專利名稱：一種檢測喹諾酮類化合物的方法及其專用量子點熒光免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測喹諾酮類化合物的方法及其專用量子點熒光免疫試劑盒。
背景技術：
目前其中獸藥殘留問題是影響動物性食品安全的最主要因素之一，由于動物樣本 成分復雜，待測物濃度較低，而且大多數取樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提 出了更高的要求。量子點(Quantum dot,QD)由于具有獨特的光學和電學性質，使其熒光免 疫分析中得到越來越多的應用，作為熒光探針，QD的光學特性比在免疫熒光分析法中經常 采用的傳統發色團如羅丹明6G或其它有機染料分子有明顯的優越性QD的激發光譜寬，且 連續分布，而發射光譜呈對稱分布且寬度窄，熒光發射波長可通過改變量子點的大小而加 以調節，因而不同大小的半導體量子點能被單一波長的光激發而發出不同顏色的熒光。量 子點可持續發光，其熒光壽命可達染料分子的100倍以上，比常規的酶聯免疫吸附檢測方 法的抗背景干擾能力強，自動化程度高，提高了分析方法的精密度，在獸醫學、醫學、食品分 析等方面將會有更廣闊的應用前景。喹諾酮類化合物(Quinolones，FQs)是一類人工合成的新型抗菌藥，因其抗菌譜 廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性、毒副作用小等特點，廣泛用于人類和動物 多種感染性疾病的治療。但該類藥物的長期和廣泛應用會造成畜產品的藥物殘留，并會導 致許多細菌對喹諾酮類化合物產生耐藥性，不僅給人類健康帶來極大的危害，同時也影響 了畜牧業的發展。因此，我國農業部第235號文件規定其殘留限量為100yg/kg。但由于在 畜牧生產中不合理使用現象嚴重，使其在動物性食品中殘留引起生態環境污染和人類健康 危害的潛在威脅已倍受關注。動物組織中喹諾酮類化合物殘留的檢測方法主要采用液相色 譜法、液相色譜_聯質譜法、酶聯免疫法等。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測喹諾酮類化合物的量子點熒光免疫試劑盒。本發明提供的檢測喹諾酮類化合物的量子點熒光免疫試劑盒，包括喹諾酮類化合
物特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為喹諾酮類化合物半抗原與載體蛋
白的偶聯物；其結構式如式ι所示U H 所述試劑盒還包括濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和量子點標記抗 抗體；所述試劑盒由喹諾酮類化合物特異性抗體、包被原、標準品溶液、濃縮洗滌液、濃 縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和量子點標記抗抗體組成。所述喹諾酮類化合物特異性抗體為諾氟沙星單克隆抗體或諾氟沙星多克隆抗體， 所述諾氟沙星單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 3779的對11種喹諾酮類化合物(恩諾 沙星、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟 沙星和依諾沙星)都有交叉反應的諾氟沙星單克隆雜交瘤細胞株QNs分泌的抗體。所述標準品溶液中標準品的濃度為0 μ g/L、0. 5 μ g/L、1. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、 22. 5 μ g/L或112. 5 μ g/L,所述標準品為諾氟沙星； 所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮化鈉和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽 緩沖液混合得到溶液；所述濃縮復溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的 磷酸鹽緩沖液混合得到的溶液；所述包被緩沖液是pH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液。所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、 PH值為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。
基碳化
所述包被原是按照如下方法制備得到的
將每70mg載體蛋白溶于ImL 0. OlM PBS緩沖液中，再加入30mgEDC (乙基二甲氨 亞胺)，25°C攪拌8h，稱為A液；
將40mg喹諾酮類化合物半抗原溶于ImL 0. OlM PBS緩沖液，稱為B液； 將B液加入到A液中，25°C攪拌反應12h，將得到的產物透析，得到所述包被原。 所述喹諾酮化合物半抗原的結構式如式II所示 所述喹諾酮化合物半抗原是按照如下方法制備得到的1、將每320mg諾氟沙星與 143 μ L 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亞砜中，再加入700mg碳酸鉀和30mg碘化鈉， 70°C回流提取3天，再靜置1天；II、用乙酸乙酯對步驟I得到的產物進行萃取，取有機相， 將有機相干燥，得固體殘留物；III、將固體殘留物加到2mL IM氫氧化鈉水溶液和500μ L乙 醇中，70°C反應8h，得到喹諾酮半抗原。所述量子點標記抗抗體為量子點QD650標記羊抗鼠抗抗體；所述載體蛋白為鼠血 清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優選為卵清蛋白；
