本發明涉及一種病毒檢測試紙條及其應用，具體地涉及一種EV71病毒IgA抗體檢測試紙條及其應用。

背景技術：

腸道病毒71型(簡稱EV71病毒)屬小RNA病毒科腸道病毒屬，無包膜的單股正鏈RNA病毒，是引起手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原體之一。EV71病毒可經空氣飛沫等途徑傳播，具高致病性，常導致如無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹及神經源性肺水腫等嚴重的中樞神經系統并發癥，并引起死亡，目前沒有有效的治療藥物，主要通過早期診斷及對癥治療的方式。EV71病毒主要感染6歲以下，特別是2-5歲的兒童，該年齡段兒童大多就讀幼兒園，因此幼兒園是重點的EV71病毒預防單位，在手足口病流行季節，有必要對幼兒園進行篩查監控，減少EV71病毒在幼兒園的傳播。傳統的篩查手足口病主要是通過查看口腔皰疹和溫度測試的方法排查手足口病，但是臨床發現部分手足口患者早期沒有明顯的手、足、口腔皰疹癥狀或者發熱現象，因此出現了后來的EV71病毒的早期診斷方法。

EV71病毒的早期診斷方法較多，主要涉及組織細胞培養技術、血清學、分子生物學三個領域技術，比較常用的有細胞分離培養、RT-PCR核酸分子檢測和血清IgM抗體ELISA檢測三種方法，但這些方法均存在一定的缺陷：

細胞分離培養是EV71病毒感染確定的金標準方法，但是由于檢測時間長(超過5天)、實驗條件要求高、操作人員技術要求高等缺點限制了其臨床診斷應用。

RT-PCR核酸分子檢測是EV71病毒早期檢測方法中靈敏度最高的方法，通過檢測患者咽喉部拭子和肛門拭子的EV71病毒判斷感染情況，需要專業的技術人員和昂貴的熒光PCR擴增儀，基層醫療部門比較難開展該診斷方法。另外，在采集患者咽喉部細胞時，較容易引起患者不適造成反嘔或者嘔吐發生，給醫務人員工作增加困難，同時也容易增加采樣室病毒污染的風險。最后，EV71病毒感染患者后病毒在患者體內流轉過程比較復雜，根據病情的發展病毒有時會在咽喉部細胞中可以檢測咽拭子得到結果，有時會在腸道中可以通過檢測肛拭子得到結果，有時候會同時在咽喉處和腸道中，但有時候病毒均不在咽喉處和腸道中，因此RT-PCR結果經常會有假陰性的結果。

血清學IgM抗體ELISA檢測主要通過檢測血清中EV71病毒IgM抗體了解患者近期感染病毒的情況，對臨床診治有一定的幫助，但是很多EV71病毒患者是小于6歲的兒童，較多幼童的血管較細，而且對抽血有恐懼感，因此給臨床醫護人員操作帶來一定的難度。另外有相當部分的兒童二次感染EV71病毒，該群體在感染EV71病毒時產生較低濃度的EV71病毒IgM抗體，因此檢測血清IgM抗體比較容易得到假陰性的結果。

膠體金免疫分析(Colloidal gold immunoassay，CGIA)產生于20世紀80年代，是繼熒光標記、放射同位素標記和酶標記三大標記技術之后發展起來的固相標記免疫檢測技術，現已應用到電鏡、光鏡、凝集試驗、免疫印跡、斑點滲濾及免疫層析等方面，其中的膠體金免疫層析技術以其簡單快速、特異靈敏、無需輔助試劑和儀器、肉眼觀察結果、結果可長期保存等特點，成為當今最快速靈敏方便的免疫學檢測技術之一，特別適用于醫院、基層單位、野外作業以及時間緊迫的檢查和大面積普查。

技術實現要素：

為了克服現有技術存在的問題，本發明提供了一種EV71病毒IgA抗體檢測試紙條及其應用，能夠實現EV71病毒的快速篩查。

本發明提供了一種EV71病毒IgA抗體檢測試紙條，包括樣品墊、標記墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和背板，所述的硝酸纖維素膜設有EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段檢測線和人IgA抗體對照線，所述的標記墊設有抗人IgA抗體-膠體金標記物。

