專利名稱：：Cyp2c9、cyp2c19基因突變檢測液相芯片及其檢測方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及苯妥英鈉代謝相關基因CYP2C9、CYP2C19突變檢測液相芯片及其檢測方法。
背景技術：
：苯妥英鈉為抗癲癇藥、抗心律失常藥，常用于顱腦手術后癲癇的預防，以及癲癇尤其是癲癇大發作的治療。這種藥物始用于20世紀初，長期作為治療癲癇的一線藥物，其療效雖好但有較多與劑量相關的不良反應，且個體差異很大。患者若使用劑量不足，藥物不能達到預期療效；而稍有過量，又會對患者的神經系統造成嚴重的毒副作用。苯妥英鈉的毒副作用常見為齒齦增生，兒童發生率高；對神經系統的不良反應常見為眩暈、頭痛，嚴重時可引起眼球震顫、共濟失調、語言不清和意識模糊；此外，血液系統、骨骼系統以及消化系統亦會受到用藥劑量不當的影響。大量的臨床研究已經證實，苯妥英鈉的療效與患者體內兩個基因的突變關系密切，即CYP2C9和CYP2C19。苯妥英鈉70。/。90y。由CYP2C9代謝；而CYP2C19是其代謝過程中最重要的次級代謝酶，CYP2C19的作用隨藥物濃度的升高而增強。CYP2C9和CYP2C19對降低苯妥英鈉毒性和促使其排泄出體外具有關鍵作用。在中國人群中，CYP2C9常見的功能減弱等位基因突變型為CYP2C^2和CYP2C9+3,其中CYP203基因分布頻率約2.5%;CTP2C19常見的功能減弱等位基因突變型為CTP2C19+2和子3;CYP2C9求3為A1075C突變，發生在外顯子7;CYP2C1W2為G681A突變，發生在外顯子5;CYP2C19+3為G636A突變，發生在外顯子4。這些等位基因的突變使酶活性降低，對藥物代謝的能力隨著等位基因的不同組合而呈現出一定的規律性，表現出正常基因純合子〉正常基因與突變基因雜合子>突變基因純合子或雜合子的變化趨勢，即我們通常所說的基因劑量效應。大量研究表明，攜有一個或以上功能減弱等位基因突變的患者，在接受苯妥英鈉治療時，如果不適當減少劑量，將面臨較大的毒副作用風險。目前已建立了若干以PCR為基礎的檢測CYP2C9和CYP2C19基因SNPs的技術，如直接測序法，半定量PCR技術，PCR—單鏈構象多態性分析(SSCP)檢測，以上技術具有靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高等缺點，普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測通量的局限性不能滿足臨床的需要。而聚合酶鏈式反應一限制性片段長度多態(PCR—RFLP)分析技術和基于TaqMan技術的等位基因差異分析法一次只能進行一種突變的檢測，耗時費力；傳統的固相芯片價格昂貴，而且敏感性不高，檢測結果的可重復性差。基于芯片的原理，美國Luminex公司開發出了以微球為載體的懸浮液相芯片技術。該項技術利用聚苯乙烯微球作為反應的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸和蛋白質等生物大分子進行高通量的多指標并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結合了針對不同待檢測物的蛋白質或核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統的讀取。Luminex閱讀系統分別激發紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強度，并根據微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標記物的熒光強度，再通6過機器與計算機自動統計分析激光所檢測到微球種類、數量，從而判定待測樣本多種目標測試物各自的濃度。因此，液相芯片技術既滿足了高通量檢測的要求，同時具備了快速準確，靈敏度高，特異性好，結果重復性好等優點。我們采用x-Taq液相芯片技術可以同時檢測多種突變，實現高通量快速簡便化操作，大大提高了檢測效率，在同類檢測技術中處于領先地位。
發明內容本發明的目的之一是提供與苯妥英鈉療效密切相關的CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測CYP2C9基因的兩種常見突變等位基因CYP2CW2和CTP2C9"，以及CYP2C19基因的兩種常見突變等位基因CYP2C1W2和CYP2C19沐3。一種CYP2C9和/或CYP2C19基因突變檢測液相芯片，包括有(1).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.9SEQIDNO.16中的序列；(2).針對每種型別的突變分別設計的野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由3'端的針對目的基因突變位點的特異性序列和5'端的tag序列組成，所述tag序列能相應地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述野生型及突變型特異性序列分別選自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和/或SEQIDNO.7及SEQIDNO.8;(3).用于擴增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點的目標序列的引物。優選地，一種CYP2C9和/或CYP2C19基因突變檢測液相芯片，包括有7(1).包被有特異的anti-tag序列的8種微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti-tag序列分別為SEQIDNO.9SEQIDNO.16中的序列;(2).針對每種型別突變設計的4對野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由5'端的tag序列和3'端的針對目的基因突變位點的特異性序列組成，所述tag序列能分別相應地與(1)中所述微球上anti-tag序列互補配對；所述野生型及突變型特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和SEQIDNO.7及SEQIDNO.8;(3).用于擴增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點的目標序列的引物。