RGD四肽修飾的β-咔啉，其制備，活性和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser, I- (4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Phe和1_ (4_羥基_3_甲 氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Val，涉及它們的制備方法，涉及它們的納米 結構和應用。本發明屬于生物醫藥領域。 技術背景
[0002] 惡性腫瘤嚴重威脅人類的健康。除了自身對腫瘤患者的預后惡劣之外，惡性腫瘤 并發的炎癥、血栓和轉移進一步惡化患者的預后。例如，超過90%以上的惡性腫瘤患者都是 死于腫瘤轉移。腫瘤轉移依賴于4個因素：1)腫瘤細胞表面形成微血栓，逃避巨噬細胞吞 噬，通過血液循環遷移到遠端；2)遷移到遠端的腫瘤細胞粘附到血管壁；3)細胞粘附到血 管壁的腫瘤細胞通過侵襲出血管而進入正常組織；4)炎癥使進入正常組織的腫瘤細胞成 長為轉移的新生腫瘤。
[0003] 由于現有抗腫瘤藥物不具備抗炎癥、抗血栓和抗轉移作用，所以療效不理想。發明 同時具有抗腫瘤、抗炎癥、抗血栓和抗腫瘤轉移作用的藥物是臨床的迫切需求。
[0004] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素ανβ3的阻斷劑。申請人曾經報道在濃 度為ΙμΜ時它們可以抑制腫瘤細胞粘附和浸潤。申請人曾經把它們與雌激素偶聯，制備沒 有凝血副作用的抗骨質疏松劑。申請人曾經把它們與四氫-β-咔啉-3-羧酸偶聯制備高 效的抗血栓劑。申請人也曾經用氨基酸修飾四氫-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及 1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氫-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的 β-咔啉-3-羧酸制備高效的抗血栓劑或抗腫瘤劑。下面是發明人創造的結構類型的代表。 盡管發明人付出了大量研究精力，篩選了數百種化合物，一直沒有得到同時具有抗腫瘤、抗 炎癥、抗血栓和抗腫瘤細胞粘附遷移和浸潤作用的化合物。
[0005] 發明人在分析數百種化合物的結構及活性變化的基礎上，認識到將RGDS，RGDV或 RGDF與1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸偶聯，形成的1-(4-羥基-3-甲 氧羰基苯基）_β_咔啉_3_甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser，1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Phe和1_(4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 酰-Arg-Gly-Asp-Val會同時具有抗腫瘤、抗炎癥、抗血栓和抗腫瘤細胞粘附遷移和浸潤作 用的化合物。基于這個認識，發明人提出了本發明。

【發明內容】

[0006] 本發明的第一個內容是提供下面結構的1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser(Phe，Val)。
[0007]
[0008] 本發明的第二個內容是提供1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔啉-3-甲 酰-Arg-Gly-Asp-Ser(Phe，Val)的制備方法，該方法由以下步驟構成：
[0009] (1)在濃硫酸存在下，5-甲酰水楊酸在甲醇中微波90°C反應2h，生成5-甲酰水楊 酸甲酯；
[0010] (2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反應，生成L-色氨酸芐酯；
[0011] (3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水楊酸和L-色氨酸芐酯縮合為 1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3,4_四氫-β-咔啉-3-羧酸芐酯；
[0012] (4)在2, 3-二氯-5,6-二腈基-1，4-苯醌（DDQ)的存在下，1-(4-羥基-3-甲氧 羰基苯基）-1，2,3,4_四氫-β-咔啉-3-羧酸芐酯在四氫呋喃（THF)中氧化為1-(4-羥 基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸芐酯；
[0013] (5)在Pd/C和Η2存在下，在甲醇中1- (4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧 酸芐酯反應生成1- (4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸；
[0014] (6)采用逐步縮合法，在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反應，得到全保護多肽 序列Boc-Arg(NO〗）-Gly-Asp (OBzl) -Ser (Bzl) -〇Bzl，Boc-Arg(NO〗）-Gly-Asp (OBzl) -Phe-〇B zl, Boc-Arg (N02)-Gly-Asp (OBzl)-Val-〇Bzl；
[0015] (7)在冰浴下氯化氫的乙酸乙酯溶液（4M)中，Boc-Arg (N02) -Gly-Asp (OBz l)-Ser(Bzl) -OBzl, Boc-Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-〇Bz 1, Boc-Arg (N02) -Gly-A sp (OBzl)-Val-〇Bzl分別脫除Boc得到Arg(N02)-Gly-Asp (OBzl)-Ser (Bzl)-OBzl, Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-〇Bzl, Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Val-〇Bzl；
[0016] (8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-羧酸在無水THF中分別與Arg(N02)-Gly_Asp(0Bzl)-Ser(Bzl)-0Bzl， Arg(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Phe-0Bzl，Arg(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Val-0Bzl生成1-(4-輕 基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔啉-3-甲酰-Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Ser (Bzl) -OBzl， 1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02)_Gly-Asp(0Bzl)-Phe-0Bzl， 1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02)_Gly-Asp(0Bzl)-Val-0Bzl ;
