專利名稱：：miRNA在預測早期原發性肝癌病人術后復發的應用及其試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于預測早期原發性肝癌病人術后肝癌復發的試劑盒，屬于生物醫學診斷領域。
背景技術：
：肝癌是我國第二大癌癥死因，根治性手術是目前主要治療手段。部分肝癌病人因早期發現、早期診斷、早期綜合治療而獲得長期生存。然而肝癌根治性切除后5年轉移復發率為61.5%，即使小肝癌也達43.5%，肝癌轉移復發已成為進一步提高肝癌治療效果的最主要障礙。若能對肝癌早期患者術后進行轉移復發的預測，及時給予干預治療，有利于提高患者生存率，具有一定的社會效益和經濟效益。目前臨床尚無足夠敏感和特異的預測指標來預測肝癌患者術后轉移復發的情況，甲胎蛋白、腫瘤大小，包膜有無等雖與轉移復發有關但總體來說其預測準確率還很低。近年來研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)作為一類新型調節因子在腫瘤的發生發展中起重要作用。應用基因芯片或實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術對raiRNA表達譜研究發現miRNAs可有助于多種癌癥的分型和預后判斷。腫瘤及其轉移特異相關的miRNAs的鑒定和其表達閾值的確定屬于腫瘤分子標記物預測診斷的應用范疇。早期肝癌病人如能對其術后復發情況進行早診預測，采取適當的干預治療，將十分有利于改善其預后生存。
發明內容本發明的目的是提供一種試劑盒，用于預測早期原發性肝癌病人術后肝癌復發。為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供一種用于預測早期原發性肝癌病人術后肝癌復發的試劑盒，其特征在于，由反轉錄系統、擴增系統和引物探針系統組成，其中，反轉錄系統由反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成，擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，引物探針系統由has-miR-34a莖環結構引物、has-miR-34a擴增引物、has-miR-34a熒光標記探針、RNU6B莖環結構引物、RNU6B擴增引物和RNU6B熒光標記探針組成。本發明通過以下方法證明確定了has-miR-34a為早期原發性肝癌轉移復發的分子標志物1、組織總RNA的抽提和純化收集91例在復旦大學肝癌研究所進行腫瘤根治性切除手術原發性肝癌病人進行研究。將冰凍的肝癌及癌周組織放于液氮中，砸成粉末狀，應用Ambion公司mirVanaraiRNA分離試劑盒，提取組織中富含小分子RNA(《200bp)的總RNA。使用DU800紫外分光光度計測定RNA的A260值(波長為260納米的吸光度值)和A260/A280的比值(1.9-2.1)，以評估其濃度和質量，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。符合定量檢測要求的樣本置于-8(TC保存備用。2、has-miR-34ac腿的合成將0.15ti1lOOraM脫氧核糖核苷酸混合物(dNTPs)，1.00y150U/uL反轉錄酶，1.50ul10X反轉錄體系緩沖液，0.19ul20U/iiLRNA酶抑制劑，4.16"1無核酸酶水，3.00u1miRNA莖環結構引物，和組織樣本模板RNA5.00u1(總量為50ng)充分混合均勻，冰上孵育5分鐘。miRNA反轉錄反應程序如下16°C，30分鐘；42°C，30分鐘；85°C，5分鐘。所用試劑組分來源于TaqMa，MicroRNA反轉錄試劑盒(AppliedBiosystems公司，USA)。3、has-miR-34a實時定量PCR的檢測將L00iilhas-miR-34a20X擴增引物和TaqmanMGB(MinorGrooveBinder,一種非熒光淬滅基團)標記探針，與10.OOul基因表達定量檢測混合液(TaqMar^Geneexpressionmastermix,AppliedBiosystems公司，USA)混合，力口入l:100稀釋的反轉錄產物9ul。miRNA實時定量PCR反應程序如下95。C,10分鐘；95。C15秒；60°C,60秒(40個循環)。實驗選取RNU6B為內參，RNU6B的檢測使用與hasiiR-34a相同的反轉錄和定量PCR反應體系以及RNU6B的引物和探針系統。4、has-miR-34a在早期原發性肝癌病人術后復發情況分析通過2-AACt法計算has-miR-34a在腫瘤及瘤旁組織中的表達量，并計算兩者的比值(表示該小分子在病人機體內的動態差異)。如圖1所示，為has-miR-34a在三年內復發與未復發的早期原發性肝癌病人中的相對表達水平，兩獨立樣本非參數檢驗發現，術后三年內復發的病人其has-miR-34a上調表達水平明顯高于術后未復發的病人(/M).023)。接受者操作特性曲線(ROC曲線)分析獲得閾值為1.27，高于1.27的病人定為高水平表達，低于1.27的病人定為低水平表達。高水平病人明顯復發率升高(f0.003)。如圖2所示，a線為has-miR-34a對早期原發性肝癌病人復發預測情況(代O.05)，曲線下面積為0.661，b線為參考線，檢測靈敏度(復發組高表達率)為79.8%。Kaplan-Meier生存和復發分析如圖3所示，為hasiiR-34a的無瘤生存曲線(/M).0Q3)，其中a線為高表達組，b線為低表達組，has-miR-34a上調表達與病人總生存情況無關(盧0.324)，而與復發(無瘤生存)密切相關(ZM).003)。Cox風險比例模型多因素分析表明has-miR-34a是術后無瘤生存(術后復發)差的獨立相關因子(尸=0.008，HR(HazardRatios,危險度)=3.25,95%C.I(ConfidenceInterval,可信區間)=1.37-7.7。與性別，有無包膜，及AFP(甲胎蛋白)指數無關。