一種由pH敏感性多肽修飾的靶向脂質體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種由具有pH敏感多肽修飾的抗腫瘤靶向脂質體，所述脂質體主要由磷脂、膽固醇、脂質-聚乙二醇和脂質-聚乙二醇-pH敏感多肽制成。所述pH敏感多肽在腫瘤組織的酸化環境中能暴露出增強的穿膜入胞的能力，介導脂質體在腫瘤部位高效入胞。
【專利說明】一種由pH敏感性多肽修飾的靶向脂質體
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種靶向脂質體，具體涉及一種具有PH敏感性多肽修飾的抗腫瘤靶向脂質體及其制備方法，屬于藥物制劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤的發病率和死亡率今年來呈逐年上升的趨勢，成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。盡管現下治療腫瘤的手段多種多樣，化療仍然是最為常用的治療手段。但是，化療藥物往往在正常組織和腫瘤組織間缺乏選擇性，因此其治療效果和應用范圍常受到限制。
[0003]目前，腫瘤靶向的納米遞藥體系的發展給腫瘤的治療帶來的新的突破。其中，脂質體作為一種具有良好生物相容性的納米級載體得到了人們的廣泛關注，而進行了 PEG(聚乙二醇)修飾后的脂質體能發揮其隱形作用，更多地濃集于腫瘤部位。但是PEG化的脂質體常常由于其表面親水性的PEG鏈立體位阻作用，阻礙脂質體的入胞能力。因此，穿膜肽作為一類能顯著提高其所攜帶載體入胞能力的多肽，常常被研究者用來修飾于脂質體表面，以增強脂質體入胞能力。但是，由于穿膜肽往往缺乏選擇性，在體內不同組織間的細胞穿透作用幾乎廣泛存在，引起較強毒副作用。因此，如何在正常組織中掩蓋其穿膜作用而在腫瘤組織中暴露其穿膜作用成為研究熱點。
[0004]近年來廣泛的研究 表明，腫瘤組織作為一種迅速增殖的組織，通常需要消耗更多的氧氣和營養成分，導致腫瘤部位的PH值偏酸性。因此，可以利用腫瘤組織和正常組織的PH值不同來構建和研究載藥體系。
[0005]組氨酸作為一種必需氨基酸在人類和哺乳動物內廣泛存在，其結構中的咪唑環具有一定的質子接受能力(PKa約6.5)，因此，在正常生理條件下，組氨酸呈負電；但在腫瘤組織中，組氨酸會因質子化效應轉變為具有正電荷的氨基酸。
[0006]本發明人利用了腫瘤組織較低的pH值以及組氨酸這一特性，構建和研究了本發明的特定載藥體系。

【發明內容】

[0007]本發明目的旨在于提供一種由pH敏感性多肽修飾構建而成的靶向脂質體載藥體系；進一步地提供一種由PH敏感性多肽修飾構建而成的抗腫瘤靶向脂質體載藥體系。
[0008]本發明的目的之一，將組氨酸對多肽序列中的某些堿性氨基酸(如亮氨酸)進行替換，藉此構建新型的具有pH敏感性的多肽A。
[0009]本發明的目的在于提供了一種由pH敏感性多肽A修飾的Lipid (磷脂)而構建而成的靶向脂質體或抗腫瘤靶向脂質體。
[0010]本發明的目的在于提供了一種抗腫瘤靶向脂質體，其特征在于包含磷脂、膽固醇、Lipid-PEG, Lipid-PEG-A 及活性劑。
[0011]其中，Lipid-PEG指的是磷脂-聚乙二醇，即聚乙二醇修飾的磷脂。[0012]其中，Lipid-PEG-A即Lipid-PEG-pH敏感性多肽，指的是由pH敏感性多肽修飾的磷脂-聚乙二醇；A表示pH敏感性多肽。
[0013]本發明的目的在于將一條序列為LHLLHHLLHHLLHLL (下劃線標識代表D型氨基酸)的具有PH敏感性的多肽(下文中將該多肽稱為“A”)通過聚乙二醇鏈連接于脂質體表面，借以構建這種pH敏感性多肽修飾的靶向脂質體載藥體系；其中，多肽序列中的H表示組氨酸，L表示亮氨酸。
[0014]該多肽序列中的組氨酸在酸性條件(pH 6.(Te.8)下，能發揮其質子化效應使多肽序列轉變為正電荷；同時，它能在細胞膜表面形成α螺旋結構，有利于其入胞。因此，將該多肽修飾于脂質體表面也可相應地賦予脂質體以PH敏感性，以達到在正常組織的pH條件中(pH 7.4)穿膜作用被掩蓋，細胞攝取降低；而在腫瘤組織的pH條件中穿膜作用(pH6.0-6.8)能發揮其功效，達到腫瘤部位高效遞藥的目的。
[0015]本發明(包括實施例)所使用的多肽A均由上海強耀生物科技有限公司購得。
[0016]本發明所述的Lipid-PEG-A，是將該多肽A連接在PEG鏈末端得到，優選的連接方法是利用多肽巰基與PEG鏈末端的馬來酰亞胺基團進行反應制得，也可以根據現有技術中記載的方法獲得。
[0017]作為本發明的具體實施方案之一，本發明所述的由pH敏感多肽修飾的(抗腫瘤)靶向脂質體，包括磷脂、膽固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A ;其中基于脂質體的總脂質的摩爾百分比計，磷脂 10-80%，膽固醇 10-80%, Lipid-PEG 1%_20%，Lipid-PEG-A 0.1%-15% ;所述總脂質指的是各磷脂和膽固醇之和。
