專利名稱：鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法rt-pcr引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于病毒核酸檢測領域，涉及鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法 RT-PCR引物及其應用。
背景技術：
手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的急性傳染病，主要發生于3歲以下兒童，臨床表現為手、足、口腔等部位的皰疹。而引起手足口病的病原體有多種，如柯薩奇病毒A組的16、4、6、10、12，B組2、3、5，埃可病毒4、19、30，以及腸道病毒 71 型(Enterovirus 71，EV71)等。其中以 EV71 和柯薩奇病毒 A16 (Coxsackievirus 16，CA16)最為常見。通常情況下，EV71和CA16等非EV71感染引起的手足口病在臨床癥狀和體征方面難以區別，但EV71感染除了引起手足口病外，部分患者還能出現無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎樣的麻痹和神經源性肺水腫等多種神經系統并發癥，病情兇險，可嚴重危害嬰幼兒的生命健康，故倍受重視。近年來，我國及周邊地區手足口病疫情日趨嚴重。 2011年我國全年累計報告的病例161萬余例，死亡509例。因此早期、快速、簡便、準確地鑒別EV71型和非EV71型手足口病，對于積極的臨床救治和疫情防控具有重要意義。傳統的病原學診斷采用細胞培養分離和鑒定病毒的手段，耗時且操作復雜，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。分子生物學的進展開拓了腸道病毒的快速診斷技術，特別是PCR技術，由于其檢測材料用量少，快速，靈敏度高，特異性好，在病毒感染的診斷中發揮越來越多的重要作用。今RT-PCR技術已成為手足口病病原體快速診斷的重要手段，但目前建立的方法主要針對EV71和CA16，很容易造成其它病原體的漏診；且每個檢測都要單獨進行，繁瑣費時；若要檢測其他EV，還要再增加一個PCR反應管，試劑消耗大， 操作步驟多，容易造成實驗失敗。如能建立一種單管二重一步法RT-PCR，鑒別EV71型和非 EV71型手足口病，將具有廣泛的應用前景。

發明內容
解決的技術問題本發明針對手足口病病原學檢查方法的單一性，耗時耗力的不足，提供一種高效、便捷的鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應用。技術方案
鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物，同時包括腸道病毒 5’ UTR通用引物和EV71 VPl基因特異性引物，所述腸道病毒5’ UTR通用引物為 引物 F2 :5’ -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3‘； 引物 Rl :5’ -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3，；所述EV71 VPl基因特異性引物為 引物 Fa: 5’ -CCCAACACAGCYTAYATAATAGC-3’ ； 引物 Rb :5’ -GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC -3，； 其中R=A或G，W= A或T，Y=C或T。上述引物是在相應引物上從3’末端、從5’末端或者同時從3’和5’末端有1-5 個附加核苷酸加入或缺失的引物。上述引物在制備鑒別EV71型和非EV71型手足口病核酸檢測試劑中的應用。從Genbank下載了世界各地的腸道病毒毒株，包含了腸道病毒所有67個血清型， 用DNAMAN軟件進行序列比對
依據腸道病毒5’ UTR設計通用引物 引物 Fl :5’ - AMCAAGCACTTCTGTTWCCCCGG -3，23bp
引物 F2 5’ - TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC -3， 24bp 引物 Rl :5’ - ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC -3， 24bp 引物 R2 5’ - CTYGATTGTCACCATAAGCAGCCA -3， 24bp ； 依據所有EV71病毒VPl基因設計特異性引物
引物1 5，-CCCAACACAGCYTAYATAATAGC -3，23bp引物1 5，-CAGGGAGATAGRGTGGCRGATG -3’22bp引物Fc5，-TGGRGCATCRTCRAATRCTAGTG -3’23bp引物Ra5，-CGCACYGAGAAMGTGCCCATC -3，21bp引物Rb5，-GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC -3’23bp0所述的引物變體是指在相應引物上從3’末端，從5’末端或者從3’和5’末端有 1-5個附加核苷酸加入或缺失的引物。其中M=A或C，R=A或G，W= A或T，Y=C或T。通過腸道病毒通用引物不同組合進行RT-PCR，篩選出擴增效率高的引物F1+R1、 F1+R2、F2+R1、F2+R2 ；通過EV71特異性引物不同組合進行RT-PCR，篩選出擴增效率高的引物 Fa+Rb、Fb+Rb、Fc+Ra、Fc+Rb。然后用 Fl+Rl、F1+R2、F2+R1、F2+R2 分別與 Fa+Rb、 Fb+Rb、Fc+Ra、Fc+Rb配對進行RT-PCR，初步篩選出8對候選二重引物FlRlFaRb、FlRlFbRb、 FlRlFcRb、FlR2FaRb、F2RlFaRb、F2RlFbRb、F2RlFcRb、F2R2FaRb。隨后用 0. 1、0. 01、0. 001 TCID50/mL EV71-NJ1001檢測上述候選二重引物RT-PCR的敏感性，最終篩選出本發明的二重引物F2RlFaRb。一種用于鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR的應用，采用上述篩選的二重引物對EV71和非EV71腸道病毒相關基因進行擴增。本發明進行單管二重一步法RT-PCR擴增時，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)提取病毒RNA，用Onelt印RT-PCR Kit (QIAGEN)擴增，擴增體系如下
H2O(RNase-free)7. 5μ L5XOne-StepRT-PCRBuffer4. 0μ LdNTPMix (IOmM)0. 8μ LF2 (10μ M)0. 6μ LRl (10 μ Μ)0. 6μ LFa (10 μ Μ)0. 35μ LRb (10 μ Μ)0. 35μ LOne-StepRT-PCREnzymeMix0. 8μ L
權利要求
1.鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物，其特征在于同時包括腸道病毒5’ UTR通用引物和EV71 VPl基因特異性引物，所述腸道病毒5’ UTR通用引物為引物 F2 :5’ -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3‘； 引物 Rl :5’ -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3，； 所述EV71 VPl基因特異性引物為 引物 Fa: 5’-CCCAACACAGCYTAYATAATAGC-3’ ； 引物 Rb :5’ -GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC -3，； 其中R=A或G，W= A或T，Y=C或T。
2.根據權利要求1所述鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物， 其特征在于所述引物是在相應引物上從3’末端、從5’末端或者同時從3’和5’末端有1-5 個附加核苷酸加入或缺失的引物。
3.權利要求1或2所述引物在制備鑒別EV71型和非EV71型手足口病核酸檢測試劑中的應用。
全文摘要
鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應用。本發明提供的二重一步法RT-PCR引物包括腸道病毒通用引物TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC和ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC，以及腸道病毒71型(EV71)特異性引物CCCAACACAGCYTAYATAATAGC和GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC。通用引物用于擴增所有腸道病毒5’UTR基因，特異性引物用于擴增所有EV71VP1基因。本發明的優點(1)兩對引物同時在一個PCR管反應，快速簡便，節省成本；(2)可早期鑒別EV71和非EV71型引起的手足口病；(3)檢測靈敏度高，特異性好；(4)普通RT-PCR儀就能操作，易于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102559939SQ20121008627
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者孟繼鴻, 張建華, 戴星, 江炳福 申請人:東南大學