該蛋白在抗原刺激后由活化B細胞產生并可以與抗原特異性結合，促進生物系統中的免疫反應。全部抗體典型地由四個亞單位組成，包括兩條重鏈和兩條輕鏈。該術語抗體包括天然的和合成的抗體，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體或其片段。示例性的抗體包括IgA、IgD、IgGUIgG2、IgG3、IgM等等。示例性的片段包括FabFv、Fab，F(ab')2等等。單克隆抗體是與另一種生物分子的單一特定空間和極性結構(術語稱作“表位”)特異性結合并由此被解釋為與其互補的抗體。在一些情形中，單克隆抗體也可以具有相同的結構。多克隆抗體是指不同的單克隆抗體的混合物。在一些情形中，多克隆抗體可以是單克隆抗體的混合物，其中這些單克隆抗體中至少兩個與不同的抗原表位相結合。不同的抗原表位可以在相同的靶標、不同的靶標上，或其組合上。抗體可以通過本領域熟知的技術來制備，如宿主免疫和收集血清(多克隆的)，或通過制備連續雜交瘤細胞系和收集分泌的蛋白(單克隆的)。在一些實施方案中，本文描述的抑制T細胞反應的蛋白(包括抗體)、肽和/或試劑和合適的佐劑和/或賦形劑一起包含在組合物中。本文使用的術語佐劑表示改變其它試劑(例如藥物、疫苗)的作用，而當施用它們本身時，直接作用即使有也很少的藥物學或免疫學試劑。它們常常包括在疫苗中以增強接受者對所提供抗原的免疫反應，同時保持最少的注射外源物質。佐劑類型包括刺激免疫系統和增強對疫苗的反應，本身不具有任何特定抗原作用的免疫佐劑。本文使用的術語賦形劑表示用作藥物活性成分的載體的非活性物質。示例性的賦形劑還可以用于使含有非常有效活性成分的制劑膨脹，以允許方便且精確的給藥。除了它們在單劑量的量中的用途之外，賦形劑可以用在制備過程中以輔助有關活性物質的處理。根據給藥途徑和藥物形式，本領域技術人員可認識到可以使用不同的賦形劑。在一些實施方案中，組合物包含TCRTRVB31的選定(免疫原性的)肽片段，可能的毒素/類毒素破傷風毒素、白喉類毒素、霍亂毒素B亞單位，以及BSA、HAS、rHSA、KLH、卵白蛋白。在一些實施方案中，佐劑和賦形劑是藥物可接受的，所得組合物是藥物組合物。在那些實施方案中的一些中，藥物組合物是疫苗。本文公開的抑制CD4+T細胞對ΑροΒΙΟΟ反應和/或抑制TCRTRVB31與ΑροΒΙΟΟ結合的試劑，尤其是TCRTRVB31，其片段和/或相關抗體，可以提供作為系統的一部分來治療和/或預防。該系統可以以成套陣列或試劑盒的形式提供。在成套試劑盒中，試劑和進行檢測抑制和/或免疫的測定法的其它試劑可以分開包含在試劑盒中。試劑可以包括在一種或多種組合物中，并且每種試劑可以與合適的載體一起處于組合物中。本文使用的術語“檢測”表示測定有限份空間中靶標的存在、出現或事實，該空間包括但不限于樣品、反應混合物、分子復合體和底物。本文使用的“檢測”可以包括測定靶標的化學和/或生物學特性，包括但不限于與其它化合物相互作用的能力，尤其是結合的能力，激活另一種化合物的能力，和本領域技術人員閱讀本發明公開內容時可認識到的另外特性。檢測可以是定量的或定性的。當檢測涉及、關于或包括測量靶標或信號的量(也稱作定量)時，這種檢測是定量的，它包括但不限于目的是測定靶標或信號的量或比例的任何分析。當檢測涉及、關于或包括依據與另外靶標或信號相比的相對豐度來鑒定靶標或信號的質量或類型時，這種檢測是定性的，不是定量的。另外的組分可以包括標記分子，尤其是標記的多核苷酸、標記的抗體、標記、微流體芯片、比照標準，和本領域技術人員閱讀本發明公開內容時可認識到的另外的組分。本文使用的作為復合體或分子組分的術語“標記”和“標記分子”是指能夠檢測的分子，包括但不限于放射性同位素、熒光團、化學發光染料、生色團、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、納米顆粒、金屬溶膠、配體(如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或半抗原)等等。術語“熒光團”是指能夠在可檢測圖像中顯示出熒光的物質或其一部分。因此，本文使用的措辭“標記信號”表示允許標記檢測的標記發出的信號，包括但不限于放射性、熒光、化學發光、酶反應結果中化合物的產生等等。11在一些實施方案中，抑制和/或免疫的檢測可以通過基于熒光的讀數來實施，其中標記抗體被熒光團標記，它包括但不僅僅是小分子染料、蛋白生色團、量子點和金納米顆粒。另外的技術本領域技術人員在閱讀本發明公開內容時可認識到，不再進一步詳細討論了。