專利名稱：一種檢測磺胺類化合物的方法及其專用量子點熒光免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測磺胺類化合物的方法及其專用量子點熒光免疫試劑盒。目前其中獸藥殘留問題是影響動物性食品安全的最主要因素之一，由于動物樣本 成分復雜，待測物濃度較低，而且大多數取樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提 出了更高的要求。量子點(Quantum dot,QD)由于具有獨特的光學和電學性質，使其熒光免 疫分析中得到越來越多的應用，作為熒光探針，QD的光學特性比在免疫熒光分析法中經常 采用的傳統發色團如羅丹明6G或其它有機染料分子有明顯的優越性QD的激發光譜寬，且 連續分布，而發射光譜呈對稱分布且寬度窄，熒光發射波長可通過改變量子點的大小而加 以調節，因而不同大小的半導體量子點能被單一波長的光激發而發出不同顏色的熒光。量 子點可持續發光，其熒光壽命可達染料分子的100倍以上，比常規的酶聯免疫吸附檢測方 法的抗背景干擾能力強，自動化程度高，提高了分析方法的精密度，在獸醫學、醫學、食品分 析等方面將會有更廣闊的應用前景。磺胺類化合物(Sulfonamides，SAs)是一類廣譜抗菌藥，臨床上主要用于預防和 治療細菌感染性疾病，還常作為飼料添加劑在動物生產中長期應用。然而，磺胺藥會引起人 過敏性反應，人體中長期存在磺胺類化合物會導致許多細菌對磺胺類化合物產生耐藥性， 且可能有致癌性。因此，我國農業部第235號文件規定其殘留限量為100yg/kg。但由于磺 胺類化合物的成本較低，價格便宜，在畜牧生產中不合理使用現象嚴重，使其在動物性食品 中殘留引起生態環境污染和人類健康危害的潛在威脅已倍受關注。動物組織中磺胺類化合 物殘留的檢測方法主要采用液相色譜法、液相色譜_聯質譜法、酶聯免疫法等。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測磺胺類化合物的量子點熒光免疫試劑盒。本發明提供的檢測磺胺類化合物的量子點熒光免疫試劑盒，包括磺胺類化合物特
異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為磺胺類化合物半抗原與載體蛋白的偶
權利要求
一種檢測磺胺類化合物的量子點熒光免疫試劑盒，包括磺胺類化合物特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為磺胺類化合物半抗原與載體蛋白的偶聯物；其結構式如式I所示(式I)。FSA000002.tif
2.根據權利要求1所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括濃 縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和量子點標記的抗抗體；所述試劑盒由磺胺類化合物特異性抗體、包被原、標準品溶液、濃縮洗滌液、濃縮復溶 液、包被緩沖液、封閉液和量子點標記抗抗體組成。
3.根據權利要求1或2所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述磺胺類化合 物特異性抗體為磺胺甲惡唑單克隆抗體或磺胺甲惡唑多克隆抗體，所述磺胺甲惡唑單克隆 抗體是由保藏號為CGMCC No. 3780的對9種磺胺類化合物(磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺 胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺 胺對甲氧嘧啶)都有交叉反應的磺胺甲基異惡唑單克隆雜交瘤細胞株SAs分泌的抗體；所述量子點標記的抗抗體中所述量子點為QD650。
4.根據權利要求1-3中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述標準品 溶液中標準品的濃度為 0μ g/L、0. 5μ g/L、l. 5μ g/L、4. 5μ g/L、22. 5μ g/L 或 112. 5μ g/L， 所述標準品為磺胺甲惡唑；所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮化鈉和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖 液混合得到溶液；所述濃縮復溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的磷酸 鹽緩沖液混合得到的溶液；所述包被緩沖液是PH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH值 為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。
5.根據權利要求1-4中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制備得到的a、將每52mg磺胺類化合物半抗原加入6mL 0. 25M的硫酸水溶液中，得到的溶液稱為A液；將每80mg的載體蛋白溶于4mL濃度為IOOmg/ mL、pH值為10的碳酸鈉水溶液中，得到的溶液稱為B液；將每20mg亞硝酸鈉溶于2mL水得 到的溶液稱為C液；在0°C條件下，將C液加入到A液中得到的混合物稱為D液；b、將D液逐滴加入到B液中，得到D液和B液的混合液；逐滴加入的方式為從開始加入 時計起，6min后開始攪拌混合液，并使混合液的pH保持在9_10之間，滴加完畢后，繼續攪拌 反應4h，將得到的產物透析，得到所述包被原；(式 I)。所述磺胺甲惡唑半抗原的結構式如式II所示
6.根據權利要求1-5中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于 所述磺胺類化合物半抗原為磺胺甲惡唑。
7.根據權利要求1-6中任一所述的量子點熒光免疫試劑盒，其特征在于 所述量子點標記抗抗體為量子點QD650標記的羊抗鼠抗抗體；所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優選為卵清蛋白；所述磺胺類化合物為磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺 胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪或磺胺對甲氧嘧啶。
8.—種檢測磺胺類化合物的方法，包括以下步驟1)樣品前處理將每Ig動物組織勻漿后，加入4mL的乙腈-鹽酸混合液振蕩混合lmin，以3000g的 速度離心5min，將2mL上清液用氮氣吹干，加入ImL復溶液溶解干燥的殘留物，再加入ImL 正己烷混合，3000g離心5min，取下層溶液用復溶液稀釋2倍后獲得待測樣本溶液，所述乙 腈-鹽酸混合液是由體積比為84 16的乙腈和濃度為0. IM鹽酸水溶液混合得到；所述動 物組織為豬肉或雞肉；所述復溶液為將所述濃縮復溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液稀釋10倍得到的；2)利用權利要求1-7中任一所述的檢測磺胺類化合物的量子點熒光免疫試劑盒檢測 步驟1)中的樣本溶液；所述磺胺類化合物為磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺 胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪或磺胺對甲氧嘧啶。
9.由保藏號為CGMCCNo. 3780的對9種磺胺類化合物都有交叉反應的磺胺甲基異惡唑 單克隆雜交瘤細胞株SAs分泌的磺胺類化合物單克隆抗體。
10.保藏號為CGMCCNo. 3780的對9種磺胺類化合物都有交叉反應的磺胺甲基異惡唑 單克隆雜交瘤細胞株SAs。
全文摘要
本發明公開了一種檢測磺胺類化合物的方法及其專用量子點熒光免疫試劑盒。本發明提供的檢測磺胺類化合物的量子點熒光免疫試劑盒，包括磺胺類化合物特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為磺胺類化合物半抗原與載體蛋白的偶聯物。本發明的實驗證明，本發明的試劑盒具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現場監控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號C12N5/20GK101936983SQ20101024417
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者史為民, 吳聰明, 張素霞, 曹興元, 湯樹生, 沈建忠, 王戰輝, 程林麗 申請人:中國農業大學