檢測多種Bt蛋白的液相芯片及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白檢測領域，具體地說，涉及檢測多種Bt蛋白的液相芯片及檢測方法。
【背景技術】
[0002]隨著轉基因技術的日漸成熟，轉基因作物產業化已呈現出較好的勢頭。轉基因作物在給人類帶來巨大經濟效益和社會效益的同時，也存在潛在的環境和食品安全風險。出于對轉基因作物安全性考慮，中國、歐盟、日本、韓國等國家和組織紛紛制定相應的法律和法規要求對轉基因作物和加工食品進行標識，以對人、動物的健康和生態環境多樣性進行保護。由于轉基因作物及其產品對人類健康和生態環境可能存在潛在的不利影響，在轉基因作物及其產品是否有害沒有定論之前，轉基因作物及其產品的檢測是非常重要的。因此，加大對轉基因作物及其產品的檢測監管非常必要，這就需要建立一套簡便、快速、準確的檢驗技術，以滿足日常檢測的要求。
[0003]目前關于轉基因作物的檢測方法分為三類:基于蛋白質的檢測方法；基于核酸的檢測方法；其他檢測方法。基于蛋白質的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法(ELISA)、試紙條檢測、Western雜交等方法，主要從待測樣品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基質，利用抗體與目的蛋白(抗原)特異結合的特性，通過偶聯抗體與抗原抗體復合物的作用產生可檢測的信號。這些檢測方法已經在日常檢測工作中廣泛應用，取得了良好的效果。
[0004]轉基因產品的檢測要求快速、準確、靈敏、適應樣品量大、目標基因種類繁多等特點。雖然國內外對轉基因作物檢測方法研究已有十幾年，但由于轉基因作物的種類多、數量大，一些轉基因產品經過深加工、各種條件處理與保存后，轉基因成分/部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要根據科學技術的發展不斷更新檢測方法。
[0005]生物芯片根據其反應體系狀態的不同，可分為固相芯片(flatmicroarrays)和液相芯片(liquid chip or microsphere arrays),根據檢測對象的不同又可分為基因芯片和蛋白芯片。傳統的固相生物芯片存在操作繁瑣、信息質量的穩定性和可重復性差的致命弱點，極大地限制了生物芯片的臨床應用。液相芯片，也稱為微球體懸浮芯片(suspens1narray, liquid chip),是20世紀90年代中期發展起來的被喻為后基因組時代的芯片技術，也可稱為靈活的多種被分析物質的檢測(flexible mult1-analyte profiling, xMAP)技術，是集流式技術、熒光微球、激光、數字信號處理和傳統化學技術為一體的一種新型生物分子高通量檢測技術，這種技術將流式檢測與芯片技術有機地結合在一起，使生物芯片反應體系由液相-固相反應改變為接近生物系統內部環境的完全液相反應體系，因此也被稱為液相芯片技術。
[0006]液相芯片技術是在不同熒光編碼的微球上進行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結合反應及核酸雜交反應，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應孔內可以完成多達100種不同的生物學反應。它不但具有普通生物芯片高通量的特性，又有優于固相芯片的操作簡便、經濟實惠、重復性好、靈敏度高、信噪比好、靈活性大的特點，這使它在科研和臨床中有著廣泛的應用。可用作蛋白質和核酸等生物分子的高通量檢測，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術平臺。液相芯片技術具有高效性:因為上百種顏色的微球可以放在同一個反應體系內，所以一小份標本(血，或其它體液，組織)可以被用來同時檢測上百個生理或病理指標。液相芯片技術具有高敏感性:每個微球上都可以滿滿地包被上抗原、抗體或核酸。因為探針密度高，產生的信號強，加上使用熒光檢測，所以敏感性大大高于任何現有分析、診斷方法，也高于其它芯片法。迄今為止十年時間，全球已有數百套基于xMAP技術的檢測平臺用于免疫學、蛋白質、核酸檢測、基因研究等領域，該技術已成為一種新的蛋白質組學和基因組學研究工具，也是最早通過美國食品與藥物管理局(FDA)認證的可用于臨床診斷的生物芯片技術。近年來，液相芯片以其獨特的優點及臨床實用性，正受到越來越多的重視。不同微球可以通過熒光波譜相互區別，類似于微陣列蛋白質芯片的方法，可以實現多種指標同時檢測，給作物不同轉基因成分的檢測提供了新的檢測途徑。
[0007]中國專利申請號為201110119969.7的專利申請公開了一種檢測BtcrylAc蛋白的液相芯片及其應用，其是根據雙抗體夾心法的原理，建立的檢測Bt cryIAc蛋白的液相芯片方法，但該發明只能檢測一種蛋白，即Bt cryIAc蛋白。若根據雙抗體夾心法建立多種Bt蛋白的液相芯片方法，針對某一個蛋白，須制備或購買不同抗原表位的兩個單抗，難度較大。而選用競爭法建立液相芯片方法，每個蛋白只需要I個單抗即可。
[0008]中國專利公開號為CN101526535A的發明專利公開了一種多種腫瘤標志物聯合檢測液相芯片，其檢測原理是雙抗夾心免疫反應，需要有兩個抗體(包括捕獲抗體和檢測抗體)，這兩個抗體是對應的，必須是針對同一抗原的。

