專利名稱：一種與原發性肝癌相關的cdc6基因的單核苷酸多態位點及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種與原發性肝細胞癌相關的CDC6基因的單核苷酸多態位點，本發明還涉及一種檢測該多態位點的方法，以及該多態在預防、輔助診斷與治療原發性肝細胞癌方面的用途。該發明屬于生物技術領域。
背景技術：
原發性肝細胞癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的主要發生地，肝癌的發生率高達十萬分之三十五。近年來肝癌發病率有明顯上升的趨勢，嚴重危害人類的健康與生命安全。
單核苷酸多態性(SNP)是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP可以出現在基因調控區和編碼區，出現在編碼區的SNP可能改變基因的編碼，使蛋白中某個氨基酸發生改變而影響其功能；而出現在基因調控區的SNP則主要影響基因的表達。SNP作為一種穩定遺傳的早期突變，與疾病有著密切的相關性。當一種SNP的頻率在患者明顯超過非患者時，即表明該SNP與疾病關聯，通過比較分析兩者的單倍型和研究連鎖不平衡性，可將基因組中任何未知的致病基因定位。SNP在疾病基因定位中所發揮的作用主要包括一是在疾病定位區域中尋找致病SNP，這種SNP的出現可能直接導致了基因轉錄水平上和翻譯水平上的變化，即改變了基因表達量或者基因產物蛋白質的組成結構，從而導致某種疾病發生或使得個體對某種特殊的環境易感；二是SNP作為一個遺傳標記，與疾病或表型緊密連鎖。
CDC6是一種重要的細胞分裂周期蛋白，其氨基酸序列上存在多個功能域，如在N端有核定位信號、Cyclin A結合域、APC destruction motif等，在C端有核輸出序列等重要功能域(Laurie M.Delmolino，Partha Saha，Anindya Dutta.Multiple Mechanisms RegulateSubcellular Localization of Human CDC6.J biol chem 2001；276(29)26947-26954)。當細胞進入G1期時，CDC6入核并與結合在染色體上的起始位點識別復合物結合，然后募集其他復制起始因子如MCM2～7、Cdt1、Cdc45等形成復制前體(prereplication complex，pre-RC)。在G1末期，CDC6的54、74和106為的絲氨酸殘基被Cyclin A-CDK2磷酸化，磷酸化的CDC6從復制前體中脫離，DNA復制開始。而被磷酸化的CDC6蛋白在其核輸出序列和其他因子的共同“引導”下出核進入到胞漿，并在依賴泛素的途徑被降解，以確保每個細胞周期中DNA只復制一次(Niels Mailand，John F.X.Diffley.CDKs Promote DNAReplication Origin Licensing in Human Cells by Protecting Cdc6 from APC/C-DependentProteolysis.Cell 2005；122(6)915-926)。CDC6作為一種與DNA復制相關的蛋白質，在腫瘤的發生發展中也發揮著重要的作用。越來越多的研究發現CDC6在許多腫瘤如鱗狀宮頸細胞上皮癌等中高表達，因此可以利用CDC6來作為腫瘤發生以及腫瘤分級的標記物(Murphy N，Ring M，Heffron CC，et al.p16INK4A，CDC6，and MCM5predictivebiomarkers in cervical preinvasive neoplasia and cervical cancer.J Clin Pathol2005；58(5)525-534)。
經對現有技術的國內外文獻和專利檢索，至今未見有任何CDC6基因多態性位點與原發性肝癌易感性相關的報道。

發明內容
本發明的目的在于揭示CDC6基因啟動子區的一個單核苷酸多態位點與原發性肝癌的易感性，以及該多態在篩選原發性肝細胞癌易感人群方面的用途。
本發明首先提供一種檢測細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區多態的方法，包括以下步驟(a)確定細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區的SEQ ID NO1所示序列的第266位SNP的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態，即在第266位存在A，在其DNA互補鏈上為T等位位點。
本發明采用的具體方法如下(1)確定CDC6基因啟動子區rs4134994的單核苷酸多態，即SEQ ID NO1所示序列中第266位的核苷酸(標注為S)，分別為A或者G；(2)采用聚合酶鏈式反應—單鏈構象多態性的分子生物學技術檢測樣品中上述位置是否存在單核苷酸多態及其類型。