更優選地，所述4對由tag序列和特異性序列組成的特異ASPE引物的為SEQIDNO.9的互補序列和SEQIDNO.l組成的引物、及SEQIDNO.IO的互補序列和SEQIDNO.2組成的引物；SEQIDNO.ll的互補序列和SEQIDNO.3組成的引物、及SEQIDNO.12的互補序列和SEQIDN0.4組成的引物;SEQIDNO.13的互補序列和SEQIDNO.5組成的引物、及SEQIDNO.14的互補序列和SEQIDNO.6組成的引物;和SEQIDNO.15的互補序列和SEQIDNO.7組成的引物、及SEQIDNO.16的互補序列和SEQIDN0.8組成的引物。優選地，(3)中所述引物為針對CYP2C9Exon3突變的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、針對CYP2C9Exon7突變的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、針對CYP2C19Exon5突變的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和/或針對CYP2C19Exon4突變的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24.以上所述間隔臂為用于將特異性的探針與微球表面間隔開來或是將特異性探針置于親水性環境中的序列。通過在探針序列與氨基之間設置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應的效率以及雜交反應的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n》3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發明間隔臂優選為5—30個T。本發明的另一目的是提供使用上述液相芯片對CYP2C9和/或CYP2C19基因突變進行檢測的方法。一種使用上述液相芯片對CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測的方法，主要包括以下步驟(一)PCR擴增待測DNA樣品，得需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點的PCR反應產物；(二)PCR反應產物用ExoSAP-IT酶進行酶切處理；(三)酶切處理后的產物用所述ASPE引物進行引物延伸反應，在反應過程中摻入生物素標記的dCTP，從而使反應后的產物帶上多個的生物素標記；(四)將對應ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應后的產物進行雜交反應；(五)雜交反應后的產物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進行反應；(六)通過熒光檢測儀檢測。本發明的主要優點在于1.本發明所提供的檢測方法、液相芯片與測序法的吻合率高達100%。所制備的CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應。2.本發明設計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準確區分各種類型的突變位點。3.本發明的檢測方法步驟簡單，四種突變檢測可通過一步多重PCR即可完成四個具有突變位點的目標序列的擴增，避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發明所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合臨床需要。5.本發明不僅克服了傳統固相芯片敏感性不高，檢測結果的可重復性差的缺陷，同時對現有的液相芯片技術進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。具體實施例方式實施例lCYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片試劑盒，主要包括有一、ASPE引物針對CYP2C9和CYP2C19基因的各兩種常見突變等位基因分別設計特異性的引物序列。ASPE引物由1"38+特異性序列組成，特異性序列設計的原則是特異性序列的3'末端為突變位點；用于檢測一個基因突變位點野生型與突變型的特異性引物應當來自DNA的同一條鏈；特異性引物的退火溫度應當在51'C-56。C之間；引物長度一般在18-22bp之間。ASPE引物序列如下表所示表lASPE引物序列特異性序列基因夕卜顯子類型ASPE引物(tag-特異性序列)(SEQNO.)10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>每條ASPE引物包括兩個部分，5'端為針對相應微球上anti-tag序列的特異性tag序列(如表2所示)，3'端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表l所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據所設計的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級結構，選擇的八種tag序列及其微球上相應的anti-tag序列如表2所示表2ASPE特異性引物右端的Tag序列及微球上對應的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>突變'發生在外顯子5;CYP2C1W3為G636A突變，發生在外顯子4。設計四對引物(見表3)，分別擴增出四條具有突變位點的目標序列。表3擴增出具有突變位點的目標序列的引物SEQNO.基因外顯子類型擴增引物17CYP2C9Exon3C430T-Forward5，GGATGGMAACAGAGACTTAC3，18C430T-Reverse5'AAGGTCAGTGATATGGAGTAG3'19Exon7A1075C-Fo擺rd5'CCATCCTCTCTTTAAGTTTGC3'20A1075C-Reverse5'ACTATGMTTTGGGGACTTCG3'21CYP2C19Exon5G681A-Forward5'CAGAGCTTGGCATATTGTATC3'22G681A-Reverse5，AGTAAACACAMACTAGTCAATG3，23Exon4G636A-Forward5'GGAATTCATAGGTAAGATATTAC3'24G636A-Reverse5'AAAATGTACTTCAGGGCTTGG3，實施例2運用CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml):試劑來源終濃度每250ml的用量MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)SigmaM-29330.05M2.44g5MNaOHFisherSS256-500---5滴2XTm雜交緩沖液14試劑來源終濃度每250ml的用量lMTris-HCl'pH8.0Sig腿T30380.2M50ml5MNaClSigmaS51500.4M20mlTritonX-100SigmaT87870.16%0.4ml過濾后貯存于4'C。ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。生物素標記的dCTP購自上海生工生物工程技術服務有限公司。一、樣本的DNA提取.-參照AxyPr印全血基因組小量提取試劑盒說明，詳細步驟如下1.取抗凝靜脈血或胸腔積液約2.5ml，3000rpm離心15分鐘，取30(^1上清加到一個1.5ml干凈無菌的離心管中；2.向離心管中加入50(Hi1AP1緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；3.加入10(V1AP2緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；4.室溫下12，OOOrpm離心lO分鐘；5.小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPr印中，蓋上蓋子，以6，OOOrpm離心l分鐘；6.倒掉廢液收集管中的廢液，用80(V1緩沖液W1洗滌1次，以6，OOOrpm離心l分鐘；7.倒掉廢液收集管中的廢液，加入800(il緩沖液W2'以12，OOOrpra離心l分鐘；倒掉廢液收集管中的廢液，加入500iil緩沖液W2，以12，OOOrpm離心l分鐘，棄掉廢液；158.將吸附柱AxyPr印放回空收集管中，12，OOOrpm離心l分鐘；9.將吸附柱AxyPr印置于一干凈無菌的1.5ml離心管中，加入40plTE緩沖液，室溫下放置l分鐘，12，OOOrpm離心l分鐘洗脫DNA，電泳檢測，-2(TC保存。二、待測樣品的PCR擴增利用Primer5.0設計的四對引物，多重PCR—步擴增出CYP2C9的外顯子3和外顯子7，以及CYP2C19的外顯子5和外顯子4共四條具有突變位點的目標序列，產物大小分別為306bp、399bp、322bp、374bp。引物序列(SEQNO.17-24)見上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液分別各取SEQNO.17-24的引物貯存液100ul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為多重PCR引物工作液。多重PCR反應體系如下IOX緩沖液(含Mg勺5uldNTP(各2.5,1/L)4ulTaq酶(5L)/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各12.5pmol/mL)8ul模板DNA(10ng/ul)1ulddH2031.5ul共50ulPCR擴增程序為95°C3min;94。C20s，56°C30s，72°C30s，30個循環；72°ClOmin;4'C保存備用。三、PCR產物的酶切處理參照ExoSAP-IT試劑盒說明，詳細步驟如下1.取7.5ulPCR反應后的產物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37'C孵育15min。80'C孵育15min，使多余的酶滅活。酶切處理后的產物直接用于后續的ASPE引物延伸反應。四、位點特異的引物延伸反應(ASPE)利用上述設計的位點特異性引物進行引物延伸反應，在反應過程中摻入生物素標記的dCTP,從而使反應后的產物帶上多個的生物素標記。首先配制混合的ASPE引物工作液分別各取C430Ti、C430T-m、/U075Ci、A1075C-m、G681A-w、G681Ai、G636Ai、G636A-m相應的ASPE引物C存液10ul于1.5ml微量離心管中，加入10mmol/LTrisBuffer補至200ul，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應的體系如下IOX緩沖液2ulMgCl2(50,1/L)0.5ulBiotin-dCTP(400uraol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)1ulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)1ul酶切處理的PCR擴增產物5ulddH2010.ul共20ulPCR程序為:96。C2min;94°C30s'58°Clmin，72°C2min，30個循環；4"C保存備用,五、雜交反應1.根據設計的ASPE引物，選擇相應的最優的八種FlexMAP微球(微球濃度均為2.5X105個/ral)。每種微球分別帶有不同顏色編碼，同時每種微球表面分別連接有一段24bp的特異性的寡核苷酸序列(anti-tag)，這些anti-tag序列能分別與對應的ASPE引物3'端的tag序列特異結合；本實施例每組樣品檢測中都分別選擇LUA45,LUA16,LUA17,LUA40,LM55，LUA32,LUA23，LUA31共八種微球；2.分別取lul每種編號的微球于l.5ml的微量離心管中；3.微球于》10000g離心l-2min;4.棄去上清，微球重懸于100ul的2XTm雜交緩沖液中，渦旋混勻；5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應的孔中，對照孔加25ul的ddH20;6.取5-25ul的ASPE反應液于相應的孔中，用ddH20補足至50ul;7.用錫箔紙包住96孔板以避光，95°C60s，37°C15min孵育雜交；8.雜交后的微球于》3000g離心2—5min;9.去上清，將微球重懸于75ul的lXTm雜交緩沖液中；10.微球于》3000g離心2—5min;11將微球重懸于75ul的lXTm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ug/ml的鏈酶親和素-藻紅蛋白(SA-PE);12.37。C孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結果檢測與數據分析反應后產物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應的載體，以熒光檢18測儀作為檢測平臺，對核酸分子進行高通量的多指標并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標記物就形成完整的微球檢測體系用于L咖inex系統的讀取。Luminex閱讀系統分別激發紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，檢測結果如表4和表5所示。對熒光值(MFI)和數據處理有以下要求1.每個位點需至少有一個等位基因MFI大于300而且大于10XPCR陰性對照MFI;2.NETMFI=樣品MFI—PCR陰性對照MFI(NETMFI小于O的以O表示)；3.滿足以上兩個條件的數據，按下列公式計算突變比值突變比值=突變型NETMFI+(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據經驗對每個檢測位點的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測20份樣本的CYP2C9和CYP2C19基因突變，實驗數據符合上述要求，因此可計算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設置如下突變比值范圍在0%-20%視為野生型純合子；30%-70%視為雜合子；80%-100%視為突變型純合子。以測序法檢測與液相芯片結果作對照，計算本發明所提供的分型方法檢測結果的吻合率。本方法檢測20份樣本的CYP2C9和CYP2C19基因突變型檢測結果與測序結果吻合率達到100M。可見本發明所提供的CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片能夠準確地檢測出CYP2C9和CYP2C19基因突變類型，且結果穩定可靠。表4樣本檢測結果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表5樣本CYP2C9和CYP2C19突變類型分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>1710151野生型純合子*3突變型和野生型雜合子野生型純合子*3突變型和野生型雜合子180010野生型純合子野生型純合子野生型純合子野生型純合子1902960野生型純合子*2突變型突變型純合子野生型純合子*2突變型突變型純合子200110野生型純合子野生型純合子野生型純合子野生型純合子22序列表〈110〉廣州益善生物技術有限公司〈120〉CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片及其檢測方法〈160>24<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>19<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉1aagaggagcattgaggacc19〈210〉2〈211〉19〈212〉■<213>人工序列〈400〉2aagaggagcattgaggact1923〈210〉3〈211〉19〈212〉廳〈213〉人工序列〈400〉3tggtggggagaaggtcaat19〈210〉4〈211〉19〈212〉讓<213>人工序列〈400〉4tggtgggg兆3Eiggtcaag〈210〉5〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>5agtaatttgttatgggttccc21<210〉6〈211〉21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>〈400〉9ttgagtaattgasttgtgas3tg324<210〉10〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉10tgatgatttgaatgaagattgatt24<210〉11<211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列<400>11tgatsaagtg3t3aaggstt3a_3g24〈210〉12〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉12taatgttgtgaataatgtagaaag2<<210〉13<211〉24<212>靈〈213〉人工序列〈400〉13gttagttattgagaagtgtatata〈210〉14〈211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉14gtagattagtttgaagtgaataat<210>15〈211〉24<212〉DNA〈213>人工序列〈400〉15aaagttgagatttgaatgattgaa24242427〈210〉16〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉16gatta犯gttgattgasasgtg3324〈210〉17〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉17ggatggaaaacagagacttac<210〉18〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>18a鄉tcagtgatatggagtag2121〈210>19〈211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉19ccatcctctctttaagtttgc21<210〉20〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉20actatgaatttggggacttcg21〈210〉21〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉21cagagcttggcatattgtatc21<210〉22<211〉23〈212〉腿<213〉人工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>權利要求1.一種CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.9～SEQIDNO.16中的序列；(2).