所述喹諾酮類化合物為環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲 喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依諾沙星。本發明的另一個目的是提供一種檢測喹諾酮類化合物的方法。本發明提供的檢測喹諾酮類化合物的方法包括以下步驟1)樣品前處理將每Ig動物組織勻漿后，加入4mL乙腈-0. IM氫氧化鈉混合溶液，混勻；以3000g 的速度離心IOmin ；取2mL上清液氮氣吹干，加入ImL復溶液溶解干燥的殘留物，再加入ImL 正己烷充分混合，3000g離心5min，取下層溶液用復溶液稀釋2倍獲得樣本溶液，所述動物 組織為豬肉或雞肉；所述乙腈-0. IM氫氧化鈉混合溶液是由體積比為84 16的乙腈和濃 度為0. IM氫氧化鈉水溶液混合得到；所述復溶液為將所述濃縮復溶液用0. 05mol/L、pH值 為7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍得到的；2)利用上述的檢測喹諾酮類化合物的量子點熒光免疫試劑盒檢測步驟1中的樣 本溶液；所述喹諾酮類化合物為環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲 喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依諾沙星。由保藏號為CGMCC No. 3779的對11種喹諾酮類化合物都有交叉反應的諾氟沙星 單克隆雜交瘤細胞株QNs分泌的喹諾酮類化合物單克隆抗體也屬于本發明的保護范圍。保藏號為CGMCC No. 3779的對11種喹諾酮類化合物都有交叉反應的諾氟沙星單 克隆雜交瘤細胞株QNs也屬于本發明的保護范圍。該細胞株已于2010年4月12日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區大屯 路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 3779。諾氟沙星的通用名稱為諾氟沙星，化學名稱為1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧 代-7-α-哌嗪基)-3-喹啉羧酸。本發明的實驗證明，本發明的量子點熒光免疫試劑盒主要采用間接競爭方法定性 或定量檢測喹諾酮類化合物的殘留量，該試劑盒試劑盒的主要內容物采用了方便使用的工 作液形式，工作液保存性及穩定性好；利用本發明試劑盒檢測喹諾酮類化合物的殘留量的 方法，可用于檢測動物組織如豬肉、雞肉等樣品中喹諾酮類化合物的殘留量，具有樣品前處 理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現場監控且 適合大量樣本的篩查。因此本發明檢測方法及其專用試劑盒將在動物源性食品中喹諾酮類 化合物的殘留檢測中發揮重要作用。


圖1為喹諾酮類化合物標準曲線圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中各試劑盒的檢測原理如下當在量子點熒光板微孔上預包被喹諾酮類化合物半抗原與載體蛋白的偶聯物時， 加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入喹諾酮類化合物抗體溶液，樣本中殘留的喹諾酮類化合物或喹諾酮類化合物標準品與量子點熒光板上包被的喹諾酮類化合物偶聯抗原競爭 喹諾酮類化合物抗體，加入量子點標記抗抗體，用熒光酶標儀檢測熒光強度，樣本熒光強度 值與樣本中喹諾酮類化合物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中喹諾酮類化 合物的殘留量。實施例1、量子點熒光免疫試劑盒的制備及其檢測方法一、量子點熒光免疫試劑盒包括(1)包被原溶液將包被原溶解于包被緩沖液中得到的，其中包被原在包被原溶 液中的濃度為0. 08μ g/mL ；包被原為喹諾酮類化合物半抗原與牛血清白蛋白偶聯物；(2)量子點標記的羊抗鼠抗抗體工作液用稀釋液稀釋量子點標記的羊抗鼠抗抗體得到的，稀釋度為1 500;稀釋液為50mL牛血清白蛋白和950mL磷酸鹽緩沖液混合得到；所述磷酸鹽緩沖液 的濃度為0. 02M, pH值為7.4。羊抗鼠抗抗體購自北京博奧森，產品目錄號為bs_0295G。(3)諾氟沙星標準品溶液將標準品溶于稀釋液中得到的，其中標準品在諾氟沙星標準品溶液的濃度分別為 0 μ g/L、0. 5 μ g/L、l. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、22. 5 μ g/L 或 112. 5 μ g/L，稀釋液為 ρΗ7· 4、0· 05Μ