進一步地，所述EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。

進一步地，所述抗人IgA抗體選自羊抗人IgA多克隆抗體、鼠抗人IgA單克隆抗體、兔抗人IgA單克隆抗體或兔抗人IgA多克隆抗體。

進一步地，所述吸水紙、硝酸纖維素膜、標記墊、樣品墊依次粘附在所述背板上。

本發明還提供了另外一種EV71病毒IgA抗體檢測試紙條，包括樣品墊、標記墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、背板，所述的硝酸纖維素膜設有抗人IgA抗體檢測線和EV71病毒VP1蛋白抗體對照線，所述的標記墊設有EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物。

進一步地，所述EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。

進一步地，所述的抗人IgA抗體選自羊抗人IgA多克隆抗體、鼠抗人IgA單克隆抗體、兔抗人IgA單克隆抗體或兔抗人IgA多克隆抗體；所述的EV71病毒VP1蛋白抗體選自鼠抗EV71病毒VP1蛋白單克隆抗體、人抗EV71病毒VP1蛋白多克隆抗體、兔抗EV71病毒VP1蛋白單克隆抗體、兔抗EV71病毒VP1蛋白多克隆抗體或羊抗EV71病毒VP1蛋白多克隆抗體。

進一步地，所述吸水紙、硝酸纖維素膜、標記墊、樣品墊依次粘附在所述背板上。

本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條可用于唾液中的EV71病毒檢測，檢測步驟為：取唾液樣品，加入樣品稀釋液中，然后放入所述的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條進行檢測。

進一步地，所述的樣品稀釋液為含有0.5％牛血清白蛋白、0.2％酪蛋白、1％胰蛋白胨和0.02％疊氮鈉的PBS緩沖液。

EV71病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4四種蛋白質組成，其中VP1蛋白位于病毒粒子表面，其由297個氨基酸組成，是EV71病毒主要的中和性抗原表位，能刺激機體產生高滴度的保護性中和抗體。當EV71病毒通過口腔侵入人體，開始會在人咽喉處細胞中定植和繁殖，這時人體免疫系統率先啟動粘膜免疫對病毒進行免疫攻擊，粘膜免疫通過唾液產生病毒特異性的IgA抗體抵抗病毒侵染。

本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條，通過檢測唾液樣品中的IgA抗體，能夠實現EV71病毒的快速篩查，并能提高檢測結果的可靠性，減少假陰性的情況。該檢測方法操作簡單，結果快速，檢測樣品的采集無侵入性，避免了傳統的采血和采集咽拭子、肛拭子、腦脊液帶來的不適和交叉感染。

附圖說明

圖1為本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條的結構示意圖。

圖2唾液采集棒釋放唾液樣品的方法示意圖。

圖3為本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條的檢測方法示意圖。

圖4為本發明的檢測試紙條檢測EV71病毒IgA抗體的陽性結果示意圖。

圖5為本發明的檢測試紙條檢測EV71病毒IgA抗體的陰性結果示意圖。

圖6為本發明的檢測試紙條檢測EV71病毒IgA抗體的無效結果示意圖。

具體實施方式

為了更好地理解和實施，下面結合附圖詳細說明本發明。

【實施例1】EV71病毒IgA抗體檢測試紙條制備(捕獲法)

1、原料來源：羊抗人IgA抗體購自Sigma公司，人IgA抗體購自廣州市諾思生物科技有限公司。EV71病毒融合蛋白抗原多肽片段的序列如Seq ID NO.1所示，總共58個氨基酸，委托上海吉爾生化公司負責合成，純度大于98％，凍干保存。膠體金溶液(40nm)購自上海杰一生物技術有限公司。