特別是，為了實施本文描述的方法，試劑盒的成分可以和合適的說明書和其它必需試劑一起提供。試劑盒中所含組合物通常處于分開的容器中。實施測定的說明書，例如在紙質或電子載體上的成文或音頻說明書，例如磁帶或CD-ROMs，通常也將包括在試劑盒中。根據所用的具體方法，試劑盒還可以含有其它包裝試劑和材料(即洗滌緩沖液等等)。特別地，在一些實施方案中，公開了藥物組合物，其含有本文描述的至少一種試劑，和一種或多種相容的和藥物可接受載體，特別是藥物可接受稀釋劑或賦形劑。在那些藥物組合物中，該試劑可以作為活性成分施用，用于治療或預防個體的病癥。在一些實施方案中，描述了來自用oxLDL免疫并攜帶人類轉基因Ap0BlOO的小鼠(huB100t9)的雜交瘤用于鑒定抑制⑶4+T細胞對Ap0BlOO反應的合適試劑的用途。特別地，雜交瘤克隆48-5已經根據布達佩斯條約于2009年1月22日保藏在DSMZ-德國微生物菌種保藏中心，hhofftenstrasse7B，381不倫瑞克，德國，保藏號DSMACC2986，和相關的用途和系統。本領域技術人員在閱讀本發明公開內容時可以認識到關于本文描述的雜交瘤、試劑、組合物、方法的實施，包括實施該方法的系統(該系統可以是成套試劑盒的形式)，以及相關組合物(該組合物包括試劑和其它試劑，和組合物的合適載體、試劑或輔助試劑)，和試劑盒的一般制備和包裝的更多詳細情況。實施例下列實施例進一步闡明本文描述的方法和系統，以舉例說明方式提供這些實施例且并不意欲限制本發明。具體地，下列實施例闡明了示例性的方法和系統是基于用來自TCRTRVB31的特異性肽進行免疫來抑制針對Ap0BlOO的CD4+T細胞反應。本領域技術人員會認識到詳細描述的關于下述內容的特征的適用范圍，用來自TCRTRVB31的不同肽進行免疫，或抑制針對Ap0BlOO的CD4+T細胞反應的其它方法和系統，特別是根據本發明公開內容的存在TCRTRVB31的CD4+T細胞。在下列實施例中，數值以平均數士平均值的標準誤差(SEM)表示，除非另有陳述。非參數的Marm-WhitneyU檢驗用于配對比較。ρ小于0.05被認為組間差異是顯著的。實施例1:Τ細胞雜交瘤的天然人類LDL和ΑροΒ100_對于這些實驗，使用HuBlOOtg小鼠(攜帶人類Ap0BlOO作為轉基因的小鼠)表征針對oxLDL的T細胞反應。這些小鼠在肝臟以及腸中表達人類全長ΑροΒΙΟΟ，并顯示出人源化脂蛋白譜。對于T細胞雜交瘤的產生，使用7周齡人類ΑροΒΙΟΟ雄性轉基因小鼠huB100tg(C57BL/6,129-Apobtm2sgy,DNXTransgenics,Princeton,USA)。這些小鼠攜帶全長人APOB基因，其中密碼子2153已由亮氨酸變為谷氨酰胺以防止ApoB48形成，僅允許ΑροΒΙΟΟ產生(Boren，J.，Lee,I.，Zhu,W.，Arnold,K.，Taylor,S.,禾口Irmerarity，Τ.L.(1998).Identificationofthelowdensitylipoproteinreceptor-bindingsiteinapolipoproteinBlOOandthemodulationofitsbindingactivitybythecarboxylterminusinfamilialdefectiveapo_B100(鑒定載月旨蛋白BlOO中的低密度脂蛋白受體結合位點并且通過家族缺陷型apo-ΒΙΟΟ中的羧基端調節其結合活性)·JClinInvestlOl,1084-1093；Linton，Μ.F.，Farese，RV.，Jr.，Chiesa，G.，Grass,D.S.，Chin，P.，Hammer,RE.，Hobbs，H.H.，禾口Young，S.G.(1993).TransgenicmiceexpressinghighplasmaconcentrationsofhumanapolipoproteinBlOOandlipoprotein^)(轉基因小鼠表達高血漿濃度的人載脂蛋白BlOO和脂蛋白).JClinInvest92,3029-3037；Yao，Z.M.，Blackhart，B.D.，Johnson，D.F.，Taylor，S.Μ·，Haubold，K.W.，禾口McCarthy，B.J.(1992).EliminationofapolipoproteinB48formationinrathepatomacelllinestransfectedwithmutanthumanapolipoproteinBcDNAconstructs(在用突變的人載脂蛋白BcDNA構建體轉染的大鼠肝癌細胞系中去除載脂蛋白B48的形成)·JBiolChem267，1175-1182.)