的磷酸鹽緩沖液。諾氟沙星標準品為諾氟沙星，購自中國藥品生物制品檢定所，產品目錄號為 ο(4)喹諾酮類化合物單克隆抗體工作液將單抗溶于稀釋液中得到的，單抗與稀釋液的配比為1 1000;單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No. 3779的對11種喹諾酮類化合物都有交叉反 應的喹諾酮甲基異惡唑單克隆雜交瘤細胞株QNs產生。稀釋液為25g酪蛋白、0. 03g疊氮化鈉和IOOOmL磷酸鹽緩沖液混合得到。(6)濃縮洗滌液將0. 05g疊氮鈉化鈉與IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽 緩沖液混合得到。(7)濃縮復溶液將0.^牛血清白蛋白與1001^濃度為0.0511101/1、？!1值為7.4 的磷酸鹽緩沖液混合而成。400mL/瓶，1瓶。(8)包被緩沖液pH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液。(9)封閉液將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH 值為7. 4的磷酸鹽溶液混合而成。二、試劑盒的制備1、量子點熒光板的制備(1)喹諾酮類化合物半抗原的合成諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)的哌嗪環仲氨基與4_溴丁酸乙酯結合來制備NOR 半抗原將320mg NOR與143 μ L 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亞砜中，再加入700mg 碳酸鉀和30mg碘化鈉，70°C回流3天，再靜置1天；然后加水400mL，用100mL2X乙酸乙酯 萃取，萃取相經水洗滌、無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干，得淺黃色粘稠狀液體。酯的堿性水解在上述黃色粘稠狀液體中加入IM氫氧化鈉(2mL)，再加入500 μ L乙醇助溶，70°C反應8h(溶液由渾濁變為淺黃色澄清液體，說明水解成功)，用鹽酸調節pH 為7左右。用氮氣吹干上述溶液，冷凍干燥過夜，得到諾氟沙星半抗原。
所述諾氟沙星半抗原的結構式如式II所示
〇O
II)。(2)包被原的制備采用活性酯法將諾氟沙星半抗原和卵清蛋白(OVA)偶聯得到 包被原。70mg卵清蛋白溶于ImL 0. OlM PBS中，再加入30mgEDC，25°C攪拌8h，稱為A液。 將上述獲得的40mg諾氟沙星半抗原溶于ImL 0. OlM PBS,稱為B液，將B液加入到A液中得 到混合物。將混合物25°C攪拌反應12h。反應后的溶液轉移到透析袋中，用0. OlM pH 7.2 的PBS透析3天，期間應換3次透析液。透析后，離心除去殘余的沉淀，取上清液得到包被 原，分裝后-20°C保存。所述包被原為喹諾酮類化合物半抗原與載體蛋白的偶聯物，其結構式如式I所
OVA
O
(式 I)。(3)量子點熒光板的制備用包被緩沖液將步驟(2)得到包被原(即諾氟沙星半抗原和卵清蛋白偶聯物)稀 釋成0. 08 μ g/mL,每孔加入100 μ 1，37°C溫育2h，傾去包被液，用稀釋20倍的洗滌液洗滌2 次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封閉液，37°C溫育lh，傾去孔內液體，干燥后 包被有包被原的量子點熒光板，用鋁膜真空密封保存。2、喹諾酮類化合物單克隆抗體的制備(1)免疫原合成將諾氟沙星半抗原和牛血清白蛋白通過活性酯法偶聯得到免疫原。具體制備過程如下與包被原的制備方法相同，不同的是將卵清蛋白(OVA)替換 為牛血清白蛋白BSA。(2)動物免疫與細胞融合
采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以以步驟2的(1)獲得的免疫原進行免疫，免疫 劑量為IOOyg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下 多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次， 四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。取免疫BALB/c小鼠脾細胞，按5 1比例(數量配比)與SP2/0骨髓瘤細胞融合。 采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化， 直到得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將此細胞株命名為QNs。經篩選得到對11種喹諾酮類化合物(恩諾沙星、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星、 達氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星)都有交叉反應的諾 氟沙星單克隆雜交瘤細胞株QNs，該細胞株已于2010年4月12日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生 物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 3779。(3)細胞凍存和復蘇取單克隆雜交瘤細胞株QNs CGMCC No. 3779用凍存液制成 5X IO6個/mL的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放 入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。