專利名稱：：用于陰道感染的腸內疫苗的制作方法
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：本發明涉及一種防止陰道真菌、細菌或原蟲感染的疫苗。陰道炎或陰道感染的病原學通常是微生物的、尤其是真菌的、細菌的或原蟲的。常見真菌性陰道炎的病原是念珠菌屬的白色念珠菌(Candidaalbicans)，它導致眾知的鵝口瘡。據估計，約7％的成年婦女易患念珠菌病。至少，癥狀上表現不舒服，而且在一些病例中患者事實上不能進行正常的生活。細菌性陰道感染的病原是陰道加德諾菌(Gardnerellavaginalis)和淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoea)這種淋球菌。淋病感染的后果是嚴重的，不僅是在感染急性期感到痛苦，發展成慢性會長期的不適、不孕或復發性流產。約30～40％的婦女陰道中存在陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)這種原蟲。盡管通常是非致病性的，有時的確如此，有時則通過陰道分泌物經生殖器傳播而導致感染。導致陰道炎的病毒是生殖器皰疹病毒(Herpesgenitalis)。對復發陰道感染婦女的系統和/或局部治療令人失望，至少對白色念珠菌病還沒有可行的治療方案能減少發作頻率。很顯然，需要一種有效的疫苗防止這些感染，本發明正是針對此需要而產生。在抵抗感染陰道微生物的腸內疫苗的開發中，已然發現加用佐劑并沒有所期望的增強免疫應答的有益效果。實際發現的情況是，佐劑對消除感染起到延緩或阻礙作用。根據本發明的第一個方面，提出了一種腸內無佐劑疫苗，它包括一種感染陰道的滅活微生物。現有的關于無佐劑口服疫苗的實例公開于WO-A-8605691。該在先申請公開了一種腸內無佐劑單細菌疫苗，包括滅活的流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，目的在于防止慢性氣管粘膜感染的病人發生急性支氣管炎。WO-A-8605691主要涉及支氣管道，而本發明只涉及陰道感染，除了這個主要區別點之外，各病例中感染的原因都有很大差別。WO-A-8605691中，小支氣管中病理生物過量的原因是破壞和阻塞氣道；在陰道感染病例中，似乎感染發生在T細胞效應池減少時，后者可能是多數婦女中共存的情況。該證據來源于念珠菌直接皮膚試驗的陽性結果和發現的T細胞擴展治療的相反結果。在有關WO-A-8605961中提及的項目的研究中，對正常個體進行試驗，某些個體具備或不具備對所述細菌的抗體。具備抗體者在繼后的激發中不能刺激更多抗體產生，不具備抗體者則反之。那正是WO-A-8605961所給啟示的基礎，揭示省略任何佐劑成分可期望增強抗體成分。相反，在導致本發明的實驗中，甚至首次應用于免疫的實驗動物沒能在白色念珠菌激發時產生抗體；現已發現霍亂毒素佐劑，作為有效的粘膜抗體刺激劑，降低了致免滅活生物體所提供的保護，很可能反映封閉性抗體或免疫偏差。因而作用機制似乎并不相同。本發明的疫苗適于腸道內服用。盡管某些病例中可選擇直腸用藥，但口服用藥方案通常作為待選之列。這種腸內疫苗可作成片劑，尤其是用以口服的腸衣片劑、粒劑、膠囊劑或糖衣丸，或是直腸用藥的栓劑。劑量單位形式包含從約109微生物到約1013微生物，而優選約1010到約1012微生物，同時帶有適當的有機或無機性質的載體。可以包括一種或多種適當的載體。它們包括填充劑，例如糖類(象乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇)，纖維素制劑、磷酸鈣劑(象磷酸鈣或磷酸氫鈣)和氨基酸(象甘氨酸)；粘合劑，例如淀粉糊(象用玉米、小麥、大米或馬鈴薯淀粉制成的淀粉糊)，明膠，樹膠(象黃蓍膠)，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；和/或，需要的話，崩解劑，象上面提及的淀粉，羧甲基淀粉，交聯聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂和/或藻酸或其鹽類，例如藻酸鈉。還可以包括其它一些成分流動調控劑和潤滑劑，象二氧化硅、滑石粉和硬脂酸或其鹽類，例如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、和/或聚乙二醇；和/或其它促膽汁分泌劑，例如牛磺膽酸鈉，牛磺甘膽酸鈉或牛膽汁。