針對每種型別的突變分別設計的野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由3’端的針對目的基因突變位點的特異性序列和5’端的tag序列組成，所述tag序列能相應地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述野生型及突變型特異性序列分別選自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和/或SEQIDNO.7及SEQIDNO.8；(3).用于擴增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點的目標序列的引物。2.根據權利要求1所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).包被有特異的anti-tag序列的8種微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti-tag序列分別為SEQIDNO.9SEQIDNO.16中的序列；(2).針對每種型別突變設計的4對野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由5'端的tag序列和3，端的針對目的基因突變位點的特異性序列組成，所述tag序列能分別相應地與(l)中所述微球上anti-tag序列互補配對；所述野生型及突變型特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO,6、和SEQIDNO.7及SEQIDNO.8;(3).用于擴增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點的目標序列的引物。3.根據權利要求2所述的所述CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述4對由tag序列和特異性序列組成的特異ASPE引物為SEQIDNO.9的互補序列和SEQIDNO.l組成的引物、及SEQIDNO.IO的互補序列和SEQIDNO.2組成的引物;SEQIDNO.ll的互補序列和SEQIDNO.3組成的引物、及SEQIDNO.12的互補序列和SEQIDNO.4組成的引物；SEQIDNO.13的互補序列和SEQIDNO.5組成的引物、及SEQIDNO.14的互補序列和SEQIDNO.6組成的引物；和SEQIDNO.15的互補序列和SEQIDNO.7組成的引物、及SEQIDNO.16的互補序列和SEQIDN0.8組成的引物。4.根據權利要求1所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是'(3)中所述引物包括有針對CYP2C9Exon3突變的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、針對CYP2C9Exon7突變的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、針對CYP2C19E麗5突變的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和/或針對CYP2C19Exon4突變的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24。5.根據權利要求1一4項所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5—30個T。6.—種CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測的方法，其特征是，使用權利要求l所述的液相芯片進行檢測，主要包括以下步驟(一)PCR擴增待測DNA樣品，得需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點的PCR反應產物；(二)PCR反應產物用ExoSAP-IT酶進行酶切處理；(三)酶切處理后的產物用所述ASPE引物進行引物延伸反應，在反應過程中摻入生物素標記的dCTP，從而使反應后的產物帶上多個的生物素標記；(四)將對應ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應后的產物進行雜交反應；(五)雜交反應后的產物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進行反應；(六)通過熒光檢測儀檢測。7.根據權利要求6所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測的方法，其特征是，所述引物包括有針對CYP2C9Exon3突變的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、針對CYP2C9Exon7突變的SEQIDNO.19及SEQ丄DNO.20、針對CYP2C19Exon5突變的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和/或針對CYP2C19E扁4突變的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24。8.根據權利要求6所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變液相芯片及其檢測方法'其特征是步驟(五)中雜交的溫度為35—38'C。全文摘要本發明公開了CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片及其檢測方法，該液相芯片包括有分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列選自SEQIDNO.9～SEQIDNO.16中的序列；野生型和突變型ASPE引物，所述野生型及突變型特異性序列分別選自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和/或SEQIDNO.7及SEQIDNO.8；引物。所述液相芯片檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。文檔編號C12Q1/68GK101487052SQ200910037358公開日2009年7月22日申請日期2009年2月24日優先權日2009年2月24日發明者何嘉英,許嘉森,郭元杰申請人:廣州益善生物技術有限公司