一種用于鑒別cva6和非cva6腸道病毒的rt-pcr引物對及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供的一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，包括：上游引物序列為：5’-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’；下游引物序列為：5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’；其中R為A或G，M為A或C。本發明還提供了一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的雙重一步法引物，包括權利要求1所述的RT-PCR引物對以及腸道病毒通用引物。應用本發明提供的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，能夠實現一次性完成CVA6型與非CVA6型腸道病毒相關基因的擴增，顯著提高CVA6型與非CVA6型手足口病的檢測效率，敏感性好、特異性高。
【專利說明】—種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于病毒核酸檢測領域，特別涉及一種用于單管二重一步法鑒別手足口病病原CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，還涉及該利用該引物的應用。
【背景技術】
[0002]手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的急性傳染病，主要發生于3歲以下兒童，臨床表現為手、足、口腔等部位的皰疹。2012中國疾病控制中心公布全國共發生手足口病2198442例，死亡709人。引起手足口病的腸道病毒有多種，如柯薩奇病毒A組的16、4、6、10、12,柯薩奇病毒B組的2、3、5,埃可病毒的4、19、30,以及腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)等。在我國，根據以往的流行病學監視，EV71和CVA16是引起手足口病爆發的主要病原，在不同年份、不同地點循環反復出現，但2011年9-12月其他腸道病毒構成明顯增加。Yang F等對中國不同地區手足口病進行研究，發現CVA6 (柯薩奇病毒A6型)和其他腸道病毒感染有增加趨勢。Lu QB等人發現腸道病毒CVA6和CVAlO可能成為中國手足口病新的流行病原。2012年8-12月江西九江市爆發手足口病，本實驗室在九江共收集到704 份(每人一份)手足口病咽拭子標本和200份病人血清，通過RT-PCR檢測咽拭子標本，測序證實CVA6感染512份。我國CVA6引起的手足口病正在逐年增多，病情復雜，而且在我國九江地區已出現爆發流行。由于其他地區的人群缺少CVA6的抗體，再加上不同地區的人員流動大，很可能會向其他地區擴散。CVA6已逐漸成為引起手足口病爆發的主要病原之一。
[0003]CVA6感染和其他腸道病毒感染在臨床癥狀上差別較大，CVA6感染患者分布部位廣，均出現手足口和臀部密集的大皰狀皮疹，還可伴指甲脫落和指端皮膚表層脫皮，此外呼吸道癥狀、消化道癥狀、肝功能受損較EV71、CVA16型多，但是心血管和神經系統的損害較少、較輕。早期、快速、簡便、準確地鑒別CVA6型和非CVA6型手足口病，對于積極的臨床救治和疫情防控具有重要意義。
[0004]傳統的病原學診斷采用細胞培養分離和鑒定病毒的手段，耗時且操作復雜，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。分子生物學的進展開拓了腸道病毒的快速診斷技術，特別是PCR技術，由于其具有檢測材料用量少、快速、靈敏度高、特異性好等特點，在病毒感染的診斷中發揮越來越重要的作用。RT-PCR技術已成為手足口病病原體快速診斷的重要手段，市場上已有EV71、CVA16和腸道病毒(EV)的商業化PCR試劑盒，但特異性診斷CVA6的PCR試劑盒尚未出現。此外，只檢測一種病原的RT-PCR，很容易造成其它病原體的漏診；若要同時檢測多種病原，則每個檢測都要單獨進行，要使用多個PCR管，繁瑣費時、試劑消耗大、操作步驟多、容易造成實驗失敗和PCR污染。如能建立一種特異性好、靈敏度高的單管二重一步法RT-PCR，鑒別CVA6型和非CVA6型手足口病，將具有廣泛的應用前景。

【發明內容】
[0005]發明目的:本發明的目的在于提供一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR 引物。
[0006]本發明的第二目的在于提供上述引物在單管二重一步法檢測CVA6和非CVA6腸道病毒中的應用。
[0007]技術方案:本發明提供的一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，包括:
[0008]上游引物序列為:5，-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’；
[0009]下游引物序列為:5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’ ；
[0010]其中R為A或G，M為A或C。