糖衣丸的核心可以采用特別是濃縮糖溶液，該溶液可以包含阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦；它們可以用硝基纖維素在適宜有機溶劑或溶劑混合物中形成的溶液來包被，為制備可抵抗胃液的包衣，可用適宜的纖維素制劑溶液(例如鄰苯二甲酸乙酰纖維素或鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素)來包被。可以把染料或色素加入片劑或糖衣丸包衣中，例如達到區分目的或顯示活性成分的不同劑量。激發抗原應答的化合物即佐劑不能作為載體或添加劑應用在本發明的疫苗中。本發明疫苗的一個具體特征是滅活的微生物未添加佐劑；此疫苗只刺激有限的抗原應答。疫苗中常加的、但本發明疫苗中卻未添加的佐劑包括霍亂毒素、激發強烈抗原應答的滅活細菌，例如滅活的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)象卡介苗(BacillusCalmetteGuerin，BCG)或滅活的短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。每種細菌對其它細菌來說都可充當佐劑。其他常見佐劑包括無機的聚合材料，例如氧化鋁或磷酸鋁，它們在非經腸疫苗中尤其有用。優選的是，本發明疫苗只包含單一種族微生物，以避免一種微生物輔佐另一種微生物的可能性。然而，當兩種或更多不同微生物之間幾乎無或根本無相互輔佐影響時也可并用。本發明的疫苗包含一種感染陰道的滅活微生物。該微生物可以是真菌、細菌、原蟲或病毒，用便利的方法，例如福爾馬林的使用即可殺死這些微生物。感染陰道的真菌包括念珠菌屬的白色念珠菌；細菌性陰道感染可由奈瑟氏淋球菌或陰道加德諾菌引起；原蟲性感染可由陰道毛滴蟲引起；病毒感染可由皰疹病毒、尤其是生殖器皰疹病毒引起。看上去防止白色念珠菌的感染是本發明的主要目的之一，實際上下面所述的實驗工作重點即在白色念珠菌，因為在其他模型系統中已經顯示，消除感染性白色念珠菌的主要效應器是T淋巴細胞，所以有理由期望避免其他微生物的感染。期望T細胞作用于其它粘膜介導的微生物(象其它真菌、細菌和原蟲)并作用于神經介導的病毒(象皰疹病毒)。本發明可在獸醫學中應用，盡管本發明特別申請是預防人類疾病。正如以下所述，本發明疫苗中的滅活微生物可在高雌激素環境中應用。(在本說明書中，“雌激素”作為通稱，包括有雌激素活性的化合物；雌激素本身包括在內，也包括保留其活性的各種衍生物及類似物)。在本發明的疫苗中，盡管不總是最好的，卻是有可能讓雌激素(至少是口服形式)與滅活微生物一起按處方制備。根據本發明的第二方面，提供了制備上述疫苗的方法。該方法包括將制藥學上或獸醫學上可接受的載體、填充劑、稀釋劑和/或其它添加劑與滅活微生物相混合。疫苗的一些生產方法是本
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中公知的。細菌和某些其它微生物在平皿中生長，例如含有各種營養成分的瓊脂培養皿，或在發酵的肉湯懸浮液中生長，肉湯懸浮液中包含以溶解形式存在的營養成分(例如牛奶水解產物、乳清蛋白水解產物、玉米浸液、葡萄糖、淀粉和胰蛋白酶酶解的大豆液)和生長刺激成分(例如激素和輔酶)或是血清稀釋液(例如馬血清或胎牛血清)。培養物必須嚴格控制無菌，可選擇性加用少量抗微生物藥，象抗菌素，以防止不需要的生物過度生長。可用象福爾馬林、石炭酸或其它物質，選擇性進行勻化和徹底清洗而殺死生物體。滅活生物的無菌性必須仔細檢驗，象接種到已知能讓存活生物迅速生長的培養基或瓊脂培養皿中。口服或直腸用藥的藥物制劑是在無菌條件下將滅活的生物經常規的真空凍干、干燥、混合、制粒和/或糖膏制作過程而制成的。本發明在預防人或動物陰道感染的方法中有用，該方法包括腸內使用上述疫苗。因此，根據本發明的第三方面，提供了感染陰道的滅活微生物在制備腸內無佐劑疫苗中的應用。五到七天連續服用一到三個單位劑量，即含1010到1012滅活細菌的疫苗是優選的。且需要不止一個療程，以大致三到五周為間隔的三個療程是優選的。已有顯示，在有雌激素存在的情況下服用本發明的疫苗尤為有效。據認為，雌激素在體內的作用是控制“閘門”，使細胞毒性T細胞到達陰道粘膜。此證據是由有關B細胞的發現中類推而出。