2、樣品墊及標記墊的預處理

樣品墊和標記墊均為聚酯膜材料，使用前需用預處理液進行浸泡處理。預處理液為由0.01～0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0～7.5)、3g/100ml～6g/100ml的非離子表面活性劑、1ml/100ml～4ml/100ml的吐溫和5g/100ml～20g/100ml的聚乙二醇6000組成的混合液。將聚酯膜材料在預處理液中浸泡5～24h，取出后于37～45℃抽風烘干，烘干后密封備用。預處理后的樣品墊可直接用于試紙條的組裝，標記墊需經過標記物的包被處理后用于試紙條的組裝。

3、羊抗人IgA抗體-膠體金標記墊的包被處理

(1)羊抗人IgA抗體-膠體金標記物溶液的制備：磁力攪拌下，用0.1M碳酸鉀或鹽酸溶液調節膠體金溶液的pH值至7.4，按1mg抗體/ml膠體金溶液的比例加入羊抗人IgA抗體，然后加入然后加入與反應體系等體積的0.9％氯化鈉溶液，混勻攪拌反應2h，加入終濃度為0.3％的牛血清白蛋白，調節溶液pH至8.5，靜置30min。將上述溶液在14000rpm、4℃下離心15min，棄上清液，沉淀物用1/20初始膠體金溶液體積的0.02M pH9.0的硼酸鹽緩沖液(硼酸0.1237g，聚乙二醇20000 1g，用超純水定容至1L，調pH至9.0)重懸后再離心，如此重復洗滌3次，以徹底除去未結合的蛋白質，最終得到羊抗人IgA抗體-膠體金標記物溶液，于4℃保存備用。

(2)羊抗人IgA抗體-膠體金標記墊的包被處理：用Isoflow噴膜儀將制備好的羊抗人IgA抗體-膠體金標記物溶液均勻噴涂在經過步驟2預處理的標記墊上，每1cm噴涂0.03ml羊抗人IgA抗體-膠體金標記物溶液，將噴涂好的標記墊于濕度15％、溫度30℃條件下烘干處理12小時以上，烘干后密封備用。

4、硝酸纖維素膜的包被處理

取人IgA抗體用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸鹽緩沖液)稀釋到1.5mg/ml，然后用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的對照線(C線)；取EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸鹽緩沖液)稀釋到1.0mg/ml，然后用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T線)。包被好的硝酸纖維素膜于濕度10-30％、溫度20-35℃條件下烘干處理12小時以上，烘干后密封備用。

5、組裝、切條

請參閱附圖1，附圖1為本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條的結構示意圖。將吸水紙4、硝酸纖維素膜3、標記墊2、樣品墊1依次粘附在PVC背板5上，然后調整切條機參數進行切條，切成4mm寬度的試紙條。

【實施例2】EV71病毒IgA抗體檢測試紙條制備(間接法)

1、原料來源：羊抗人IgA抗體購自Sigma公司，EV71病毒VP1蛋白抗體購自廣州市諾思生物科技有限公司。EV71病毒融合蛋白抗原多肽片段的序列如Seq ID NO.1，總共58個氨基酸，委托上海吉爾生化公司負責合成，純度大于98％，凍干保存。膠體金溶液(40nm)購自上海杰一生物技術有限公司。

2、樣品墊及標記墊的預處理

樣品墊和標記墊均為聚酯膜材料，使用前需用預處理液進行浸泡處理。預處理液為由0.01～0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0～7.5)、3g/100ml～6g/100ml的非離子表面活性劑、1ml/100ml～4ml/100ml的吐溫和5g/100ml～20g/100ml的聚乙二醇6000組成的混合液。將聚酯膜材料在預處理液中浸泡5～24h，取出后于37～45℃抽風烘干，烘干后密封備用。預處理后的樣品墊可直接用于試紙條的組裝，標記墊需經過標記物的包被處理后用于試紙條的組裝。