[0011]本發明還提供了一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的雙重一步法引物，包括權利要求1所述的RT-PCR引物對以及腸道病毒通用引物。
[0012]其中，所述腸道病毒通用引物為:
[0013]引物F 序列為:5 ’ -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3 ’ ；
[0014]引物R 序列為:5 ’ -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3，；
[0015]其中，W為A或T。
[0016]本發明還提供了上述用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對在CVA6和非CVA6腸道病毒檢測中的應用。
[0017]本發明還提供了一種包括權利要求1所述的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對的試劑盒。
[0018]有益效果:應用本發明提供的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，能夠實現一次性完成CVA6型與非CVA6型腸道病毒相關基因的擴增，顯著提高CVA6型與非CVA6型手足口病的檢測效率，敏感性好、特異性高。
[0019]利用本發明提供的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的雙重一步法引物，可以對CVA6感染患者的臨床標本擴增出CVA6VP1區域的685bp和腸道病毒5’ UTR基因區域的306bp兩條目的片段，而對非CVA6的其它腸道病毒感染患者的臨床標本只能擴增出腸道病毒5’UTR基因區域的306bp —條目的片段，從而能夠特異性的一次性鑒別出CVA6和非CVA6
腸道病毒。
[0020]具體而言，本發明相對于現有技術具有以下突出的優勢:
[0021](I)本發明提供的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對完全是人工設計的簡并堿基和序列，能夠擴增出來自不同病人、不同標本中CVA6或/和EV，檢測靈敏度聞，特異性好；
[0022](2)本發明提供的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的雙重一步法引物由兩對引物對組成，反應同時在一個PCR管內進行，RNA逆轉錄和DNA擴增同在一個PCR管完成，快速簡便，且工作量比一次性普通RT-PCR少，減少各種操作失誤發生的可能，提高檢測的成功率；可早期有效鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒引起的手足口病；
[0023](3)利用該引物鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒所需耗材和試劑用量顯著少于傳統PCR擴增方法，成本低廉；同時僅需采用普通RT-PCR儀，無需昂貴設備，易于推廣。
【專利附圖】

【附圖說明】[0024]圖1不同引物和模板的一步法的RT-PCR的電泳圖。其中，1_5為以CVA6-037為模板依次采用引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030) R、(I 108) F+ (1030) R 一步法RT-PCR ；6-10為以腸道病毒CVA16型為模板依次采用引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R—步法RT-PCR ;11-15為以腸道病毒EV71型為模板依次采用引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R—步法 RT-PCR。
[0025]圖2不同引物與腸道病毒通用引物(EV F+R)的組合兩步法以及不同引物一步法的RT-PCR的電泳圖。其中，I為引物(I 108)F+(1124) R和EV F+R的組合；2為引物(1108)F+(1124)R ;3 為引物(1124)F+(1108)R 和 EV F+R ;4 為引物(I 124)F+(1108)R ;5 為引物(1124)F+(1124)R 和 EV F+R ;6 為引物(1124)F+(1124)R。
[0026]圖3為單管二重一步法RT-PCR引物的敏感性檢驗電泳圖。其中，1_4分別為以(1108)F+(1124)R 為引物，用濃度依次 1、0.1,0.01,0.001TCID50/mL CVA6-037 病毒液檢測單管二重一步法RT-PCR引物的敏感性；5-8分別為以(I 108)F+(1124)R和EV F+R為引物，用濃度依次1、0.U0.01,0.001TCID50/mL CVA6-037病毒液檢測單管二重一步法RT-PCR引物的敏感性。