本發明的第二方面是提供一種分離核酸，具有SEQ ID NO1所示的序列，且第266位為A。
SEQ ID NO1AIAATTCCCTCCCCATGATGTGTGGATTAATGGTAAGAAGATGCACAGAACATAATATTC 60TTAGGTTGAACGAAATAAAAGTAAAGAGTTGGCTCTGTTTCTCACCTTTGAAGCACAAAT 120CAAGAGATACTATGATGAAGCATAGTTTTTCTTTATATAGGTGTGTAGAACTTTACCATA 180AAAATCACTAGTTCAGCCATCAGGAGATCTGGATCCTAGGCTCTTCACTGTCACCAAGAT 240GCTGTGACCTCTAACCTTGTATAGASGTTTGCTTTGTACTTTGCGAGGTTGAGCATTAGA 300GAGGTAAGGAAAGTGCCTAGCATCATACCTGGCGCACAGAACCCAAAACGGTAGGTATCA 360TGTAGCAGTTCTGAAAATCTAGCCCATCAGGATGATGCAAATGGGTACTTTAGGCAGTGA 420GAAGGGGAACCACATCTTGACACTTCCAGTCGAAGGAAGAGTGCGACTGCGCGGCAGCAA 480AGACTACGCCTCCCAGCGTGCTTTGCGGCGGGCCGGCCCGCTTTACCCAGAGTCGCCCTG 540CCGCAATCGCGCGTCTTTCCACCGAGGCCCCGGATGTAGATTCCCTCCCCCGTTCAGTGG 600TCGTGGCCTCACAGCGACTCTAAGACTTGGGGCTCTCTCATTGGCTGTAACTCTTCCACT 660GGATTGGTAGCAAAAAAAGAGGCGGTGCCCAAGGCGAAAGGCTCTGTGACTACAGCCAAT 720CAGAATCGAGGCCGGGCTTTGGCGGGAGGTGGGAACGCTGTGGCCATTCGGATTTGGCGC 780本發明的第三個方面提供了一種等位基因特異性的核酸引物，具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所示序列，且特異性地擴增出含細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區的SEQ ID NO1所示序列中第266位單核苷酸多態的擴增產物。
優選的核酸引物的序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所示，長度各為22bp，能特異性的擴增出SEQ ID NO1所示的序列，該序列包含rs4134994單核苷酸多態。
本發明的第四個方面還提供了一種診斷原發性肝細胞癌的試劑盒，包括(a)具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的序列，且特異性擴增細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區DNA片段的引物對；(b)檢測擴增產物與正常的細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區相比是否存在變化所需的試劑，即所述的SEQ ID NO1所示序列中第266位單核苷酸多態。
利用本發明所提供的與原發性肝細胞癌相關的其多態位點的核酸序列，可構建對原發性肝細胞癌易感人群進行遺傳學篩選的試劑盒；將其作為藥物設計的靶點，找出具有調節CDC6基因表達的活性分子，從而促進新的抗腫瘤藥物的發現。


圖1為測序結果圖。
具體實施例方式
以下結合具體實施例，來進一步說明本發明。需要注意的是，以下實施例只用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1收集血液樣本及提取基因組DNA從廣州中山大學附屬腫瘤醫院采集到散發性的原發性肝細胞癌患者標本514份，平均年齡48.6±11.8歲(標準差)，其中44例為女性。所有病例均為在該腫瘤醫院就診的患者，按照世界衛生組織標準確診為原發性肝細胞癌。對照樣本為來自廣東省無血緣關系的健康個體509例，平均年齡46.2±14.0歲(標準差)，其中包括女性標本45例。
用常規方法從上述收集到的血液標本中分離出白細胞，并用酚氯仿法提取白細胞基因組DNA后，將樣品DNA統一稀釋為10ng/ul，作為DNA模板。
實施例2設計核苷酸引物序列，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增PCR反應在MJ PTC-200PCR儀器上進行。
