專利名稱：基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測試劑盒， 屬于生物技術領域。
背景技術：
原發性肝細胞癌(簡稱肝癌)是我國第二位癌癥死因，手術是目前早期肝癌主要的治 療手段，然而術后高轉移復發率(5年復發率達 70%)已成為進一步提高遠期療效的瓶 頸，也是攻克肝癌的重要關鍵。若能對肝癌根治術后的特定人群進行早期轉移復發的預測， 及時給予干預治療，做到早發現早治療，會進一步提高根治性術后復發患者的生存率，也 會有重大的社會效益和經濟效益，探索具有診斷價值的新型簡易生物標記物必將極大延長 肝癌患者術后生存時間。
癌周微環境蛋白或基因表達對腫瘤發生及進展中的作用成為腫瘤研究的熱點。許多研 究也顯示癌周免疫因子的表達失衡與多種腫瘤進展相關，迄今已發現多種基因表達可以作 為腫瘤預后預測指標。然而，肝癌方面目前臨床尚無足夠敏感和特異的預測指標來預測肝 癌術后患者的轉移復發以及生存情況，甲胎蛋白、腫瘤大小，包膜有無等雖與轉移復發有 關但總體來說其預測準確率還很低。葉青海等應用含有9180個基因的細胞DNA芯片，研究 40例伴或不伴肝內轉移的原發性肝癌原發瘤的基因表達譜，建立能準確區分有無肝內轉移 的153個基因的分子預測模型，初步準確性90%。目前此模型由于涉及指標較多，較難臨床 應用，在此基礎上進一步探索17個免疫相關基因癌周表達水平可以預測肝癌預后。目前， 如何優化現有預測指標指導肝癌治療仍然面臨巨大挑戰。實時熒光定量多聚酶鏈式反應 (PCR)技術有著成熟穩定，檢測準確性高的特點，已經成為分子及細胞生物學研究的常 規手段，在肝癌轉移及復發預測方面有很重要的應用價值。肝癌手術患者大多屬于早期， 而預后判斷的難點也在于此類病人，探索和開發具有預后生物標記物應用前景十分廣闊。

發明內容
本發明的目的是提供一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測 試劑盒。
為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病 人術后轉移復發的預測試劑盒，其特征在于，包括白介素2擴增檢測試劑、內參基因擴增檢測試劑、正常肝組織對照品、陰性對照品、陽性對照品、無RNA酶水；
其中，所述白介素2擴增檢測試劑由5-15mmol/L三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽、2. 0-3. 0mM 氯化鎂，0. 3-0. 4pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0. 05-0. 15U/Taq酶,0. 3-0. 4pmol熒光 標記白介素2自身淬滅探針及引物，10-30u/ulRNA酶抑制劑和水組成；
內參基因擴增檢測試劑由5-15mmol/L三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽、2. 0_3. 0mM氯化鎂， 0. 3-0. 4pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0. 05-0. 15U/Taq酶，0. 3-0. 4pmol熒光標記3-磷 酸甘油醛脫氫酶基因自身淬滅探針及引物，10-30u/ulRNA酶抑制劑和水組成；
正常肝組織對照品為正常無癌肝組織cDNA;
陰性對照品為無mRNA水；
陽性對照品為正常人白細胞介素2mRNA樣品；
無RNA酶水由以下方法制備將去離子水經O. lvoP/。焦炭酸二乙酯處理10-12小時， 110-130攝氏度高壓滅菌20-35分鐘。
本發明通過探針法多聚酶鏈反應檢測癌周肝臟組織白細胞介素2信使核糖核酸(以下 簡稱白細胞介素信使核糖核酸)的表達，發現Thl型細胞因子，特別是白細胞介素2信使核 糖核酸作為一種可預測原發性肝癌病人手術后肝癌轉移復發的生物標記物，可以成為早期 發現肝癌轉移復發的篩查試劑，用于發展成包含該細胞因子的診斷試劑盒。
上述試劑盒可用來預測早期原發性肝癌病人手術后肝癌轉移復發，特別針對早期肝癌 病人，其中早期定義為手術時單個腫瘤，無肉眼及鏡下癌拴，無遠處轉移。其具體步驟為 收集早期肝癌患者癌周正常組織(病理學檢驗證實無脈管內癌拴)和作為對照的8例無肝 癌正常肝組織，攝氏-80度，低溫保存。應用分子生物學常規方法抽提25mg組織總核糖核 酸，在液氮中將25mg組織碾磨成粉末，趁液氮尚未揮發光時，將粉末轉移到1.5ml離心管 中，力tU.0ml的Trizol試劑(購自美國Invitrogen (英杰)生命技術有限公司)，充分混 勻放置15分鐘，后加入200ul三氯甲垸，4'C， 12000轉/分鐘離心15分鐘，吸取上清，加入 500ul異丙醇沉淀后，依商品說明進行得到總RNA，分光光度儀檢測濃度。