【發明內容】

[0009]為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種檢測多種Bt蛋白的液相芯片及檢測方法。
[0010]為了實現本發明目的，本發明首先提供一種檢測多種Bt蛋白的液相芯片，主要包括下列成分:
[0011]I)偶聯抗原的微球；
[0012]所述抗原為Bt CrylAa> Bt CryIAb> Bt CryIAc> Bt CryIAh> Bt CrylB> Bt CrylC> BtCry IF、Bt Cry2A> Bt Cry3B 和 Bt Cry9C 蛋白；
[0013]2)生物素化的檢測抗體；
[0014]所述檢測抗體為上述10種蛋白的單克隆抗體；
[0015]3)鏈親和素藻紅蛋白。
[0016]作為優選，抗原蛋白與微球的偶聯濃度為5 μ g/100 μ L0
[0017]進一步地，所述偶聯抗原的微球的制備方法為:
[0018]將Bt蛋白加到活化的微球中，用100 μ L PBS,pH7.4定溶到500 μ L，用鋁箔蓋住反應管，4°C過夜，14000 Xg離心4分鐘，移除上清液；用500 μ I PBS, pH7.4清洗偶聯的微球，14000 X g離心4分鐘，移除上清液；用250 μ L封閉緩沖液重懸微球，漩渦混合15秒，用鋁箔蓋住反應管，在室溫中旋轉混合30分鐘，14000Xg離心4分鐘，移除上清液；用500μ?儲存緩沖液清洗微球，16000 X g離心6分鐘，去除上清，加入150 μ L儲存緩沖液保存微球，可用血球計數器計算微球的濃度，蓋上鋁箔，4°C保存偶聯的微球。
[0019]本發明還提供了利用前述液相芯片檢測多種Bt蛋白的方法，其是將50 μ L生物素化的檢測抗體(0.2mg/L)加入96孔板中，將50 μ L偶聯抗原的微球和50 μ L待檢物同時加入各孔共同孵育，再分別加入50 μ L鏈親和素藻紅蛋白(50 μ g/mL)，通過B1-Plex液相芯片系統檢測得到的熒光信號，通過判斷熒光信號強弱來判斷待檢樣品的陰、陽性。
[0020]作為優選，生物素化的檢測抗體加入量為10 μ go
[0021]作為優選，所述孵育時間為60min。
[0022]本發明的有益效果在于:
[0023]本發明建立了同時檢測多種Bt蛋白的液相蛋白芯片檢測方法，可同時檢測包括Bt CrylAa、Bt CryIAbΛ Bt CryIAcΛ Bt CryIAhΛ Bt CrylB、Bt CrylC、Bt CrylF、Bt Cry2A、BtCry3B和Bt Cry9C在內的Bt蛋白。本發明建立的液相蛋白芯片方法檢測轉基因作物中的Bt蛋白的最低檢出極限在10-50ng/mL之間，批內和批間變異系數(CV)〈10%。與EPSPS蛋白、植酸酶蛋白和耐鹽IrrE蛋白其他常見轉基因目標蛋白無交叉反應。結果表明，該方法的敏感性高、特異性強、重復性好。經過保存期試驗表明，組裝的試劑盒至少經過6個月后，性狀仍然穩定，檢測效果也沒有降低。
【附圖說明】
[0024]圖1為偶聯抗原濃度和MFI的關系圖。
[0025]圖2為生物素化檢測抗體加入量和MFI的關系圖。
[0026]圖3為孵育時間和MFI的關系圖。
[0027]圖4為Bt蛋白標準曲線。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0029]實施例1液相蛋白芯片檢測方法的建立及優化
[0030]1.試劑和耗材
[0031]S_NHS，EDC 均購自 Pierce 公司，美國；
[0032]Bt 蛋白標準品(包括 Bt CryIAa> Bt CryIAb> Bt CryIAc> Bt CryIAh> Bt CryIB> BtCrylC、Bt CrylF、Bt Cry2A、Bt Cry3B和Bt Cry9C)和單克隆抗體(上海佑隆生物技術有限公司，進口)；
[0033]B1-Plex ?蛋白氨基偶聯試劑盒和空白羧基熒光微球，B1-Bad公司，美國；
[0034]抗體的生物素化試劑盒購自Pierce公司，美國。
[0035]透析袋:5mm，Mff:8000-14000，北京鼎國生物科技有限公司。
[0036]2.主要儀器
[0037]B1-Plex ?200 懸浮芯片系統(Luminex 公司)，B1-Bad 公司，美國；
[0038]制冷恒溫落地搖床，Eppendorf,德國；
[0039]渦旋混合器，北京昊諾斯科技有限公司。
[0040]3.方法
[0041]3.1抗原偶聯于磁珠
[0042]3.1.1磁珠的活化
[0043]選擇10種羧基化磁性熒光微球(B1-Rad) (1.25 X 17個/mL)，漩渦混合30秒，超聲波震蕩30秒，取100 μ L微球到反應管中(采用進口的1.5mL eppendorf管)，14000Xg離心4分鐘，小心移除上清液，加入100 μ L微球清洗液，漩渦混合10秒，超聲波震蕩10秒，14000 X g離心4分鐘，小心移除上清液，加入80 μ L微球活化緩沖液重懸微球，漩渦混合30秒，超聲波震蕩30秒，準備EDC(50mg/mL)(購自Pierce公司)和S-NHS (50mg/mL)(購自Pierce公司)，在這要注意:EDC必須確保新鮮，反復凍融不得超過5次，最好分裝后一次性使用。加入10 μ LEDC后迅速加入1yL S-NHS到微球中，漩渦混合30秒，用鋁箔蓋住反應管，在室溫中旋轉混合20min，加150 μ L P