。將50μg銅氧化人LDL(oxLDL)與完全弗氏佐劑(CFA)混合，皮下(s.c)首次免疫小鼠，2周后用與弗氏不完全佐劑(IFA)混合的50f.IgoxLDL對小鼠加強免疫。Havel等(Havel,RJ.,Eder,H.Α.,禾口Bragdon,J.H.(1955).Thedistributionandchemicalcompositionofultracentrifugallyseparatedlipoproteinsinhumanserum(在人血清中超速離心的脂蛋白的分布和化學組成).JClinInvest34，1345-1353)描述了氧化人LDL(oxLDL)如下制備用超速離心法從健康供體合并的血漿中分離LDL(d=1.019-1.063g/mL)。分離后，用PBS大面積透析LDL。一等分試樣的LDL添加ImMEDTA用作未修飾的LDL。在20IJMCUS04存在下，37°C孵育ImLLDL(lmg/mL蛋白含量，用Bradford，Biorad，USA測定)1獲得高度氧化的LDL。T細胞雜交瘤的產生在如上所述的oxLDL初次免疫和加強注射后，收集淋巴結(LN)細胞并與胸腺瘤細胞融合產生雜交瘤如下Kappler等(Kappler，J.W.，Skidmore,B.，White,J.，和Marrack,P.(1981).Antigen-inducible,H-2-restricted,interleukin-2-producingTcellhybridomas.LackofindependentantigenandH_2recognition(抗原可誘導的、H_2局限性的、產生白介素-2的T細胞雜交瘤。缺乏獨立的抗原和H-2識別).JExpMed153，1198-1214)描述了聚乙二醇誘導5χIO7個淋巴結細胞(LN)和3χIO7個BW5147胸腺瘤細胞融合以產生T細胞雜交瘤。簡言之，融合前3天期間用3μg/mloxLDL刺激來自免疫小鼠的LN細胞。融合后，添加1χIO6個胸腺細胞作為飼養細胞，將細胞混懸液接種在96孔板中并在3rC、7.5%CO2下溫育。溫育M小時后，向培養基中添加次黃嘌呤_氨基蝶呤_胸腺嘧啶核苷(HAT)以選擇成功融合的細胞。在268個生長的雜交瘤培養物中，發現有117個表達CD3和CD4。接著，經有限稀釋克隆23個HAT抗性單克隆雜交瘤并篩選它們針對天然LDL、銅oxLDL和純化的未修飾ΑροΒΙΟΟ的反應性。篩選陽性克隆在同源的照射的抗原呈遞細胞(APC)存在下，在23個HAT抗性單克隆雜交瘤暴露于推定的抗原(天然LDL、銅oxLDL和純化的未修飾ApoBlOO)后，評估由它們產生的IL-2引起的活化(抗原與T細胞受體(TCR)結合刺激IL-2分泌)。這種細胞吸收并加工抗原，引起與MHC分子結合的抗原性肽的呈遞。為了防止T細胞識別外來MHC分子作為抗原而活化，需要同源的APC，即來自攜帶與T細胞相同的MHC的小鼠的APC。以96孔測定法測定T細胞反應性，采用1χIO5個T雜交瘤細胞和4xl05個照射的(1.6Gy)APCs，采用不同的抗原。如實施例1中討論的來制備LDL和oxLDL。如W^essel等以前描述的(Wessel，D.，和Flugge,U.I.(1984)Amethodforthequantitativerecoveryofproteinindilutesolutioninthepresenceofdetergentsandlipids(在存在去柜齊[J禾口月旨質時定量回收稀釋溶液中的蛋白的方法)AnalBiochem138，141-143)并做少許變動獲得Ap0BlOO。簡言之，向0.ImlLDL(lmg/mL)中添加0.4ml甲醇、0.Iml氯仿和0.3ml水；接著用力混合混懸液并以9000xg離心1分鐘。除去上相并向含沉淀蛋白的下相和分界面添加0.3ml甲醇，再次用力混合并以9000xg離心2分鐘使蛋白沉淀。為了獲得可溶且高度純的ΑροΒΙΟΟ，將沉淀的蛋白重懸于最小體積的10%SDS(Bio-Rad實驗室，Hercules,CA,USA)溶液中直至完全溶解。然后這些ΑροΒΙΟΟ制劑經受首次過濾，采用PD-10柱(GEHealthcare，以前的AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)以除去過量的SDS，隨后使用大小排阻柱Superdex-200(0.5mL/min，在Tris-HCl中pH7.4)進行純化。