2ug總RNA通過常規逆轉錄得到cDNA。正常組織通過同樣方法獲得相應cDNA，后混合 8例樣品，形成正常對照品。所有常規試劑均有商品化試劑。應用實時熒光定量PCR儀 (ABI7900HT)檢測白細胞介素2表達水平，GAPDH作為樣品內參照。
所有探針引物均選用美國國立醫學圖書館(NCBI)基因數據庫(Genbank)人類IL2及 GADPH信使核糖核酸序列為模版設計。
以正常對照品基因表達水平作為衡量標準，肝癌病人白細胞介素2信使核糖核酸表達量除以此標準，從而確定肝癌病人白細胞介素2信使核糖核酸相對于正常人的表達比例， 其中大于或等于1為增高，小于1為降低，白細胞介素2信使核糖核酸表達增高的肝癌病 人術后2年內極易出現轉移或復發及死亡。
本試劑盒每次檢測均需設置陽性及陰性對照。
本試劑盒于零下20度可穩定儲存1年，避免反復凍融。
試劑盒預測效果在66例患者的癌周組織中白細胞介素2信使核糖核酸能較準確地 預測肝癌患者術后的轉移復發，白細胞介素2信使核糖核酸還可以預測肝癌患者術后的生 存或死亡。如圖1和圖2所示，癌旁組織白細胞介素信使核糖核酸、表達不同的患者有著 顯著不同的預后(p〈0.05)，其中，圖1中曲線l表示白細胞介素高表達，曲線2表示白 細胞介素低表達，圖2中曲線1表示白細胞介素高表達，曲線2表示白細胞介素低表達。 本發明具有以下優點
1. 本發明首次提出白細胞介素2信使核糖核酸單獨或與其它臨床指標組合可成為肝癌 預后診斷的主要指標。
2. 白細胞介素2信使核糖核酸水平作為預測指標明顯優于目前用于預測肝癌患者術 后復發和生存的臨床指標，如甲胎蛋白、腫瘤大小，包膜有無等，而且測定此基因表達水 平簡單易行可靠。


圖1為白細胞介素2信使核糖核酸的無瘤生存曲線圖； 圖2為白細胞介素2信使核糖核酸的總生存曲線圖。
具體實施例方式
下面結合實施例來具體說明本發明。
實施例l
一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測試劑盒，包括白介素2 擴增檢測試劑、內參基因擴增檢測試劑、正常肝組織對照品、陰性對照品、陽性對照品、 無RNA酶水；
其中，所述白介素2擴增檢測試劑由10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、2. 5mM氯化鎂， 0.35pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0. 10U/Taq酶，0. 35pmol熒光標記白介素2自身淬滅 探針及引物，20u/ulRNA酶抑制劑和水組成；
內參基因擴增檢測試劑由10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、2.5mM氯化鎂， 0. 35pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0. 10U/Taq酶，0. 35pmol熒光標記3-磷酸甘油醛脫氫酶基因自身淬滅探針及引物，20u/ulRNA酶抑制劑和水組成； 正常肝組織對照品為正常無癌肝組織cDNA; 陰性對照品為無mRNA水； 陽性對照品為正常人白細胞介素2mRNA樣品；
無RNA酶水由以下方法制備將去離子水經O. 1% (v/v)焦炭酸二乙酯處理ll小時，120 攝氏度高壓滅菌30分鐘。
早期肝癌患者于首次手術時，留取癌旁正常肝臟組織，攝氏-80度保存。參照分子生 物學常規方法，依商品化RNA抽提試劑及逆轉錄試劑說明抽提25mg癌旁正常肝臟組織 總RNA,逆轉錄生成cDNA產物。 試劑盒使用步驟
1. 吸取2ul上述逆轉錄產物后加入10ul本試劑盒中白介素2擴增檢測試劑，后用試劑盒 提供無核糖核酸酶水補至25ul;備用，此混合物最好于12小時內使用。
2. 同時吸取2ul相同逆轉錄產物加入試劑盒提供內參基因擴增檢測試劑10ul，后用試劑 盒提供無核糖核酸酶水補至25ul，備用；試劑盒內陽性對照品及陰性對照品分別吸取2ul 分別與10ul白介素2擴增檢測試劑混合，后用試劑盒提供無核糖核酸酶水補至25ul。上 述混合液，均按相同步驟操作，加入96孔板中，每份肝臟組織樣品設置三次重復對照。 上好樣品的96孔板，應用美國應用系統生物公司ABI7900實時熒光定量儀擴增，條件為 95'C10分鐘；95'C15秒、60°C1分鐘共40循環。相同操作條件檢測試劑盒內正常肝組織 對照品白細胞介素2表達量。根據循環數相對定量法計算癌旁白細胞介素2信使核糖核酸 表達，與正常對照品表達比較，確定上述基因表達變化趨勢，表達降低則提示患者預后較 差，術后需加強監測，適當加以輔助治療；表達增高提示患者預后較好，術后2年內不易 復發。
實施例2
一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測試劑盒，包括白介素2 擴增檢測試劑、內參基因擴增檢測試劑、正常肝組織對照品、陰性對照品、陽性對照品、 無RNA酶水；