臨床經驗顯示，許多婦女易在即將行經前發作念珠菌病，即在雌激素缺乏時期。對于不服基于雌激素的避孕藥的婦女，適合在行經后月經周期的前半周期服用疫苗，例如周期開始后的第五天或七天開始服用。服用基于雌激素的避孕藥的婦女可在除行經期之外的任何時間服用本發明的疫苗。雌激素可能與本發明的疫苗同時或相繼服用。根據本發明的第四方面，提供了一種包含上述疫苗和一種具有雌激素活性的化合物的產品，二者可在預防陰道微生物感染中組合、同時或相繼服用。本發明對每個方面的優選特征的描述正如對其它每個方面的描述一樣，可在細節上做必要修正。現參照下列實施例描述本發明。實施例1用無佐劑口服疫苗防止小鼠感染經陰道侵襲的白色念珠菌。本實施例及以下實施例中所用實驗動物為Balb/c小鼠，每組五只。致免的和感染的生物體是從復發外陰一陰道念珠菌病的病人體內分離出的白色念珠菌的一株，選擇它的原因在于陰道洗液中它反應了最高滴度。為制備疫苗，白色念珠菌在其芽分生孢子(blastocondia)階段用福爾馬林將其殺死。每只實驗小鼠在0、2、4、6、14和21天時經口接受在碳酸氫鹽緩沖液中的108滅活白色念珠菌。對照組中每只小鼠在同一天只接受碳酸氫鹽緩沖液。25天時，每只小鼠皮下注射100微升雌激素，28天時，經陰道注入含5×105芽分生孢子階段的白色念珠菌細胞的20微升懸浮液。35天時和此后每隔七天再次皮下注射100微升雌激素。也是在35天和此后每隔七天進行陰道沖洗，按每立方毫米中生物體數量計數并記錄存活的念珠菌細胞的數量。結果顯示于下表中。</tables>該結果顯示在三周的激發中顯著的、確切說是令人吃驚的存活念珠菌細胞的減少。相反，對照組沒有如此顯著的減少。盡管有一些下降報導，是因為對照組的一只小鼠的計數被任意計為零而造成的差異。對比例1有佐劑條件下的服用重復操作實施例1，所不同的是在0、14、21天時在白色念珠菌/碳酸氫鹽緩沖液中加用10微克霍亂毒素佐劑。結果示于下表中</tables>由此可以看出，添加霍亂毒素導致真菌的生長起初是增加的，繼而是真菌被清除，但要經過比實施例1無佐劑疫苗更長的一段時間。對比例2皮下注射白色念珠菌沿用實施例1中過程，所不同的是皮下注射進行免疫接種。0天皮下注射完全弗氏佐劑中的1010白色念珠菌細胞，14天用不完全弗氏佐劑中的108細胞，21天用不完全弗氏佐劑中的108個細胞。結果示于下表中。</tables>又一次顯示皮下注射疫苗的結果是起初真菌生長增快，隨后被清除。權利要求1.一種腸內無佐劑疫苗，它包括一種感染陰道的滅活真菌性、細菌性或原蟲性生物體。2.如權利要求1中所要求的疫苗，它適于口服。3.如權利要求1或2中所要求的疫苗，其中一個單位劑量含有約109到約1013個微生物。4.如權利要求1、2或3中所要求的疫苗，它含有滅活的白色念珠菌。5.如權利要求1、2或3中所要求的疫苗，它含有滅活的淋病奈瑟氏菌。6.如權利要求1、2或3中所要求的疫苗，它含有滅活的陰道加德諾菌。7.如權利要求1、2或3中所要求的疫苗，它含有滅活的陰道毛滴蟲。8.一種制備如權利要求1到7任一項所要求的疫苗的方法，該方法包括將制藥學上或獸醫學上可接受的載體、填充劑、稀釋劑和/或其它添加劑與滅活微生物相混合。9.感染陰道的滅活微生物在制備腸內無佐劑疫苗中的應用。10.一種防止人或動物陰道感染的方法，該方法包括腸道應用一種如權利要求1到7任一項所要求的疫苗。11.一種如權利要求10中所要求的方法，其中的疫苗在高雌激素水平的時間應用。12.一種如權利要求11中所要求的方法，其中，在不服用基于雌激素的避孕藥的婦女中，疫苗在行經后月經周期的前半期應用。13.一種如權利要求11中所要求的方法，其中，在服用基于雌激素的避孕藥的婦女中，疫苗可在除經期外的任何時間應用。14.一種產品，它包括如權利要求1到7任何一項所要求的疫苗和一種具有雌激素活性的化合物，二者在防止陰道微生物感染中組合、同時或相繼應用。全文摘要一種腸內無佐劑疫苗，它包括一種感染陰道的滅活微生物。該微生物可以是象白色念珠菌這樣的真菌，象陰道加德諾菌或淋病奈瑟氏菌這樣的細菌，象陰道毛滴蟲這樣的原蟲，或者象生殖器皰疹病毒這樣的病毒。與含佐劑組合物比較而言，不加佐劑對清除微生物有顯著改善。文檔編號A61P13/00GK1159760SQ95195500公開日1997年9月17日申請日期1995年9月5日優先權日1994年9月6日發明者R·L·克萊西申請人:奧斯法姆國際有限公司