3、EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記墊的包被處理

(1)EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物溶液的制備：磁力攪拌下，用0.1M碳酸鉀或鹽酸溶液調節膠體金溶液的pH值至7.4，按1mg抗體/ml膠體金溶液的比例加入EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段，然后加入與反應體系等體積的0.9％氯化鈉溶液，混勻攪拌反應2h，加入終濃度為0.3％的牛血清白蛋白，調節溶液pH至8.5，靜置30min。將上述溶液在14000rpm、4℃下離心15min，棄上清液，沉淀物用1/20初始膠體金溶液體積的0.02M pH9.0的硼酸鹽緩沖液(硼酸0.1237g，聚乙二醇20000 1g，用超純水定容至1L，調pH至9.0)重懸后再離心，如此重復洗滌3次，以徹底除去未結合的蛋白質，最終得到EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物溶液，于4℃保存備用。

(2)EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記墊的包被處理：用Isoflow噴膜儀將制備好的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物溶液均勻噴涂在經過步驟2預處理的標記墊上，每1cm噴涂0.03ml EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物溶液，將噴涂好的標記墊于濕度15％、溫度30℃條件下烘干處理12小時以上，烘干后密封備用。

4、硝酸纖維素膜的包被處理

取EV71病毒VP1蛋白抗體用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸鹽緩沖液)稀釋到1.5mg/ml，然后用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的對照線(C線)；取羊抗人IgA抗體用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸鹽緩沖液)稀釋到1.0mg/ml，然后用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T線)。包被好的硝酸纖維素膜于濕度10-30％、溫度20-35℃條件下烘干處理12小時以上，烘干后密封備用。

5、組裝、切條

請參閱附圖1，附圖1為本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條的結構示意圖。將吸水紙4、硝酸纖維素膜3、結合墊2、樣品墊1依次粘附在PVC背板5上，然后調整切條機參數進行切條，切成4mm寬度的試紙條。

【實施例3】EV71病毒IgA抗體的檢測(捕獲法)

請參閱附圖2，附圖2唾液采集棒釋放唾液樣品的方法示意圖。本發明通過唾液采集棒22在患者口腔中吸附唾液樣品，將前述采集棒放置到裝有1-2ml樣品稀釋液23(含有0.5％牛血清白蛋白、0.2％酪蛋白、1％胰蛋白胨和0.02％疊氮鈉的PBS緩沖液)的樣品管21中，充分攪拌，擠壓采集棒的棉簽頭液體，棄去采集棒。

請參閱附圖3，圖3為本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條的檢測方法示意圖。取【實施例1】制備的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條放入上述裝有唾液樣品的樣品管21中，樣品墊端接觸唾液樣品，放置15-30分鐘，然后肉眼觀察結果。

檢測原理：由于毛細管作用，唾液樣品從樣品墊端向吸水紙端流動，途經載有羊抗人IgA抗體-膠體金標記物的標記墊后，將該膠體金標記物完全復溶成游離態。如果唾液樣品中含有EV71病毒IgA抗體，會與游離的羊抗人IgA抗體-膠體金標記物結合，形成膠體金-羊抗人IgA抗體-IgA抗體復合物，該復合物上行到硝酸纖維素膜的檢測線(T線)處，再與其上包被的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段特異結合，呈現紅色條帶(附圖4)，多余的游離膠體金-羊抗人IgA抗體繼續上行到硝酸纖維素膜的對照線(C線)處，與其上包被的人IgA抗體特異性結合，形成膠體金-羊抗人IgA抗體-人IgA抗體復合物，呈現紅色條帶(附圖4)。如果樣品中不含有EV71病毒IgA抗體，游離的羊抗人IgA抗體-膠體金標記物會越過檢測線(T線)，繼續上行到硝酸纖維素膜的對照線(C線)處，與其上包被的人IgA抗體特異性結合，形成膠體金-羊抗人IgA抗體-人IgA抗體復合物，呈現紅色條帶(附圖5)。如果硝酸纖維素膜的對照線(C線)處沒有形成紅色條帶，說明試紙條失效，結果不可靠(附圖6)。