其中，所述白介素2擴增檢測試劑由5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、2. OmM氯化鎂， 0.3pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0.05U/Taq酶，0. 3pmol熒光標記白介素2自身淬滅探 針及引物，10u/ulRNA酶抑制劑和水組成；
內參基因擴增檢測試劑由5腿ol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、2.0mM氯化鎂，
60. 3ptnol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0. 05U/Taq酶，0. 3pmol熒光標記3-磷酸甘油醛脫氫酶 基因自身淬滅探針及引物，10u/ulRNA酶抑制劑和水組成；
正常肝組織對照品為正常無癌肝組織cDNA;
陰性對照品為無mRNA水；
陽性對照品為正常人白細胞介素2mRNA樣品；
無RNA酶水由以下方法制備將去離子水經O. lvoW焦炭酸二乙酯處理10小時，IIO攝 氏度高壓滅菌20分鐘。 操作步驟同實施例l。
實施例3
一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測試劑盒，包括白介素2 擴增檢測試劑、內參基因擴增檢測試劑、正常肝組織對照品、陰性對照品、陽性對照品、 無RNA酶水；
其中，所述白介素2擴增檢測試劑由15mmol/L三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽、3. OmM氯化鎂， 0.4pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0. 15U/Taq酶，0. 4pmol熒光標記白介素2自身淬滅探 針及引物，30u/ul腦A酶抑制劑和水組成；
內參基因擴增檢測試劑由15mmol/L三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽、3.0mM氯化鎂， 0. 4pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0. 15U/Taq酶，0. 4pmol熒光標記3-磷酸甘油醛脫氫酶 基因自身淬滅探針及引物，30u/ulRNA酶抑制劑和水組成；
正常肝組織對照品為正常無癌肝組織cDNA;
陰性對照品為無mRNA水；
陽性對照品為正常人白細胞介素2mRNA樣品；
無RNA酶水由以下方法制備將去離子水經O. lvoW焦炭酸二乙酯處理12小時，130攝 氏度高壓滅菌35分鐘。 操作步驟同實施例1。
權利要求
1. 一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測試劑盒，其特征在于，包括白介素2擴增檢測試劑、內參基因擴增檢測試劑、正常肝組織對照品、陰性對照品、陽性對照品、無RNA酶水；其中，所述白介素2擴增檢測試劑由5-15mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、2.0-3.0mM氯化鎂，0.3-0.4pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0.05-0.15U/Taq酶，0.3-0.4pmol熒光標記白介素2自身淬滅探針及引物，10-30u/ulRNA酶抑制劑和水組成；內參基因擴增檢測試劑由5-15mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、2.0-3.0mM氯化鎂，0.3-0.4pmol/ul三磷酸脫氧核糖核苷酸，0.05-0.15U/Taq酶，0.3-0.4pmol熒光標記3-磷酸甘油醛脫氫酶基因自身淬滅探針及引物，10-30u/ulRNA酶抑制劑和水組成；正常肝組織對照品為正常無癌肝組織cDNA；陰性對照品為無mRNA水；陽性對照品為正常人白細胞介素2mRNA樣品；無RNA酶水由以下方法制備將去離子水經0.1vol％焦炭酸二乙酯處理10-12小時，110-130攝氏度高壓滅菌20-35分鐘。
全文摘要
本發明提供了一種基于免疫分子的早期原發性肝癌病人術后轉移復發的預測試劑盒，其特征在于，包括白介素2擴增檢測試劑、內參基因擴增檢測試劑、正常肝組織對照品、陰性對照品、陽性對照品、無RNA酶水。本發明的白細胞介素2基因信使核糖核酸表達量作為標志物，明顯優于目前用于預測肝癌患者術后復發和生存的臨床指標，可以作為早期肝癌患者預后判斷生物標記物。
文檔編號C12Q1/68GK101481732SQ20081020436
公開日2009年7月15日 申請日期2008年12月10日 優先權日2008年12月10日
發明者炯 史, 葉青海, 周海軍, 賈戶亮, 欽倫秀 申請人:復旦大學附屬中山醫院;復旦大學生物醫學研究院