[0018]在某一個實施方案中，優選的，其中基于脂質體總脂質(其中，所述總脂質指的是各磷脂和膽固醇之和)的摩爾百分比計，磷脂30%-70%，膽固醇10%-35%，Lipid-PEG2%-10%，Lipid-PEG-A 0.1%_5%。
[0019]作為本發明的具體實施方案之一，本發明所述的由pH敏感多肽修飾的腫瘤靶向脂質體，主要由磷脂、膽固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A以及活性劑制成；其中基于脂質體的總脂質(包括膽固醇和各磷脂)的摩爾百分比計，磷脂10-80%，膽固醇10-80%，Lipid-PEG 1%-20%，Lipid-PEG-A 0.1%_15% ;其中，按重量百分比算，活性劑占脂質體總脂質的0.1%-50% ;所述總脂質指的是各磷脂和膽固醇之和。
[0020]在某一個實施方案中，優選的，其中基于脂質體總脂質(其中，所述總脂質指的是各磷脂和膽固醇之和)的摩爾百分比計，磷脂30%-70%，膽固醇10%-35%，Lipid-PEG2%-10%，Lipid-PEG-A 0.1%_5%，其中，按重量百分數計算，活性劑占總脂質的1%_5%。
[0021]本發明所述的磷脂包括但不限于:大豆磷脂(SPC)、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS)、二肉豆蘧酰卵磷脂(DMPC)、二月桂酰卵磷脂(DLPC)、二硬酯酰卵磷脂(DPPC)，二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)U-肉豆蘧酰_2_棕櫚酰卵磷脂(MPPC)U-棕櫚酰-2-肉豆蘧酰卵磷脂(PMPC)U-棕櫚酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕櫚酰卵磷脂(SPPC)、蛋黃卵磷脂(EPC)、氫化豆磷脂(HSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二棕櫚脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蘧酰磷脂酸(DMPA)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蘧酰磷脂酰絲氨酸(DMPS)、二棕櫚酰磷脂酰二絲氨酸(DPPS)、腦磷脂酰絲氨酸(PS)、腦神經鞘磷脂(BSP)、二棕櫚酰神經鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰神經鞘磷脂(DSSP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的任一種或任幾種的混合，其中優選的為:大豆卵磷脂(SPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
[0022]本發明所述的Lipid-PEG和/或Lipid-PEG-A中的Lipid-PEG，包括但不限于，DSPE-PEG, DMPE-PEG, DPPE-PEG, DOPE-PEG, DLPE-PEG, Cholesterol-PEG ;優選 DSPE-PEG，上述Lipid-PEG均是采用本領域的常規方法制得或商業購買獲得。
[0023]此外，本發明制備脂質體所用的Lipid-PEG和Lipid-PEG-CPP-A中的PEG，其分子量為約200-約50000，優選的為約1000，約2000，約5000等。
[0024]任何活性劑，例如，治療劑和/或顯影劑都可以包括在本發明的脂質組合物中。本發明中所述的活性劑可以是抗腫瘤劑，包括但不限于烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、蒽環類抗生素、植物生物堿、紫杉醇衍生物、拓撲異構酶抑制劑、單克隆抗體、光敏劑、激酶抑制劑和韓波化合物。
[0025]本發明的目的在于提供了一種Lipid-PEG-A的制備方法，其制備步驟包括以下:
(1)取Lipid-PEG-Mal和多肽A置于圓底燒瓶中，加入有機溶劑溶解；
(2)室溫避光反應24h，于水浴20-40°C下旋轉蒸發儀上將反應液旋干得初產物；
(3)加入氯仿溶解后過濾，再于水浴20-40°C下旋轉蒸發儀上將有機溶劑減壓旋干即得Lipid-PEG-A。
[0026]本發明所述的Lipid-PEG-A中，脂質優選的是DSPE，PEG分子量優選為約2000。
[0027]本發明的目的 之一是提供了一種pH敏感多肽修飾的(抗腫瘤)靶向脂質體的制備方法，具體操作如下:
