專利名稱：預防原發性肝癌的樹莓提取方法
技術領域：
本發明涉及一種預防原發性肝癌的樹莓提取方法。
背景技術：
樹莓(Raspberry)也稱木莓，為薔薇科懸鉤子屬(Rubussp.)植物，鮮果 中含大量的維生素C、維生素E、 SOD(超氧化物歧化酶一含量居水果之首)、Y-氨基丁酸等抗衰老物質和抗癌物質一鞣化酸(Ellagicacid),其中維生素E和鞣 化酸含量為所有水果之最。美國稱紅樹莓是癌癥的克星，被譽為"紅寶石"。樹 莓是當今風靡歐美、深受人們歡迎的高營養新興水果。鞣化酸對結腸、宮頸、 乳腺、和胰腺癌細胞有特殊療效。樹莓及其加工產品能有效地保持鞣化酸的活 性成分，并能被人體吸收。樹莓是當今發現的天然鞣化酸含量最高的食物，鞣 化酸是一種帶苯環的酚類化合物，低含量的鞣化酸還可以減慢癌細胞的生長， 高含量則可殺死癌細胞。
目前國內已有科研組研究樹莓，但不論是從研究的目的及研究的方向上都 有很大差異，在提取工藝上也有很大的差異。
沈陽農業大學食品學院對樹莓進行提取的工藝是采用了 SephadexG-100柱 層析的方法進行的，這種方法具有很多缺點首先，層析運用正負電荷相吸原 理進行，這種方法容易丟失中性基團基及弱電荷基團，眾所周知，很多有機物 都是中性的；其次，由于植物化學物質之間是有配伍功效的，層析方法不能充 分提取樹莓中有效成分，所以導致配伍的失衡，植物化學物質的功效不能充分 發揮；再次，層析需要溶液的流動性好，致使提取物的濃度很低，不利于研究 高濃度組的效果。
東北農業大學理學院應化系研究了熱水法提取樹莓多糖的工藝，這種方法 也有比較明顯的劣勢首先，樹莓中抗氧化成份是有機物，水不能夠將其充分 萃取；其次，樹莓中抗氧化成份在熱水中若沒有有效措施會被氧化，從而失去 了抗氧化的能力，也就沒有了樹莓提取物的抗腫瘤的能力。

發明內容
本發明的目的是提供一種預防原發性肝癌的樹莓提取方法，能夠充分地提 取樹莓中的有效成分并保證其抗氧化及抗腫瘤的能力。 上述的目的通過以下的技術方案實現
預防原發性肝癌的樹莓提取方法，其組成包括在成熟季節摘取新鮮樹莓 并打碎去渣，將所述的打碎去渣后的樹莓充分攪拌后放入燒杯中并置于冰塊上,
在100g樹莓中加入80%的丙酮200ml在預冷的混合器內混合3分鐘，然后使 用勻漿器繼續勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過瓶中，濾過 瓶上放置有濾過紙(Whatmaii2W，收集濾過物置于旋轉蒸發器中并在50。C條 件下旋轉蒸發45分鐘，用去離子水調節到終體積為50ml，置于零下2(TC-零下 8(TC凍存。
本發明的有益效果
1. 本發明利用80%丙酮200ml做為溶劑與100g樹莓混合，此種比例為最 佳配比，能充分提取樹莓中有效成分，使植物化學物質的功效充分發揮，并且 提取物的濃度高，能最大限度的保證樹莓中抗氧化成份抗氧化的能力，從而保 證了樹莓提取物的抗腫瘤的能力。用Whatman2弁濾紙可以濾過更多雜質，使提 取物更純。
2. 本發明將打碎去渣后的新鮮樹莓放入燒杯后置于冰塊上，可以減少由于 氧化反應而引起的顏色變褐植物化學物質失活。
3. 通過利用TOSC方法檢測樹莓提取物的抗氧化活性，結果表明各實驗濃 度組樹莓提取物都具有抗氧化活性，隨著濃度的升高，抗氧化活性上升；樹莓 提取物能夠從抑制多種腫瘤相關基因的表達來預防和治療腫瘤；樹莓提取物中 的植物化學物質具有的抗氧化特性，可以清除體內的氧自由基(ROS)，預防細 胞DNA的損傷，從而預防腫瘤的發生；總的鞣化酸(Ellagic acid)可以影響 腫瘤細胞的一些生物學活性如增殖，癌基因表達，凋亡的發生等；植物化學物 質能夠抑制腫瘤細胞VEGF的表達，影響野生型p53的表達和促進腫瘤細胞的 凋亡可能是樹莓提取物預防和治療惡性腫瘤的主要機制，體內實驗表明樹莓提 取物能夠有效的發揮體內抗腫瘤的活性，其效果非常明顯。
