一種檢測量子點-蛋白結合動力學的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米生物技術領域，具體涉及一種檢測量子點-蛋白結合動力學的方法。
【背景技術】
[0002]量子點(QDs)作為一種新型熒光材料，具有激發光譜寬、發射光譜窄而對稱、顏色可調、抗光漂白和熒光壽命長等優點。這些優越的性能使QDs廣泛用于細胞成像和生物標記，逐漸成為細胞成像研宄中非常重要的一種探針工具。
[0003]目前，在生物標記中應用最廣泛的是金屬有機溶劑法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子點。因此，可通過親水性配體交換、兩親性配體封裝、硅烷涂層等方法將脂溶性量子點轉換為水溶性量子點。水溶性量子點可與蛋白通過共價偶聯或靜電吸附的方法制備量子點熒光探針。然而，量子點與蛋白結合的動力學研宄甚少。
[0004]在生物化學中，若已經有配體分子結合在一個高分子上，那么新的配體分子與這個高分子的結合作用就常常會被增強(亦被稱作協同結合)。以阿奇博爾德.希爾命名的希爾系數提供了量化這種效應的方法。此方程描述了高分子被配體飽和的分數是一個關于配體濃度的函數；被用于確定受體結合到酶或受體上的合同性程度。
[0005]目前，希爾方程被廣泛用于物理，體育，航空科技等各個方面。依賴于希爾方程及其實驗曲線的人體肌肉功率，是衡量人體運動素質的重要指標。希爾方程還被用來找出起重機吊重做減幅擺動的條件，繪制希爾方程穩定圖，即起重機吊重做減幅擺動的圖示。運用希爾方程，來研宄空間交會對接控制方法；研宄周期性經典軌道的穩定性；進行遠距離攔截等。然而，還未有人研宄過希爾方程在納米技術方面的應用。
[0006]另一方面，毛細管電泳作為一種高分辨、高靈敏、高速度、高通量及低樣品消耗的微分離技術，在生物分析領域具有廣闊的應用前景。毛細管電泳可很好地分離QDs與生物偶聯物。目前，毛細管電泳的檢測方法主要有紫外-可見檢測、電化學檢測、化學發光檢測、質譜檢測、熒光檢測。其中，熒光檢測法的檢出限比一般的紫外檢測小3個數量級左右，對QDs與蛋白相互作用的研宄十分靈敏。目前，對于量子點-蛋白結合動力學的研宄很少，包括熒光光譜方法、凝膠色譜方法等，但這些方法分辨率都較低，很難清晰地將量子點-蛋白復合物分離。在此，我們運用希爾方程來研宄量子點-蛋白結合動力學，計算蛋白吸附到量子點結合位點時，蛋白濃度與結合位點的被占分數之間的關系。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題是:為了研宄蛋白與量子點之間細微的動力學變化問題，提高其在生物領域中的應用。為解決上述技術問題，本發明提供一種檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，通過熒光毛細管電泳管外和管內檢測量子點與蛋白自組裝。并經希爾方程計算蛋白吸附到量子點結合位點時，蛋白濃度與結合位點的被占分數之間的關系。
[0008]本發明所采用的技術方案為:一種檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，通過熒光毛細管電泳來研宄量子點與蛋白之間的結合動力學，并由希爾方程擬合其結合動力學曲線。
[0009]進一步地，所述的通過熒光毛細管電泳來研宄量子點與蛋白之間的結合動力學包括研宄量子點與蛋白在毛細管外和毛細管內的結合動力學變化。
[0010]進一步地，所述的希爾方程為:Θ =[蛋白]V(KDn+[蛋白]n);其中Kd為表觀解離常數，描述每個結合位點對于蛋白配體的親和性；n為結合常數，描述了協同性；Θ為QDsb_d/QDst()tal描述了占用位點的分數。
[0011]作為優選，所述的量子點為含有CM的量子點。
[0012]作為優選，所述的含有Cd的量子點包括CdSe、CdTe, CdS。
[0013]作為優選，所述的蛋白包括用還原劑NaBH4變性的蛋白。
[0014]作為優選，所述的用還原劑NaBH/變性的蛋白包括變性牛血清蛋白、變性卵清蛋白、變性轉鐵蛋白。
[0015]采用上述的技術方案后，本發明取得的有益效果是，本發明提供的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，適用于研宄量子點與蛋白在毛細管外和毛細管內的結合動力學變化，拓寬了毛細管電泳的應用，并為量子點生物探針的進一步應用提供了理論基礎；而運用希爾方程可以同時得到兩個參數，即表觀解離常數Kd和結合常數η。
【附圖說明】
[0016]圖1A是不同摩爾比的QDs和dBSA在毛細管內自組裝的電泳圖；圖1B是不同摩爾比的QDs和dBSA在毛細管外自組裝的電泳圖。
[0017]圖2是毛細管內隨dBSA濃度不同，希爾方程擬合的動力學曲線，(a)毛細管內，(b)毛細管外。
【具體實施方式】
[0018]
[0019]本發明將就以下實施例作進一步說明，但應了解的是，這些實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施的限制。
[0020]實施例1
[0021]毛細管內檢測dBSA與QDs動力學
[0022]1、脂溶性QDs經GSH轉換為水溶性QDs