(4)單克隆抗體的制備與純化增量培養法將上述培養的雜交瘤細胞置于細胞培養基中，在37°C條件下進行培 養，用下述辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，-20°C保存。所述細胞培養基為向RPMI-1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉得到的細胞 培養基，使小牛血清在細胞培養基中的終濃度為20% (體積百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞 培養基中的終濃度為0.2% (質量百分含量)；所述細胞培養基的PH為7. 4。辛酸-飽和硫酸銨法1) 50 %飽和度鹽析取上述細胞培養液5mL，加等量 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化 鉀0. 2g，氯化鈉8. Sg)混勻，然后逐漸滴加等體積的飽和硫酸銨(pH7. 4)溶液(使硫酸銨溶 液的飽和度達到50% )，邊加邊攪拌，室溫放置30min，3000g離心30min，棄上清液留沉淀。 2)33%飽和度鹽析在步驟1)得到的沉淀中分別加入5mL 0. Olmol/LPBS (1L溶液中含有磷 酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化鉀0. 2g，氯化鈉8. 8g)溶解沉淀，再加飽和 硫酸銨溶液達到33%飽和度，邊加邊攪拌，室溫放置30min，棄上清液留沉淀。重復操作2 次。3)脫鹽取0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫 二鈉2. 86g，氯化鉀0. 2g，氯化鈉8. Sg)溶解步驟2)得到的沉淀，裝于透析袋中，懸于盛有 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化 鉀0. 2g，氯化鈉8. Sg)的燒杯中脫鹽，放置于4°C，每天換液3-4次，BaCl2檢測直至透 析液中無硫酸根離子為止。4)透析完畢，3000g離心5min，取上清液得到純化的諾氟沙星單 克隆抗體，_20°C冰箱保存。3、量子點與羊抗鼠抗體的制備表面氨基(-NH2)修飾的水溶性量子點QD650購自北京中科物源，產品目錄號為 W-4007-650 ；羊抗鼠抗體購自北京博奧森，產品目錄號為bs-0259G ；(1)活化量子點表面氨基(-NH2)修飾的水溶性QD6502mL經20 μ 1偶聯劑 SMCC (琥珀酰亞胺4- [N-甲基馬來酸]-1-羧環己烷)活化，形成活性表面，得到活化的量子點。凝膠柱去除過量的SMCC。(2)還原羊抗鼠抗體羊抗鼠抗體2mL中加入還原劑DTT 25 μ 1 (dithiothreitol， 二硫蘇糖醇)，斷開二硫鍵形成的巰基。凝膠柱去除DTT。(3)將活化的量子點和還原的羊抗鼠抗體混合，37°C反應1小時，10 μ 1 beta-巰 基乙醇終止反應，形成量子點標記的羊抗鼠抗體。三、用步驟一所述試劑盒檢測樣品中殘留的喹諾酮類化合物方法方法如下1、樣品前處理樣品為豬肉、雞肉等組織樣本。 將Ig動物組織勻漿后，加入4mL乙腈-0. IM氫氧化鈉混合溶液，混勻；以3000g的 速度離心IOmin ；取2mL上清液氮氣吹干，加入ImL復溶液溶解干燥的殘留物，再加入ImL正 己烷充分混合，3000g離心5min，取下層溶液用復溶液稀釋倍數2獲得樣本溶液，進行試驗 分析；所述乙腈-0. IM氫氧化鈉混合溶液是由體積比為84 16的乙腈和濃度為0. IM氫氧 化鈉水溶液混合得到；所述復溶液為將所述濃縮復溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液稀釋10倍得到的。2、檢測向步驟一獲得包被有包被原(諾氟沙星半抗原與卵清蛋白偶聯物)的量子點熒光 板微孔中加入諾氟沙星標準品溶液或樣本溶液50 μ 1，再加入諾氟沙星單克隆抗體工作液 50 μ 1，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應30min ；倒出孔中液體，每孔加入250 μ 1洗滌液， 30秒后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干；每孔加入量子點標記的羊 抗鼠抗抗體工作液100mL，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重復洗滌步驟；用熒光 酶標儀，測定每孔熒光強度值。3、結果分析用所獲得的每個濃度的標準品溶液的熒光強度平均值(B)除以第一個標準溶液 (0標準)的熒光強度值(BO)再乘以100%，即百分熒光值。計算公式為百分熒光值(%) = (B/BO) X 100%以諾氟沙星標準品溶液的濃度(μ g/L)的半對數值為X軸，百分熒光值為Y軸，繪 制標準曲線圖(圖1)。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分熒光值，相對應每一個樣品的濃 度則可從標準曲線上讀出樣本中喹諾酮類化合物的殘留量。本發明中檢測結果的分析也可 以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發明中檢測結果的分析還可以利用計算機專 業軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1. 5小時可以完成。按照上述方法獲得三批試劑盒(01批、02批、03批)。實施例2、試劑盒靈敏度、準確度和保存期試驗一、試劑盒靈敏度實驗對零標準溶液(即稀釋液為pH7.4、0.05M的磷酸鹽緩沖液)進行20次檢測，測定 結果的平均值加上3倍標準差作為試劑盒的最低檢測限。表1零標準測定結果統計表 yg/L 由表1可知，試劑盒的最低檢測限為0. 5μ g/L。二、標準品精密度試驗從實施例1中所述的三批試劑盒(01批、02批、03批)中每批抽取10個試劑盒，