[0027]圖4考察引物(I 108) F+(1124) R和EV F+R的不同配比的單管二重一步法電泳圖。其中，I為(I 108) F+(1124) R和EV F+R的體積分別0.25和0.125，CVA6_037病毒的濃度為0.001TCID50/mL ;2 為(1108) F+(1124) R和 EV F+R 的體積分別 0.25 和 0.25，CVA6-037 病毒的濃度為 0.001TCID50/mL ;3 為(1108) F+(1124) R和 EV F+R 的體積分別 0.25 和 0.5，CVA6_037病毒的濃度為 0.001TCID50/mL ;4 為(I 108) F+(1124) R和EV F+R 的體積分別 0.125 和 0.125，CVA6-037病毒的濃度為 0.001TCID5Q/mL ;5 為(1108)F+(1124)R和EV F+R的體積分別0.125和0.25，CVA6-037病毒的濃度為 0.001TCID50/mL ;6為(1108)F+(1124) R和EV F+R的體積分別 0.125 和 0.5，CVA6-037 病毒的濃度為 0.001TCID50/mL ；7 為(1108)F+(1124)R和 EV F+R的體積分別 0.25 和 0.125，CVA6-037 病毒的濃度為 0.0001TCID50/mL ;8 為(1108) F+(1124) R和 EV F+R 的體積分別 0.25 和 0.25，CVA6-037 病毒的濃度為 0.0001TCID50/mL ；9 為(1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的體積分別 0.25 和 0.5，CVA6-037 病毒的濃度為 0.0001TCID50/mL ；10為(I 108)F+(1124)R和EV F+R的體積分別0.125和0.125，CVA6-037病毒的濃度為0.0001TCID5(l/mL ;11 為(1108) F+(1124) R 和 EV F+R 的體積分別 0.125 和 0.25，CVA6_037 病毒的濃度為 0.0001TCID5Q/mL ;12 為(1108) F+(1124) R 和 EV F+R 的體積分別 0.125 和 0.5，CVA6-037 病毒的濃度為 0.0001TCID50/mL ；
[0028]圖5單管二重一步法不同退火時間的電泳圖。其中，I為54°C ;2為56°C ;3為580C ；4 為 60。。。
[0029]圖6為CVA6-037株7種不同濃度的病毒培養上清核酸單管二重一步法的敏感性，即 100、10、1、0.1,0.01,0.001,0.0001TCID5(l/mL。1-7 依次為濃度為 100、10、1、0.1,0.01、
0.001,0.0001TCID50/mL 的 CVA6-037 病毒培養上清。
[0030]圖7為鑒別CVA6和非CVA6型腸道病毒單管二重一步法RT-PCR檢測手足口病患者的臨床咽拭子標本的擴增結果。其中，5、6、8、10、11為CVA6病毒感染；1、2、4為其他腸道病毒感染；3、7、9為陰性標本。【具體實施方式】
[0031]以下實施有利于用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。
[0032]病毒株來源:本發明涉及到的毒株EV71-1001、EV71-1002、CA16-1001、CVA6-037、CVA6-039、CA16-1004均來自南京市兒童醫院感染科手足口病患兒和江西九江市第三人民醫院急傳科手足口病患兒臨床標本中分離得到，并經間接免疫熒光檢測、EV71和CVA16熒光定量檢測核酸等方法鑒定。
[0033] 咽拭子標本的準備方法如下:
[0034]采集發病一周內的患兒咽拭子標本，用專用采樣棉簽時，在咽后壁和兩側扁桃體部位適度拭抹后將棉簽裝入2mL病毒保存液中，充分震蕩混勻后取100 μ L懸液，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒 RNA。
[0035]病毒液標本的采集方法如下:
[0036]將EV71、CVA16和CVA6病毒液接種至單層人惡性胚胎橫紋肌瘤RD細胞上，36 °C、5%vt CO2培養，逐日觀察細胞病變效應(CPE)，當CPE達80%以上后收獲病毒，凍融三次后12000印111離心后取14(^1^上清，采用0^^1^ Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)提取病毒RNA，其中 EV71-1001、EV71-1002、CA16-1001、CVA6-037、CVA6-039、CA16-1004 通過微量細胞培養法計算病毒滴度，使用DMEM培養基將病毒進行梯度稀釋，得到不同體積的病毒液用于單對引物RT-PCR和單管二重一步法RT-PCR敏感性檢測。
[0037]RT-PCR擴增產物的電泳鑒定方法如下:
[0038]取RT-PCR擴增產物5 μ L，加I μ L溴酚藍上樣緩沖液，混勻，點樣于20g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μ L/mL溴化乙錠)，以IOObpDNA分子量Marker作為標準分子參照，在5V/cm的電場強度下于I倍的TAE電泳緩沖液電泳40min，凝膠成像系統紫外線下觀察結果并拍照。
[0039]腸道病毒通用引物(UTR通用引物)為:
[0040]引物F:5’ -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3，；SEQ ID No:3 ；