[0017] (9)在Pd/(^PH2存在下，在甲醇中1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-甲醜-Arg(Ν02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBz1，1_(4_ 羥基-3-甲氧撰基苯 基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-〇Bzl，1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯 基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02) -Gly-Asp(OBzl) -Val-〇Bzl分別生成化合物 1- (4-羥 基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser，1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯 基）-β-咔琳-3-甲醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_ (4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Val。
[0018] 本發明的第三個內容是測定1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 琳-3-甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羥基-3-甲氧撰基苯基）-β-咔琳-3-甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羥基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 的納米結構。
[0019] 本發明的第四個內容是評價1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羥基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 抑制腫瘤細胞增殖的作用。
[0020] 本發明的第五個內容是評價1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羥基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長作用。
[0021] 本發明的第六個內容是評價1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羥基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 抑制腫瘤細胞粘附侵襲和遷移的作用。
[0022] 本發明的第七個內容是評價1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羥基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 的抗炎作用。
[0023] 本發明的第八個內容是評價1-(4-羥基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羥基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羥基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 的體外抗血小板聚集和體內抗栓作用。
【附圖說明】
[0024] 圖1.發明人創造的抗血栓或抗腫瘤活性化合物的結構類型代表，式中AA為L-氨 基酸或甘氨酸。
[0025] 圖2.化合物5a_c的合成路線·i)CH30H，濃H2S04,微波90°C;ii)多聚磷酸，苯甲 醇，油浴 75°C;iii)CH2Cl2,TFA;iv)THF，DDQ;v)CH30H，Pd/C，H2 ;vi)DCC，HOBt，NMM，THF; vii)CH30H，2NNaOH;viii)氯化氫 / 乙酸乙酯溶液（4N). 4a-c中AA分別為Ser(Bzl)，Phe 和Val殘基；5a-c中AA分別為Ser，Phe和Val殘基。
[0026] 圖3.化合物5a_c在純水溶液中1X10 7M濃度下的透射電鏡照片。
[0027] 圖4.化合物5a作用于腫瘤細胞的細胞活力圖（η= 3)。
[0028] 圖5.化合物5b作用于腫瘤細胞的細胞活力圖（η= 3)。
[0029] 圖6.化合物5c作用于腫瘤細胞的細胞活力圖（η= 3)。
【具體實施方式】
[0030] 為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
[0031] 實施例1制備5-甲酰水楊酸甲酯
[0032] 稱取1. 660g(10. 0mmol)5_甲酰水楊酸于微波反應罐中，加入25mL甲醇及lmL濃 H2S04，于微波反應器中90°C反應2h，利用TLC監測至原料斑點消失，停止反應降至室溫后， 將反應液轉移至lOOmL茄形瓶中，用濃氨水調pH值至7-8,將反應液減壓濃縮至干后，加大 量乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯層依次用飽和NaHC03、飽和NaCl各洗三遍，然后用無水Na2S04干 燥2h，過濾、減壓濃縮至干，于室溫放置過夜即有晶體析出，得1.635g(90.8% )目標化合 物，為淡黃色針狀晶體。ESI-MS(m/e) :181[M+H]+。
[0033] 實施例2制備L-色氨酸芐酯
[0034] 稱取15. 0g(44. 4mmol)多聚磷酸于500mL爺形瓶中，加入80mL苯甲醇，使其在油 浴50°C中溶解，待溶液溫度上升至75°C后，稱取10g(49.Ommol)L-色氨酸加入其中，75°C下 反應48h，利用TLC監測至原料斑點消失，停止反應降溫后，在冰浴攪拌下往反應瓶中倒入 400mL無水乙醚，此時有白色固體析出，攪拌過夜后將之過濾，白色固體用200mL乙酸乙酯 和10mL水懸浮，用三乙胺調溶液pH值至8左右，溶液變為澄清狀，靜置分液，將分離的酯層 依次用飽和NaHC03、飽和NaCl各洗三遍，乙酸乙酯層用無水Na2S04干燥2h，過濾、減壓濃縮 至干，得12.85g(89.2%)目標化合物，為白色固體。ESI-MS(m/e) :295[M+H] +。
[0035] 實施例3制備1- (4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸 節酯（1)
[0036] 往250mL茄形瓶中加入lOOmLCH2C12及10mLTFA，攪拌均勻后稱取 11. 76g(40.Ommol)L-色氨酸節酯和7. 92g(44. 0mmol)5-甲酰水楊酸甲酯加入其中，數分 鐘后反應液變為微紅色，2天后反應液變為黑色，在冰浴攪拌下緩慢滴加濃氨水將反應液 調pH值至8,將反應液靜置分液，將分離CH2C12層依次用飽和NaHC03、飽和NaCl各洗三遍， CH2C12層用無水Na2S04干燥2h，過濾、減壓濃縮至干，得14. 59g(80% )目標化合物，為黃色 固體。ESI-MS(m/e) :457[M+H]+。
[0037] 實施例4制備1- (4-羥基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