具體實施例方式實施例l:
預防原發性肝癌的樹莓提取方法，其組成包括在成熟季節摘取新鮮樹莓 并打碎去渣，將所述的打碎去渣后的樹莓充分攪拌后放入燒杯中并置于冰塊上， 在100g樹莓中加入80%的丙酮200ml在預冷的混合器內混合3分鐘，然后使 用勻漿器繼續勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過瓶中，濾過 瓶上放置有Whatmaii2^濾過紙，收集濾過物置于旋轉蒸發器中并在50'C條件下 旋轉蒸發45分鐘，用去離子水調節到終體積為50ml，置于零下20'C-零下80 'C凍存。
TOSC實驗是利用氣相色譜分析方法檢測純化溶液或生物樣品的抗氧化 性。在氧存在的條件下，ABAP可以在高溫條件下產生過氧化物自由基，這些 自由基進一步氧化KMBA產生乙烯，乙烯的產量可以通過氣相色譜分析來檢 測。TOSC實驗的理論基礎為外加的抗氧化劑與KMBA競爭過氧化物自由基， 從而部分地抑制乙烯的生成。在我們的實驗反應系統中，不同濃度的樹莓提取 物(200ng/ml、400照/ml、800ng/ml、1000照/ml)加入4ml帶膠蓋的Teflon/Silicone 小瓶中，小瓶中含有0.2 1]\110\18八，20mMABAP和lOOmM磷酸鹽緩沖液各 O.lml，最后用去離子水調節終體積為lml。整個反應在加入100|al， 200mM ABAP 后被啟動。在37'C， 160 r/min條件下的搖床內反應15、 30、 45、 60分鐘，對 照組含有除樹莓提取物外的其它所有試劑。在不同時段透過小瓶瓶塞抽取0.5 ml 反應液上方的氣體，注入氣相色譜反應系統中。氦氣作為運送氣體，流速為 25ml/min。
通過利用TOSC方法檢測樹莓提取物的抗氧化活性，結果表明各實驗濃度 組樹莓提取物都具有抗氧化活性，隨著濃度的升高，抗氧化活性上升，目前已
經發現的清除自由基的機理有兩種 一種是增強抗氧化酶活性，迅速消滅自由
基，比如超氧化物岐化酶和過氧化氫酶就是存在于人體正常組織當中的清除氧
自由基的重要酶系統；另外一種方法是直接攝入抗氧化劑。據報道蔬菜及水 果中的主要的抗氧化物質是多酚類及黃酮類化合物，來源于蘋果中的維生素C 的抗氧化性僅占總的抗氧化能力的0.4%。樹莓植物化學物質中鞣化酸(Ellagic acid)的抗氧化活性是Vc的600-800倍，說明樹莓具有的較強的抗氧化活性主
5要來源于其它植物化學成分，他們是其預防腫瘤發生的主要原因之一。癌癥的發生機制十分復雜，不僅涉及多種癌基因、抑癌基因的變化，而且 一些細胞因子在癌癥發生、發展的過程中也起到一定的作用。盡管這些基因、 細胞因子對細胞的作用方式不同，作用途徑和作用部位有別，但最終結果都將 導致細胞的惡性增殖。因此，遏制細胞的惡性增殖是腫瘤治療的基礎。我們的 實驗結果顯示，樹莓提取物隨濃度升高，可以明顯抑制腫瘤細胞增殖，從而預 防腫瘤的發生。在人類腫瘤中，抑癌基因p53的突變是較常見的原因之一，尤以大腸癌中 表現更為明顯。p53基因有野生型和突變型兩種，前者為腫瘤抑制基因，后者 為致癌基因，前者的突變、缺失或后者的過表達均可促進腫瘤的發生。我們實 驗檢出的野生型p53蛋白，其陽性表達具有抑癌作用，實驗表明，樹莓提取物 中的植物化學物質能夠增強野生型p53的表達。