(1)將磷脂，膽固醇，Lipid-PEG和Lipid-PEG-A各取適量，置于茄形瓶中，加入有機相溶劑進行溶解混合均勻，在旋轉蒸發儀上將有機溶劑抽干；
(2)將茄形瓶置于真空干燥器中約0.5小時至約5小時，除去有機溶劑；
(3)向茄形瓶中加入磷酸鹽緩沖液、葡萄糖或硫酸銨溶液等水化液，在37-60°C下水化約0.5-約5小時，用擠壓過膜或超聲等方法將脂質體粒徑控制在IOOnm左右。
[0028]優選地，步驟(1)的有機溶劑選自氯仿、甲醇，優選的是氯仿。
[0029]作為本發明的優選實施方案之一，本發明所述的活性劑可在步驟(1)中加入，例如:(I)取活性劑、磷脂、膽固醇、Lipid-PEG、Lipid-PEG-A,置于茄形瓶中，加入有機溶劑溶解后，于水浴20-40°C下旋轉蒸發儀上將有機溶劑抽干。
[0030]作為本發明的優選實施方案之一，本發明所述的活性劑，也可在步驟(3)制備空白脂質體之后制備后，通過本領域常規的孵育的方法裝載到脂質體中。
[0031]本發明的目的在于提供了一種由pH敏感多肽修飾的靶向脂質體在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。
[0032]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
圖1為本發明的結構示意圖。圖中I為Lipid-PEG，2為多肽A。
[0034]圖2為小鼠結腸癌細胞C26對CFPE標記的不同脂質體的攝取情況，其中I為PEG-Lip,為普通的PEG衍生化的脂質體，2為A_Lip，即由多肽A修飾的脂質體。
[0035]圖3為載紫杉醇脂質體對耐藥的人乳腺癌細胞MCF-7/ADR的抑制作用。
[0036]
【具體實施方式】
[0037]以下實施例是對本發明的進一步說明，但絕不是對本發明范圍的限制。下面參照實施例進一步詳細闡述本發明，但是本領域技術人員應當理解，本發明并不限于這些實施例以及使用的制備方法。而且，本領域技術人員根據本發明的描述可以對本發明進行等同替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發明的范圍內。
[0038]實施例1.DSPE-PEG2000-A 的制各
在25ml圓底燒瓶中，加入IOml氯仿，再加入DSPE-PEG2000-Mal 10.0mg，三乙胺3 μ L，再將多肽A (序列為LHUilLLHHLLHLL，序列中L為亮氨酸，H為組氨酸；其中下劃線標識表示該氨基 酸為D型氨基酸，)9.1mg溶解于5ml甲醇后加入圓底燒瓶，室溫下避光反應48h，將反應液減壓旋干得初產物，加入氯仿溶解后過濾，再減壓旋干即得DSPE-PEG2000-A15.0mg (89.3%)，為無色油狀化合物。
[0039]實施例2.由DSPE-PEG2000-A修飾的脂質體的制各
以大豆磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-A為材料制備多肽A修飾的靶向脂質體。分別稱取大豆磷脂 1.42mg，膽固醇 0.40mg, DSPE-PEG2000 0.28mg, DSPE-PEG2000-A
0.78mg,溶于適量氯仿中，37°C水浴下,減壓旋轉蒸發除去氯仿,形成均勻脂質膜,加入ImlPBS緩沖液水化lh，探頭超聲(5s，5s，15次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得DSPE-PEG2000-A修飾的脂質體。
[0040]實施例3.由DPPE-PEG-A修飾的脂質體的制各
以大豆磷脂、膽固醇、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG3000-A為材料制備多肽A修飾的靶向脂質體。分別稱取大豆磷脂 L 42mg，膽固醇 0.40mg, DPPE-PEG3000 0.26mg, DPPE-PEG3000-A
0.75mg,溶于適量氯仿中，37°C水浴下,減壓旋轉蒸發除去氯仿,形成均勻脂質膜,加入ImlPBS緩沖液水化lh，探頭超聲(5s，5s，15次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得DPPE-PEG3000-A修飾的脂質體。
[0041]實施例4.由DMPE-PEG-A修飾的脂質體的制各
以大豆磷脂、膽固醇、DMPE-PEG5000、DMPE-PEG5000-A為材料制備多肽A修飾的靶向脂質體。分別稱取大豆磷脂 1.42mg，膽固醇 0.40mg, DMPE-PEG5000 0.30mg, DMPE-PEG5000-A
0.81mg,溶于適量氯仿中，37°C水浴下,減壓旋轉蒸發除去氯仿,形成均勻脂質膜,加入ImlPBS緩沖液水化lh，探頭超聲(5s，5s，15次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得DMPE-PEG5000-A修飾的脂質體。