[0023]將18mg GSH, 5mg KOH，250 μ L甲醇混勻，取40 μ L混合溶液加入200 μ L脂溶性量子點中，振蕩30min。振蕩結束后，加入200 yL ImM NaOH，脂溶性量子點即轉移到水相中。取出上層量子點，加入ImL甲醇與30 μ L NaCl溶液(30mg/mL)沉淀，溶于pH 7.4硼酸緩沖液中。反復沉淀兩次，最后溶于200 yL pH7.4硼酸緩沖液中。轉換后QDs的濃度不變。
[0024]2、dBSA溶液的制備
[0025]dBSA溶液通過似8!14與BSA反應制得。主要的步驟如下:0.33g BSA溶于10mLpH 7.4硼酸緩沖液中，然后邊攪拌邊加入0.008g NaBH4,室溫下攪拌lh，然后升至70°C直至沒氣體(H2)產生。最后dBSA溶液的濃度為5X 10_5mOl/L。
[0026]3、QDs 與 dBSA 偶聯
[0027]不同比例的dBSA和QDs在毛細管內自組裝，其中，先進QDs 10s，間隔60s后再進dBSA 1s0
[0028]4、熒光毛細管電泳分析檢測
[0029]我們在毛細管內檢測時，隨著dBSA濃度的增大，QDs的電泳峰在逐漸減小，復合物的電泳峰逐漸增大，在32:1時反應完全(圖1A)。根據Sramplex/St(rtal和dBSA濃度的關系，經希爾方程擬合得到QDs和dBSA動力學曲線(圖2，曲線a)。通過希爾方程計算得Kd為
8.8 X 1^6M, η 為 2.6，R2為 0.998。
[0030]實施例2
[0031]毛細管外檢測dBSA與QDs動力學
[0032]步驟I和2同實施例1。
[0033]3、QDs 與 dBSA 偶聯
[0034]不同比例的dBSA和QDs在毛細管外自組裝反應60s，再進樣20s后電泳檢測。
[0035]4、熒光毛細管電泳分析檢測
[0036]我們在毛細管外檢測時，隨著dBSA濃度的增大，QDs的電泳峰在逐漸減小，復合物的電泳峰逐漸增大，在16:1時反應完全(圖1B)。根據Sramplex/St(rtal和dBSA濃度的關系，經希爾方程擬合得到QDs和dBSA動力學曲線(圖2，曲線b)。通過希爾方程計算得Kd為2.8 X 1^6M, η 為 2.8，R2為 0.994。
[0037]以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的范圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性范圍并不局限于說明書上的內容，必須要根據權利要求范圍來確定其技術性范圍。
【主權項】
1.一種檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，其特征在于:通過熒光毛細管電泳來研宄量子點與蛋白之間的結合動力學，并由希爾方程擬合其結合動力學曲線。
2.根據權利要求1所述的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，其特征在于:所述的通過熒光毛細管電泳來研宄量子點與蛋白之間的結合動力學包括研宄量子點與蛋白在毛細管外和毛細管內的結合動力學變化。
3.根據權利要求1或2所述的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，其特征在于:所述的希爾方程為:Θ =[蛋白]n/(KDn+[蛋白]n);其中Kd為表觀解離常數，η為結合常數，Θ 為 QDs bound /QDstotalo
4.根據權利要求1?3任一項所述的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，其特征在于:所述的量子點為水溶性含有Cd量子點。
5.根據權利要求4所述的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，其特征在于:所述的量子點包括經CdSe、CdTe、CdS。
6.根據權利要求1?3所述的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，其特征在于:所述的蛋白包括用還原劑NaBH/變性的蛋白。
7.根據權利要求6所述的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，其特征在于:所述的用還原劑NaBH/變性的蛋白包括變性牛血清蛋白、變性卵清蛋白、變性轉鐵蛋白。
【專利摘要】本發明涉及納米生物技術領域，具體涉及一種檢測量子點-蛋白結合動力學的方法。本發明所采用的技術方案為：一種檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，通過熒光毛細管電泳來研究量子點與蛋白之間的結合動力學，并由希爾方程擬合其結合動力學曲線。采用上述的技術方案后，本發明取得的有益效果是，本發明提供的檢測量子點-蛋白結合動力學的方法，適用于研究量子點與蛋白在毛細管外和毛細管內的結合動力學變化，拓寬了毛細管電泳的應用，并為量子點生物探針的進一步應用提供了理論基礎。
【IPC分類】G01N27-26
【公開號】CN104764776
【申請號】CN201510129253
【發明人】王建浩, 李靜燕, 蔣鵬舉, 邱琳, 李進晨, 王車禮, 秦玉琴, 柳麗, 滕一萬
【申請人】常州大學
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月23日