Cox比例風險模型(多因素)分析has-miR-34a術后復發關系見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發明首次選取腫瘤、淋巴結、轉移分期系統(T醒)I期早期原發性肝癌病人為研究對象，這類早期病人如能進行術后復發情況的預測，將有助于術后治療方案的確定，改善病人預后狀況；首次通過miRNA實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)的方法在肝癌中對has-miR-34a的表達水平進行檢測，進一步驗證has-miR-34a與早期原發性肝癌的復發轉移的關聯性，并與臨床隨訪相結合，為肝癌轉移復發、預后預測提供可信的分子標志物；所提供的試劑盒及其步驟專門針對于肝組織miRNA的檢測優化，結果準確可靠。本發明的優點為(1)本發明確定的miRNA與肝癌轉移復發有密切的關系，能夠作為生物指標對早期肝癌病人術后復發進行預測，為臨床個體化干預治療提供有效的依據。(2)通過實時定量PCR技術對原發性肝癌病人的組織水平miRNA的檢測，定量準確。相對于芯片技術或者分子雜交(NorthernBlot)，該方法簡便、快速且經濟實用。(3)可能與其他分子指標相結合，為原發性肝癌復發診斷、預后預測提供新的綜合性試劑盒，方便于臨床應用。圖1為has-miR-34a在三年內復發與未復發的早期原發性肝癌病人中的表達情況圖；圖2為hasiiR-34a對早期原發性肝癌病人復發預測情況圖；圖3為has-miR-34a的無瘤生存曲線圖。具體實施例方式實施例l一種用于預測早期原發性肝癌病人術后肝癌復發的試劑盒，由反轉錄系統、擴增系統和引物探針系統組成，其中，反轉錄系統由反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成，擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，引物探針系統由has-miR-34a莖環結構引物、has-miR-34a擴增引物、has-miR-34a熒光標記探針、RNU6B莖環結構引物、RNU6B擴增弓i物和RNU6B熒光標記探針組成。應用該試劑盒來預測早期原發性肝癌病人手術后肝癌復發情況的具體方法如下1、組織總RNA的抽提將早期原發性肝癌病人進行手術后保存的肝癌及癌周組織放于液氮中，砸成粉末狀，應用Ambion公司mirVanaTMmiRNA分離試劑盒，提取組織中富含小分子RNA(《200bp)的總RNA。使用DU800紫外分光光度計測定RNA的A260值和A260/A280的比值，以評估其濃度和質量，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。符合定量檢測要求的樣本進行下一步反應。2、has-miR-34acDNA的合成將0.15ullOOmM脫氧核糖核苷酸混合物(dNTPs)，1.00yl50U/uL反轉錄酶，L50ul10X反轉錄體系緩沖液，0.19ul20U/uLRNA酶抑制劑，4.16ixl無核酸酶水，3.00u1has-miRNA-34a莖環結構引物，和模板RNA5.00"1(總量為50ng)充分混合均勻，冰上孵育5分鐘。miRNA反轉錄反應程序如下16°C，30分鐘；42°C，30分鐘；85°C，5分鐘。所用試劑組分來源于TaqManMicroRNA反轉錄試劑盒(AppliedBiosystem公司，USA)3、has-miR-34a實時定量PCR的檢測將1.OOii1has-miRNA-34a(20X)擴增引物和TaqmanMGB(MinorGrooveBinder,一種非熒光淬滅基團)標記探針，與10.00u1含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液(TaqManGeneexpressionmastermix,AppliedBiosystems公司,USA)混合，力口入1:100稀釋的反轉錄產物9u1。miRNA實時定量PCR反應程序如下95°C,10分鐘；95°C15秒；60°C，60秒(40個循環)。實驗選取RNU6B為內參。RNU6B的檢測使用與has-miR-34a相同的反轉錄和定量PCR反應體系以及RNU6B的引物和探針系統。4、has-miR-34a在早期原發性肝癌病人術后復發預測分析通過2-AACt法計算has-miR-34a在腫瘤及瘤旁組織中的表達量，并計算兩者的比值(表示該小分子在病人機體內的動態差異)。高于1.27的病人定為高水平表達，低于1.27的病人定為低水平表達。通過該比值判斷病人術后三年內發生肝癌復發的風險。觀測該小分子表達變化趨勢，如果低水平表達則提示患者復發風險相對低，輔助治療應適量進行。高水平病人提示二年內復發風險偏高，術后需加強監測，適當加以輔助治療。權利要求1.一種用于預測早期原發性肝癌病人術后肝癌復發的試劑盒，其特征在于，由反轉錄系統、擴增系統和引物探針系統組成，其中，反轉錄系統由反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成，擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，引物探針系統由has-miR-34a莖環結構引物、has-miR-34a擴增引物、has-miR-34a熒光標記探針、RNU6B莖環結構引物、RNU6B擴增引物和RNU6B熒光標記探針組成。全文摘要本發明提供了一種用于預測早期原發性肝癌病人術后肝癌復發的試劑盒，包括反轉錄系統、擴增系統和引物探針系統，反轉錄系統由反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成，擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，引物探針系統包含has-miR-34a莖環結構引物、has-miR-34a擴增引物和熒光標記探針以及RNU6B莖環結構引物、RNU6B擴增引物和熒光標記探針。本發明檢測定量準確，簡便、快速且經濟實用，且可進一步與其他分子指標相結合，為早期原發性肝癌復發診斷、預后預測提供綜合性分子標記試劑盒，方便于臨床應用。文檔編號C12Q1/68GK101418343SQ20081020436公開日2009年4月29日申請日期2008年12月10日優先權日2008年12月10日發明者周海軍,董瓊珠,賈戶亮,越趙,欽倫秀申請人:復旦大學附屬中山醫院;復旦大學生物醫學研究院