收集含ΑροΒΙΟΟ的第一峰，并丟棄含有來自LDL純化步驟的污染蛋白的額外峰。當第二次注入Superdex-200柱(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)評估時，ApoB100制劑顯示出90%以上的純度。最后，用Bradford測定法(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)測定蛋白濃度。通過將脾臟在尼龍過濾器(1001-lm)上網篩，之后裂解紅細胞并洗滌來制備APCs。用伴刀豆球蛋白A(c0ncavalin)(ConA)作為陽性對照。將細胞在補充5%胎牛血清(FCS)的Dulbecco's改良Eagle's培養基(DMEM)中，在3rC、7.5%C02下培養M小時。通過ELISA(R&DSystems，Abingdon，UnitedKingdom)測定培養物上清液的白介素2(IL-2)并將其作為T細胞活化的讀數。結果可以參見圖1A，其中二十三個HAT抗性單克隆雜交瘤中的每一個的1χIO5個雜交瘤細胞與4χIO5個照射的APCs連同40μg/mLLDL、oxLDL或ApoBlOO—起培養。用培養基作為陰性對照。明顯地，所有23個檢驗的單克隆T細胞雜交瘤中，11個對天然人LDL和ΑροΒΙΟΟ起反應，但是沒有一個對氧化LDL有反應。用聚合酶鏈式反應(PCR)對TCR進行基因分型用PCR對可以對天然LDL和ΑροΒΙΟΟ起反應的i^一個克隆進行基因分型。用RNeasymini試劑盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)制備來自11個雜交瘤克隆的每一個的1χIO7個雜交瘤細胞的總RNA，并使用SuperscriptII(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)將其逆轉錄為cDNA，采用隨機六核苷酸引物(pdN6)在RNasin(LifeTechnologies,CergyPontoise,France)存在下進行。用合適的Va家族特異性5‘引物(表1)連同恒定區Ca3'引物，或相關的νβ家族特異性5‘引物(表2)連同恒定區Ci33’引物擴增所產生的cDNA。表1用于TRAV的基因分型的引物權利要求1.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的方法，所述方法包括施用治療有效量的抑制個體中針對Ap0BlOO的CD4+T細胞反應的化合物。2.權利要求1的方法，其中抑制針對Ap0BlOO的CD4+T細胞反應的化合物是被鑒定具有阻止雜交瘤克隆48-5暴露于apoBlOO或其片段時活化的能力的化合物，其中所述雜交瘤克隆48-5是已根據布達佩斯條約于2009年1月22日保藏于DSMZ-德國微生物菌種保藏中心，Inhofftenstrasse7B,38124不倫瑞克，德國，保藏號為DSMACC2986的雜交瘤克隆。3.權利要求1或2的方法，其中所述CD4+T細胞是存在T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)的CD4+T細胞。4.權利要求1或2的方法，其中所述CD4+T細胞是存在這樣的T細胞受體的CD4+T細胞，所述T細胞受體具有與TRBV31高度同源的β鏈可變區區段的DNA序列。5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述CD4+T細胞是T輔助細胞。6.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的方法，所述方法包括施用治療有效量的抑制個體中T細胞受體β鏈可變區31的化合物。7.權利要求5的方法，其中所述抑制是通過抑制所述T細胞受體β鏈可變區31與Ap0BlOO或其片段結合而進行的。8.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的方法，所述方法包括施用治療有效量的抑制個體中T細胞受體的化合物，所述T細胞受體具有與TRBV31的序列高度同源的DNA序列。9.權利要求8的方法，其中所述抑制是通過抑制T細胞受體與Ap0BlOO或其片段結合而進行的，所述T細胞受體具有與TRBV31的序列高度同源的DNA序列。10.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的方法，所述方法包括針對τ細胞受體β鏈可變區31免疫所述個體。