[0042]實施例5.由DOPE-PEG-A修飾的脂質體的制各
以大豆磷脂、膽固醇、D0PE-PEG2000、D0PE-PEG3000-A為材料制備多肽A修飾的靶向脂質體。分別稱取大豆磷脂 1.42mg，膽固醇 0.40mg, D0PE-PEG2000 0.29mg, D0PE-PEG3000-A
0.80mg,溶于適量氯仿中，37°C水浴下,減壓旋轉蒸發除去氯仿，形成均勻脂質膜，加入ImlPBS緩沖液水化lh，探頭超聲(5s，5s，15次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得DOPE-PEG-A修飾的脂質體。[0043]實施例6.CFPE標記的脂質體的制備
按實施例2中的配方，加入大豆磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-A，溶于適量氯仿中，再加入熒光標記磷脂CFPE 20μ g，37°C水浴下，減壓旋轉蒸發除去氯仿，形成均勻脂質膜，加入Iml PBS緩沖液水化lh，探頭超聲(5s，5s，15次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得CFPE標記的多肽A修飾的脂質體。
[0044]實施例7.包載抗腫瘤藥物紫杉醇的脂質體的制備
按實施例2中的配方，加入大豆磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-A，再加入紫杉醇100 μ g，溶解于氯仿中，37°C水浴下，減壓旋轉蒸發除去氯仿，形成均勻脂質膜，加入Iml PBS緩沖液水化lh，探頭超聲(5s，5s，15次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得到包載抗腫瘤藥物紫杉醇的多肽A修飾的脂質體。
[0045]實施例8.小鼠結腸癌細胞C26對脂質體的攝取 表1:各組脂質體的處方
【權利要求】
1.一種由pH敏感性多肽修飾的靶向脂質體，其特征在于將一條序列為LHLLHHLLHHLLHLL (下劃線標識代表D型氨基酸)的具有pH敏感性的多肽A通過聚乙二醇鏈連接于脂質體表面，構建具有PH敏感性多肽修飾的靶向脂質體。
2.根據權利要求1所述的一種由pH敏感性多肽修飾的靶向脂質體，其特征在于包含磷月旨、膽固醇、Lipid-PEG, Lipid-PEG-A。
3.根據權利要求1所述的一種由pH敏感性多肽修飾的抗腫瘤靶向脂質體，其特征在于包含磷脂、膽固醇、Lipid-PEG, Lipid-PEG-A及活性劑。
4. 一種由pH敏感性多肽修飾的祀向脂質體,其特征在于包含磷脂、膽固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A ;其中基于脂質體的總脂質的摩爾百分比計，磷脂10-80%，膽固醇10_80%，Lipid-PEG 1%-20%，Lipid-PEG-A 0.1%_15% ;其中，所述總脂質指的是各磷脂和膽固醇之和。
5.根據權利要求書4所述的脂質體，其特征在于用于修飾Lipid-PEG的pH敏感多肽配體序列為LHLLHHLLHHLLHLL，其中L為亮氨酸，H為組氨酸，其中下劃線標識表示該氨基酸為D型氨基酸。
6.一種由pH敏感性多肽修飾的抗腫瘤靶向脂質體，其特征在于主要由磷脂、膽固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A以及活性劑制成；其中基于脂質體的總脂質的摩爾百分比計，磷脂 10-80%，膽固醇 10-80%, Lipid-PEG 1%_20%，Lipid-PEG-A 0.1%-15% ;其中，按重量百分比算，活性劑占脂質體總脂質的0.1%-50% ;所述總脂質指的是各磷脂和膽固醇之和。
7.根據權利要求1-6所述的靶向脂質體，其特征在于所述磷脂包括所有類型的磷脂，包括但不限于大豆磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油；優選大豆磷脂。
8.根據權利要求1-7所述的靶向脂質體，其特征在于所述活性劑可以是抗腫瘤劑，包括但不限于烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、蒽環類抗生素、植物生物堿、紫杉醇衍生物、拓撲異構酶抑制劑、單克隆抗體、光敏劑、激酶抑制劑和含鉬化合物。
9.根據權利要求1-8所述的pH敏感多肽修飾的(抗腫瘤)靶向脂質體在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。
【文檔編號】A61K9/127GK103599069SQ201310543868
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】何勤, 張倩玉, 劉亞圓 申請人:四川大學