檢測結果判定：如果檢測試紙條同時出現檢測線(T線)和對照線(C線)，說明樣品呈陽性，含有IgA抗體，即預示有EV71病毒感染(附圖4)；如果只出現對照線(C線)，說明樣品呈陰性(附圖5)，不含IgA抗體，即預示沒有EV71病毒感染；如果沒有出現任何線或者只出現檢測線(T線)，說明此試紙條無效(附圖6)。

【實施例4】EV71病毒IgA抗體的檢測(間接法)

請參閱附圖2，附圖2唾液采集棒釋放唾液樣品的方法示意圖。本發明通過唾液采集棒22在患者口腔中吸附唾液樣品，將前述采集棒放置到裝有1-2ml樣品稀釋液23(含有0.5％牛血清白蛋白、0.2％酪蛋白、1％胰蛋白胨和0.02％疊氮鈉的PBS緩沖液)的樣品管21中，充分攪拌，擠壓采集棒的棉簽頭液體，棄去采集棒。

請參閱附圖3，圖3為本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條的檢測方法示意圖。取【實施例1】制備的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條放入上述裝有唾液樣品的樣品管21中，樣品墊端接觸唾液樣品，放置15-30分鐘，然后肉眼觀察結果。

檢測原理：由于毛細管作用，唾液樣品從樣品墊端向吸水紙端流動，途經載有EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物的標記墊后，將該膠體金標記物完全復溶成游離態。如果唾液樣品中含有EV71病毒IgA抗體，會與游離的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物結合，形成膠體金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-IgA抗體復合物，該復合物上行到硝酸纖維素膜的檢測線(T線)處，再與其上包被的羊抗人IgA抗體特異結合，形成膠體金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-IgA抗體-羊抗人IgA抗體復合物，呈現紅色條帶(附圖4)，多余的游離膠體金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段繼續上行到硝酸纖維素膜的對照線(C線)，與其上包被的EV71病毒VP1蛋白抗體特異性結合，形成膠體金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-EV71病毒VP1蛋白抗體復合物，呈現紅色條帶(附圖4)。如果樣品中不含有EV71病毒IgA抗體，游離的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-膠體金標記物會越過檢測線(T線)，繼續上行到硝酸纖維素膜的對照線(C線)，與其上包被的EV71病毒VP1蛋白抗體特異性結合，形成膠體金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-EV71病毒VP1蛋白抗體復合物，呈現紅色條帶(附圖5)。如果硝酸纖維素膜的對照線(C線)沒有形成紅色條帶，說明試紙條失效，結果不可靠(附圖6)。

檢測結果判定：如果檢測試紙條同時出現檢測線(T線)和對照線(C線)，說明樣品呈陽性，含有IgA抗體，即預示有EV71病毒感染(附圖4)；如果只出現對照線(C線)，說明樣品呈陰性，不含IgA抗體，即預示沒有EV71病毒感染(附圖5)；如果沒有出現任何線或者只出現檢測線(T線)，說明此試紙條無效(附圖6)。

【實施例5】本發明EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與熒光PCR方法結果對比

選取實驗樣品88例，分別采集患者的唾液樣品和咽拭子樣品，分別用EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與熒光PCR方法進行測試，結果如表1：

表1本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與熒光PCR方法比較結果

本發明EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與熒光PCR方法比較，靈敏度達到97.50％，特異性87.50％，對EV71病毒篩查具備實際應用價值。

【實施例6】本發明EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與血清IgM抗體檢測方法結果對比

選取樣品88例，分別采集患者的唾液樣品和血液樣品，分別用EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與血清IgM抗體檢測方法進行測試，結果如表2：

表2本發明的EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與熒光PCR方法比較結果

本發明EV71病毒IgA抗體檢測試紙條方法與血清IgM抗體檢測方法比較，靈敏度達到95.00％，特異性89.58％，對EV71病毒篩查具備實際應用價值。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。

序 列 表

<110> 廣州瑞輝生物醫療科技有限公司

<120> EV71病毒IgA抗體檢測試紙條及其應用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val

 5 10 15

Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro Phe

 20 25 30

Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro

 35 40 45

Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr

50 55