11.權利要求10的方法，其中所述免疫是通過施用TCRTVRB31的⑶R2可變區的免疫原性片段而進行的。12.權利要求10或11的方法，其中所述免疫是通過施用具有SEQIDNO1的序列的肽或其免疫原性片段而進行的。13.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的方法，所述方法包括針對T細胞受體β鏈可變區30免疫所述個體。14.權利要求13的方法，其中所述免疫是通過施用TCRTVRB30的⑶R2可變區的免疫原性片段而進行的。15.一種藥物組合物，其包含能夠抑制針對Ap0BlOO的⑶4+Τ細胞反應的試劑，以及藥用佐劑和/或賦形劑。16.一種治療和/或預防動脈粥樣硬化的疫苗，所述疫苗包含T細胞受體β鏈可變區31的免疫原性試劑。17.權利要求16的疫苗，其中所述試劑是TCRTRVB31或其片段。18.權利要求17的疫苗，其中所述試劑是具有SEQIDNO1的序列的肽或其片段。19.權利要求16的疫苗，其中所述試劑是與T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其片段具有反應性的抗體。20.T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其片段，其用作藥物。21.T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其片段，其用于治療動脈粥樣硬化。22.與T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其片段具有反應性的抗體，其用作藥物。23.與T細胞受體β鏈可變區31(TCRTRBV31)或其片段具有反應性的抗體，其用于治療動脈粥樣硬化。24.一種治療和/或預防動脈粥樣硬化的疫苗，所述疫苗包含T細胞受體β鏈可變區30的免疫原性試劑。25.權利要求M的疫苗，其中所述試劑是TCRTRVB30或其片段。26.權利要求M的疫苗，其中所述試劑是與所述T細胞受體β鏈可變區30(TCRTRBV30)或其片段具有反應性的抗體。27.T細胞受體β鏈可變區30(TCRTRBV30)或其片段，其用作藥物。28.T細胞受體β鏈可變區30(TCRTRBV30)或其片段，其用于治療動脈粥樣硬化。29.與T細胞受體β鏈可變區30(TCRTRBV30)或其片段具有反應性的抗體，其用作藥物。30.與T細胞受體β鏈可變區30(TCRTRBV30)或其片段具有反應性的抗體，其用于治療動脈粥樣硬化。31.雜交瘤克隆48-5，其根據布達佩斯條約于2009年1月22日保藏于DSMZ-德國微生物菌種保藏中心，Inhofftenstrasse7B，381不倫瑞克，德國，保藏號為DSMACC2986032.—種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的系統，所述系統包含一種或多種適于抑制所述個體的針對Ap0BlOO的CD4+T細胞反應的試劑和一種或多種適于檢測所述個體中反應降低的試劑。33.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的系統，所述系統包含一種或多種適于抑制所述個體的T細胞受體β鏈可變區31的試劑和一種或多種適于檢測所述個體中這種抑制的試劑。34.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的系統，所述系統包含一種或多種適于針對所述個體的T細胞受體β鏈可變區31免疫所述個體的試劑和一種或多種適于檢測所述個體中這種免疫的試劑。35.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的系統，所述系統包含一種或多種適于抑制所述個體的T細胞受體β鏈可變區30的試劑和一種或多種適于檢測所述個體中這種抑制的試劑。36.一種治療和/或預防個體中動脈粥樣硬化的系統，所述系統包含一種或多種適于針對所述個體的T細胞受體β鏈可變區30免疫所述個體的試劑和一種或多種適于檢測所述個體中這種免疫的試劑。全文摘要治療或預防個體的動脈粥樣硬化和/或與其相關的病癥的免疫刺激方法和系統。文檔編號A61P9/10GK102439035SQ201080020760公開日2012年5月2日申請日期2010年3月17日優先權日2009年3月17日發明者古蘭·K·漢森申請人:佛斯卡專利公司