測定4. 5 μ g/L標準品溶液的發光強度值，計算變異系數。檢測方法與實施例1中實驗三所
述一致。實驗設3次重復，結果如表2所示，表明變異系數范圍在5. 3% 14. 6%之間，符 合精密度小于或等于20%的規定。表2標準可重復性試驗(CV % ) 三、樣本精密度和準確度試驗1、樣品精密度試驗將不含喹諾酮類化合物的豬肉、雞肉按照實施例1的方法進行樣品前處理后，添 加諾氟沙星標準品，使其終濃度為10μ g/kg。從實施例1中所述的三批試劑盒(01批、02 批、03批)中每批抽取3個試劑盒，進行實驗，每個實驗重復5次，分別計算變異系數，結果 如表3-4所示。結果表明豬肉、雞肉樣本的變異系數均小于20%，符合了《農業部文件》農 醫發200517號附件2試劑盒備案參考評判標準。表3豬肉樣本可重復性試驗 表4雞肉樣本可重復性試驗 2、樣本準確度試驗將不含喹諾酮類化合物的豬肉、雞肉按照實施例1中所述的樣品前處理方法進行 處理，然后向每種組織中加入諾氟沙星標準品，使其終濃度分別為20μ g/kg和100μ g/kg ； 然后用實施例1中所述的試劑盒檢測豬肉、雞肉中喹諾酮類化合物，每個濃度做4個平行， 分別計算準確度(準確度=實測值/添加值)。結果如表5所示，表明各樣本以20 μ g/kg、 100 μ g/kg諾氟沙星添加回收率均在75. 2% -99. 之間。表5試劑盒的準確度
四、交叉反應率試驗選擇與喹諾酮類化合物有類似結構和類似功能的13種藥物測定交叉反應率。通 過各種藥物的標準曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反 應率。交叉反應越小，那么此試劑盒對喹諾酮類化合物的檢測特異性就越好。交叉反應率 (%)=(抑制50%諾氟沙星的濃度/抑制50%的喹諾酮類化合物類似物濃度)*100%表6試劑盒的特異性
藥物名稱交叉反應率(％)
環丙沙星100
恩諾沙星95
氧氟沙星120
諾氟沙星170
達氟沙星89
氟甲喹85 實驗結果表明，本發明所研制的試劑盒對環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙 星、達氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星的特異性好。五、試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2-8 °C，保存6個月后，測定試劑盒的50 %抑制濃度、喹諾酮類化合物實際添加測定，結果表明試劑盒的50%抑制濃度均在正常范圍之內。考慮在運輸和 使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37°C保存的條件下放置6天，進行加速 老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑 盒放入-20°C冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出 試劑盒可以在2_8°C至少可以保存6個月以上。
權利要求
一種檢測喹諾酮類化合物的量子點熒光免疫試劑盒，包括喹諾酮類化合物特異性抗體、包被原和標準品溶液所述包被原為喹諾酮類化合物半抗原與載體蛋白的偶(式I)。FSA000002.tif
2.根據權利要求1所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括濃 縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和量子點標記抗抗體；所述試劑盒由喹諾酮類化合物特異性抗體、包被原、標準品溶液、濃縮洗滌液、濃縮復 溶液、包被緩沖液、封閉液和量子點標記抗抗體組成。
3.根據權利要求1或2所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述喹諾酮類化合物特異性抗體為諾氟沙星單克隆抗體或諾氟沙星多克隆抗體，所述 諾氟沙星單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 3779的對11種喹諾酮類化合物(恩諾沙星、 氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星 和依諾沙星)都有交叉反應的諾氟沙星單克隆雜交瘤細胞株QNs分泌的抗體。