[0041]引物R:5’ -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3，；SEQ ID No:4 ；
[0042]其中R為A或G，W為A或T。
[0043]實施例1引物的設計和篩選
[0044]為獲得特異性CVA6引物，從Genbank下載了腸道病毒所有67個血清型的216個基因序列，用DNAMAN軟件進行序列比對，依據所有CVA6病毒VPl基因保守序列設計出以下特異性引物:
[0045]引物(1108)F:5’ -TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’ 22bp ；SEQ ID No:1 ；
[0046]引物(1108)R:5’ -GTGGTTATGCTTGCACGRTCGG-3’ 22bp ；SEQ ID No:5 ；
[0047]引物(I124)F:5’ -TGCRGGRYTGGTAGGAGTTGTG-3，22bp ；SEQ ID No:6 ；
[0048]引物(1124)R:5’ -CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’ 2Ibp ；SEQ ID No:2 ；
[0049]引物(1030)F:5’ -TTGGCCCATAGATGTGATGGGC-3，22bp ；SEQ ID No:7 ；
[0050]引物(1030)R:5’ -TGKCCAARYTTACCAYAWGTTC-3，22bp ；SEQ ID No:8 ；
[0051]引物(1029)F:5’ -TCAGTGATAGCACAACGCCCGG-3’ 22bp ；SEQ ID No:9 ；
[0052]引物(1029)R:5’ -RTTGRGCRGTRGTKGARGAMACC-3’ 23bp ；SEQ ID No: 10 ；
[0053]其中M為A或C，R為A或G，W為A或T，Y為C或T。[0054]通過腸道病毒通用引物不同組合進行CVA6病毒一步法RT-PCR，通過CVA6特異性引物不同組合進行CVA6病毒RT-PCR，篩選出擴增效率高的引物(I 108) F+(1124) R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R0
[0055]再用引物(I108)F+(1124)R、(I124)F+(1108) R、(I124)F+(1124) R、(1124)F+(1030)R、(I 108)F+(1030)R分別以腸道病毒EV71和CVA16病毒的RNA為模板(見圖1),篩選出對 CVA6 特異性好的(1108) F+(1124) R、(1124) F+(1108) R、(1124) F+(1124) R。
[0056]再用三對非常特異性引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R與腸道病毒通用引物(F+R)配對進行一步法RT-PCR，篩選出一對擴增效率高、特異性好的引物 CVA6 (1108)F+(1124)R (見圖 2)。
[0057]再用濃度依次為1、0.1,0.01,0.001 TCID50/mL 的 CVA6-JJ037 檢測 CVA6(1108)F+ (1124) R引物的RT-PCR的敏感性(見圖3)。
[0058]實施例2單管二重一步法RT-PCR擴增條件的考察
[0059]本發明進行單管二重一步法RT-PCR擴增時，采用QIAamp Viral RNA MiniKit(QIAGEN)提取病毒RNA，用One-St印RT-PCR Kit (QIAGEN)擴增，擴增體系如下:
[0060]
【權利要求】
1.一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對，其特征在于: 上游引物序列為:5’ -TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’ ； 下游引物序列為:5’ -CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’ ； 其中R為A或G，M為A或C。
2.一種用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的雙重一步法引物，其特征在于:包括權利要求I所述的RT-PCR引物對以及腸道病毒通用引物。
3.如權利要求2所述的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的雙重一步法引物，其特征在于:所述腸道病毒通用引物為: 引物 F 序列為:5’ -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’ ； 引物 R 序列為:5’ -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’ ； 其中，W為A或T。
4.權利要求1所述的用于鑒別CVA6和非CVA6腸道病毒的RT-PCR引物對在CVA6和非CVA6腸道病毒檢測中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103525950SQ201310504021
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】孟繼鴻, 余文敏 申請人:東南大學