PCR反應體系及程序如下每個樣品進行一個總體積為20ul體系的擴增反應，體系中包含制備的基因組DNA稀釋液20ng，10×Taq Buffer 2ul，5mM dNTP 0.8ul，25mM MgCl21.6ul，0.25個單位的Taq DNA聚合酶和擴增引物(稀釋至10uM)各0.5ul，最后加入ddH2O將總體積配為20ul。反應在94℃預變性2分鐘后，進行35個94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒的擴增循環，最后進行72℃6分鐘的補平。
擴增引物如下正向引物5′-CTAGGCTCTTCACTGTCACCAA-3′(SEQ ID NO2)反向引物5′-GACTGGAAGTGTCAAGATGTGG-3′(SEQ ID NO3)擴增后得到了CDC6基因啟動子區236bp包含單核苷酸多態rs4134994的DNA序列。
實施例3對擴增得到的DNA序列進行單核苷酸多態分型對實施例2中所得到的產物，采取單鏈構象多態性(SSCP)進行基因多態分型。具體方法為1μl PCR產物加4μl上樣緩沖液(98％去離子化甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.1％二甲苯青，0.1％溴酚藍)，95℃變性10分鐘，置冰上2分鐘，迅速點樣4μl于10％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc∶Bis＝37.5∶1)中，置4℃冰箱中電泳。1.5W恒功率電泳10小時，銀染顯色。對SSCP的結果進行測序驗證，共發現GG、AG、AA三種基因型，部分測序結果見圖1。
實施例4CDC6基因啟動子區單核苷酸多態位點rs4134994與原發性肝細胞癌的相關性分析統計方法利用GDA(//hydrodictyon.eeb.uconn.edu/people/plewis/software.php)進行模擬次數為10000次的卡方分析，計算健康人群對照組標本的Hardy-Weinberg平衡。運用SPSS13.0專業統計學軟件的卡方分析，對肝癌組和對照組標本中多態位點的基因型分布頻率進行統計學分析，置信區間設定位95％(即95％CI)，統計學的顯著性差異水平設定為p＜0.05，同時計算Odds Ratio(OR)值。統計結果如下健康對照組標本和原發性肝細胞癌病人組的rs4134994多態位點基因型及等位位點分布頻率如下表所示

根據上表分布頻率，對照組標本的基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。從上表可見，位于CDC6基因啟動子區的單核苷酸多態性位rs4134994的A等位位點，在原發性肝細胞癌患者群體中的分布頻率顯著性大于其在健康對照組群體中的分布頻率(P＝0.003)，因此是原發性肝細胞癌易感的一個標志性位點。該位點的基因型為A/A時，受試者對原發性肝細胞癌易感；而該位點的基因型為A/G或G/G時，受試者對原發性肝細胞癌較為不易感。這一多態性位點位于CDC6基因的啟動子部位，該多態的改變可能會影響轉錄因子與啟動子的結合，從而影響CDC6基因的轉錄水平，進而影響細胞的增殖。
實施例5檢測試劑盒制備檢測原發性肝細胞癌易感性的試劑盒，其中含有下列寡聚核苷酸引物對，用于從檢測對象的基因組樣本中特異性擴增包含有CDC6基因啟動子區單核苷酸多態位點rs4134994的基因組片斷。
正向引物5′CTAGGCTCTTCACTGTCACCAA 3′(SEQ ID NO2)反向引物5′GACTGGAAGTGTCAAGATGTGG 3′(SEQ ID NO3)本發明具有實用性的例證(1)本發明所建立的方法可以快速簡便地檢測位于17q21區域CDC6基因啟動子區單核苷酸多態性位點rs4134994的基因型，通過檢測A等位基因的有無判斷個體是否具有原發性肝細胞癌易感性，從而有利于原發性肝細胞癌的預防和治療；(2)利用rs4134994的A等位位點作為藥物設計靶點進行藥物的篩選，篩選出能夠調節CDC6基因表達水平的活性分子，促進新的抗腫瘤藥物的發現；(3)利用本發明提供的引物序列可以特異、高效的檢測出SEQ ID NO1所示的序列中第266位的多態性位點。
(4)利用本發明提供的腫瘤相關基因單核苷酸多態性的序列，構建對原發性肝細胞癌進行遺傳學診斷的試劑盒；(5)由于CDC6基因參與了與惡性增殖、凋亡等細胞活動失調相關的病理過程，因此本發明對今后深入研究CDC6與其他疾病的關系提供了經驗和應用基礎。
序列表<110>中山大學<120>一種與原發性肝癌相關的CDC6基因的單核苷酸多態位點及其應用<160>3<210>1<211>780<212>DNA<213>人類<220>