4.根據權利要求1-3中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述標準品溶液中標準品的濃度為ο μ g/L、0. 5 μ g/L、l. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、22. 5 μ g/L 或112. 5μ g/L，所述標準品為諾氟沙星；所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮化鈉和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖 液混合得到溶液；所述濃縮復溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的磷酸 鹽緩沖液混合得到的溶液；所述包被緩沖液是PH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液； 所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH值 為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。
5.根據權利要求1-4中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于 所述包被原是按照如下方法制備得到的將每70mg載體蛋白溶于ImL 0. OlM PBS緩沖液中，再加入30mg乙基二甲氨基碳化二 亞胺，25°C攪拌8h，稱為A液；將40mg喹諾酮類化合物半抗原溶于ImL 0. OlM PBS緩沖液，稱為B液； 將B液加入到A液中，25°C攪拌反應12h，將得到的產物透析，得到所述包被原； 所述喹諾酮化合物半抗原的結構式如式II所示 (式 II)。
6.根據權利要求1-5中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述喹諾酮化合物半抗原是按照如下方法制備得到的1、將每320mg喹諾酮化合物與 143 μ L 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亞砜中，再加入700mg碳酸鉀和30mg碘化鈉， 70°C回流提取3天，再靜置1天；II、用乙酸乙酯對步驟I得到的產物進行萃取，取有機相， 將有機相干燥，得固體殘留物；III、將固體殘留物加到2mL IM氫氧化鈉水溶液和500μ L乙 醇中，70°C反應8h，得到喹諾酮半抗原。
7.根據權利要求1-6中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述量子點標記抗抗體為量子點QD650標記羊抗鼠抗抗體；所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優選為卵清蛋白；所述喹諾酮類化合物為環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、 噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依諾沙星。
8.—種檢測喹諾酮類化合物的方法，包括以下步驟1)樣品前處理將每Ig動物組織勻漿后，加入4mL乙腈-0. IM氫氧化鈉混合溶液，混勻；以3000g的速 度離心IOmin ；取2mL上清液氮氣吹干，加入ImL復溶液溶解干燥的殘留物，再加入ImL正 己烷充分混合，3000g離心5min，取下層溶液用復溶液稀釋2倍獲得樣本溶液，所述動物組 織為豬肉或雞肉；所述乙腈-0. IM氫氧化鈉混合溶液是由體積比為84 16的乙腈和濃度 為0. IM氫氧化鈉水溶液混合得到；所述復溶液為將所述濃縮復溶液用0. 05mol/L、pH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍得到的；2)利用權利要求1-7中任一所述的檢測喹諾酮類化合物的量子點熒光免疫試劑盒檢 測步驟1)中的樣本溶液；所述喹諾酮類化合物為環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、 噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星或依諾沙星。
9.由保藏號為CGMCCNo. 3779的對11種喹諾酮類化合物都有交叉反應的諾氟沙星單 克隆雜交瘤細胞株QNs分泌的喹諾酮類化合物單克隆抗體。
10.保藏號為CGMCCNo. 3779的對11種喹諾酮類化合物都有交叉反應的諾氟沙星單克 隆雜交瘤細胞株QNs。
全文摘要
本發明公開了一種檢測喹諾酮類化合物的方法及其專用量子點熒光免疫試劑盒。本發明提供的檢測喹諾酮類化合物的量子點熒光免疫試劑盒，包括喹諾酮類化合物特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為喹諾酮類化合物半抗原與載體蛋白的偶聯物。本發明的實驗證明，本發明的試劑盒具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現場監控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號C12R1/91GK101915844SQ20101024408
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者史為民, 吳聰明, 張素霞, 曹興元, 湯樹生, 沈建忠, 王戰輝, 程林麗 申請人:中國農業大學