眾多研究表明，VEGF在幾乎所有惡性腫瘤組織中都有髙度表達，較高的 VEGF表達率反映了高水平的細胞增殖狀態。研究結果表明樹莓提取物具有明 顯的抑制VEGF表達的活性，使腫瘤細胞處于較低的增殖狀態，而抑制腫瘤的 發生和發展。VEGF高表達與野生p53蛋白的過表達呈負相關，提示癌腫的發 生發展與多種腫瘤相關基因協同作用有關，而樹莓提取物能夠從抑制多種腫瘤 相關基因的表達來預防和治療腫瘤。總之，樹莓提取物中的植物化學物質具有的抗氧化特性，可以清除體內的 氧自由基(ROS)，預防細胞DNA的損傷，從而預防腫瘤的發生；總的鞣化酸(Ellagic acid)可以影響腫瘤細胞的一些生物學活性如增殖，癌基因表達， 凋亡的發生等；植物化學物質能夠抑制腫瘤細胞VEGF的表達，影響野生型p53 的表達和促進腫瘤細胞的凋亡可能是樹莓提取物預防和治療惡性腫瘤的主要機 制，體內實驗表明樹莓提取物能夠有效的發揮體內抗腫瘤的活性，其效果非常 明顯。目前惡性腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢，但治療手段主要是以手術為主， 化療、放療為輔，療效欠佳，死亡率高居各類疾病之首。因此，有關惡性腫瘤 的預防、治療問題是當代醫務工作者面臨的首要問題。就藥物治療而言，目前臨床上應用的絕大多數抗癌藥主要為化學合成藥，其作用機制主要以抑制和殺 滅腫瘤細胞為主，而且往往導致正常組織細胞的損傷，因此毒、副作用較大。 另外，惡性腫瘤細胞長期接觸藥物后容易產生耐藥性，大大地影響了治療效果。 天然植物提取物，其各種成份為天然配伍，幾乎沒有細胞毒性及副作用，可以 作為長期預防及治療用藥。樹莓提取物具有很強的抗氧化活性；具有明顯的抗 肝癌細胞系HepG-2增殖的活性；樹莓提取物能夠抑制肝癌細胞系HepG-2 VEGF的表達和誘導腫瘤細胞發生凋亡；樹莓提取物能夠影響肝癌細胞系 H印G-2野生p53的表達；樹莓提取物抑制VEGF及影響野生p53的表達與誘 導腫瘤細胞凋亡是其抗腫瘤機理的三個主要方面；樹莓提取物在體內能夠明顯 抑制腫瘤的發生和進展。
權利要求
1.一種預防原發性肝癌的樹莓提取方法，其組成包括在成熟季節摘取新鮮樹莓并打碎去渣，其特征是將所述的打碎去渣后的樹莓充分攪拌后放入燒杯中并置于冰塊上，在100g樹莓中加入80％的丙酮200ml在預冷的混合器內混合3分鐘，然后使用勻漿器繼續勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過瓶中，濾過瓶上放置有濾過紙，收集濾過物置于旋轉蒸發器中并在50℃條件下旋轉蒸發45分鐘，用去離子水調節到終體積為50ml，置于零下20℃-零下80℃凍存。
全文摘要
預防原發性肝癌的樹莓提取方法，已有的提取方法具有很多缺點。預防原發性肝癌的樹莓提取方法，其組成包括在成熟季節摘取新鮮樹莓并打碎去渣，將所述的打碎去渣后的樹莓充分攪拌后放入燒杯中并置于冰塊上，在100g樹莓中加入80％的丙酮200ml在預冷的混合器內混合3分鐘，然后使用勻漿器繼續勻漿攪拌2分鐘，取出勻漿液放入接有真空泵的濾過瓶中，濾過瓶上放置有濾過紙，收集濾過物置于旋轉蒸發器中并在50℃條件下旋轉蒸發45分鐘，用去離子水調節到終體積為50ml，置于零下20℃-零下80℃凍存。本發明作為一種提取樹莓的方法。
文檔編號A61K36/73GK101658563SQ20081013700
公開日2010年3月3日 申請日期2008年8月26日 優先權日2008年8月26日
發明者明 劉, 宋文婷, 張春鵬, 林羅強, 趙金璐 申請人:哈爾濱醫科大學