<221>(266)<223>n＝a或g<400>1ataattccct ccccatgatg tgtggattaa tggtaagaag atgcacagaa cataatattc60ttaggttgaa cgaaataaaa gtaaagagtt ggctctgttt ctcacctttg aagcacaaat120caagagatac tatgatgaag catagttttt ctttatatag gtgtgtagaa ctttaccata180aaaatcacta gttcagccat caggagatct ggatcctagg ctcttcactg tcaccaagat240gctgtgacct ctaaccttgt atagangttt gctttgtact ttgcgaggtt gagcattaga300gaggtaagga aagtgcctag catcatacct ggcgcacaga acccaaaacg gtaggtatca360tgtagcagtt ctgaaaatct agcccatcag gatgatgcaa atgggtactt taggcagtga420gaaggggaac cacatcttga cacttccagt cgaaggaaga gtgcgactgc gcggcagcaa480agactacgcc tcccagcgtg ctttgcggcg ggccggcccg ctttacccag agtcgccctg540ccgcaatcgc gcgtctttcc accgaggccc cggatgtaga ttccctcccc cgttcagtgg600tcgtggcctc acagcgactc taagacttgg ggctctctca ttggctgtaa ctcttccact660ggattggtag caaaaaaaga ggcggtgccc aaggcgaaag gctctgtgac tacagccaat720cagaatcgag gccgggcttt ggcgggaggt gggaacgctg tggccattcg gatttggcgc780<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述正向引物
<400>2ctaggctctt cactgtcacc aa 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述反向引物<400>3gactggaagt gtcaagatgt gg 2權利要求
1.種檢測細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區多態的方法，包括以下步驟(c)確定細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區的SEQ ID NO1所示序列的第266位SNP的核苷酸；(d)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態，即在第266位存在A，在其DNA互補鏈上為T等位位點。
2.一種分離核酸，具有SEQ ID NO1所示的序列，且第266位為A。
3.一種等位基因特異性的核酸引物，具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所示序列，且特異性地擴增出含細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區的SEQ IDNO1所示序列中第266位單核苷酸多態的擴增產物。
4.按權利要求3所述的一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于所述的核酸引物的序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所示。
5.一種原發性肝細胞癌診斷試劑盒，包括(a)具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的序列，且特異性擴增細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區的引物對；(b)檢測擴增產物與正常的細胞分裂周期蛋白CDC6基因啟動子區相比是否存在變化所需的試劑，即所述的SEQ ID NO1所示序列中第266位單核苷酸多態。
6.按權利要求5所述的原發性肝細胞癌診斷試劑盒，其特征在于所述的引物對的序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。
全文摘要
本發明公開了一種與原發性肝細胞癌相關的位于CDC6基因的多態位點(rs4134994)及其應用。本發明還提供了一種檢測該多態位點及其與原發性肝細胞癌易感性的方法。利用本發明提供的多態位點的核酸序列及其檢測方法，可生產對原發性肝細胞癌進行遺傳學診斷的試劑盒，有助于原發性肝細胞癌的預防、早期診斷和治療。
文檔編號C12N15/11GK101033489SQ20071002666
公開日2007年9月12日 申請日期2007年2月1日 優先權日2007年2月1日
發明者莊詩美, 熊興東, 程家森, 楊金娥 申請人:中山大學