一種檢測mpl基因突變的引物與方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，尤其設及一種檢測MI^L基因突變的引物與方法。
【背景技術】
[0002] 骨髓增值性腫瘤（MPN)是由造血前體細胞生長激活基因改變導致的多細胞系過度 增殖而引起的，包括真性紅細胞增多癥（PV)、原發性血小板增多癥（ET)和原發性骨髓纖維 化（PMF)。骨髓增值性腫瘤若不及時治療，最終可能發展呈急性粒細胞性白血病。MI^L基因 編碼人血小板生成素受體（TPOR)，促進細胞的生長、增殖及分化。人血小板生成素受體參與 調控巨核細胞的增殖與血小板的生成，對造血干細胞的維護起著重要的作用。MI^L基因跨膜 區域的體細胞突變首先由Pikman等在JAK2V617F突變陰性的PMF患者中發現，被認為與 JAK2V617F突變陰性的MPN患者中JAK-STAT信號轉導通路發生持續性激活有關。
[0003] 現有研究表明，MI^L基因突變主要發生在外顯子10第515位密碼子上（W5巧L, W515K，W515R和W515A)，約 8. 5% 的JAK2V617F突變陰性的ET和約 15% 的JAK2V617F突 變陰性的PMF患者可檢測到MPL基因突變，但在PV患者中未發現MPL基因突變。MPLW515 突變是JAK2V617F陰性的MPN患者的致病因素之一。
[0004] 中國專利申請201210374903. 7公開了一種檢測MPL基因W515位點突變的試劑 盒，該試劑盒包括位點突變特異性引物、內參基因ABL引物和巧光探針等，用于MI^L基因 W515位點突變的檢測存在存在反應體系復雜，需要多種引物和巧光定量PCR儀的缺點。

【發明內容】

[0005] 為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種檢測M化基因突變的引物與方 法，該引物具有特異性好、靈敏度高等優點，實現了檢測MI^L基因外顯子10突變的準確檢 測。
[0006] 本發明提供一種檢測M化基因突變的引物，包括針對M化基因外顯子10的上游引 物TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC(沈QIDNO. 1)和下游引物CAGGAAACAGCTATG ACCGATCTGGGGTCACAGAGCGA(沈QIDNO. 2)。
[0007] 優選地，所述引物中，外顯子10的上游引物和外顯子10的下游引物濃度比為1: Io
[0008] 相應地，本發明還提供一種檢測M化基因突變的方法，包括如下步驟:A)提取DNA 樣品；B)采用權利要求1或2中所述的引物進行PCR擴增；C)對擴增產物進行凝膠電泳分 析后，采用Sanger測序法檢測，對檢測結果進行分析。
[0009] 優選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。
[0010] 優選地，所述步驟B)中的PCR擴增反應條件包括：階段1 :98°CSmin;階段2 :98°C 1〇3;階段3:631：3〇3;階段4:72°(：1111111;階段5:返回到階段2,34個循環；階段6:721： Smin;階段7 :25 °C保溫。
[0011] 優選地，所述步驟C)中，采用Sequencher4. 1. 4軟件對檢測結果進行分析。
[001引此外，本發明還提供檢測M化基因突變的引物在制備檢測M化基因突變試劑中的 用途。
[0013] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明提供了一種檢測MI^L基因外顯子 10突變的引物，該引物的特異性好，準確性好，提高了檢測效率。此外，本發明還提供了一種 檢測MI^L基因外顯子10突變的方法，通過使用特異性的引物，具有特異性好、靈敏度高、準 確性好等優點，可作為JAK2V617F陰性的ET和PMF患者的輔助檢測方法，進而為其臨床用 藥提供指導。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發明提供的MPL基因外顯子10引物的擴增片段。 陽01引圖2PCR擴增產物的凝膠電泳圖。
[0016]圖3 MPL基因外顯子10野生型的部分測序圖。 陽017] 圖4 MPL基因外顯子10突變型的部分測序圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0019] 實施例一引物 發明人針對MI^L基因外顯子10,設計了大量引物，通過引物反應條件的優化和比較，篩 選出了特異性好的引物。
[0020]
實施例二引物的特異性 將本發明提供的引物于UCSC中進行Blasting,MI^L基因外顯子10引物擴增片段位于C虹1: 43間，長度為329bp。無其它同源基因，結果如圖1所示，與MPL 基因參考序列相符。
[OOW使用表1中的引物、表2中的PCR擴增體系和表3的PCR擴增條件對檢測樣品進 行擴增，對擴增產物進行凝膠電泳分析，結果如圖2所示。結果顯示，擴增產物的特異性高， 無非特異性擴增條帶產生。 陽02引實施例SM化基因外顯子10突變的檢測 提取邸TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANampBloodDNAKit(購自Tiagen,貨號：DP318)的說明書，將DNA樣品稀釋至l(K)ng/iiL備用。 陽02引 PCR擴增采用Q5?熱啟動超保真2X Master Mix(購自肥B公司，貨號：M049化）， PCR擴增體系如表2所示，PCR擴增條件如表3所示。外顯子10的上游引物和外顯子10的 下游引物濃度比為1 :1，外顯子10的上游引物濃度和外顯子10的下游引物濃度都為IOp/ mol O
[0024]
對PCR擴增產物進行凝膠電泳分析，結果如圖2所示。結果顯示，擴增產物的特異性高， 無非特異性擴增條帶產生。采用Bi曲ye? Terminator v3.1(購自Life司，貨號4336919) 對檢測樣品的PCR擴增產物進行Sanger測序，Sanger測序的操作步驟如下： A)DNA測序模板處理，加入ExoSAP-口酶，在ABI9700PCR儀中，按W下程序進行處理： 37 °C，15min;80 °C，15min;4°C，infinite。
[00巧]B)參考Bi曲ye?Terminatorv3.I切cleSequencingKit操作說明制備測序PCR體系。
[0026] C)在ABI9700PCR儀中，按W下程序進行處理： 96°C，1min-（96°C，10S- 50°C，5S- 60°C，4min)，25 個循環一 4°C保溫。
[0027] D)用酒精/EDTA/NaAc法對測序PCR的產物進行純化。
[0028] 巧室溫揮發凈酒精，加入IOyL化-Di化rmamide溶解DNA，溶解后的樣品需要在 95°C變性4 min,迅速置冰中冷卻4 min后，上樣電泳。
[0029] 測序結果(僅顯示部分）如圖3至圖4所示，擴增產物的序列與參考序列相符。
[0030] 實施例四檢測M化基因外顯子10突變的方法的準確性 本檢測準確性定義為不同引物檢測結果的一致性。
[0031] 本檢測方法使用表1中的檢測引物對22例血液樣品DNA進行檢測，此外，使用表 4中的驗證引物對22例血液樣品DNA進行檢測，結果如表5所示。22例樣品經兩套不同引 物檢測，檢測結果一致，表明本檢測方法的準確性為100%。
[0032]
注：NMD即未檢測到突變。
[003引實施例五檢測M化基因外顯子10突變的方法的特異性和靈敏度 本檢測的檢測特異性定義為陰性符合率，檢測靈敏度定義為陽性符合率。
[0034] 本檢測方法使用表1中的檢測引物對22例血液樣品DNA進行檢測，此外，使用表 4中的驗證引物對22例血液樣品DNA進行檢測，結果如表5所示。檢測引物和驗證引物檢 測結果為陰性（未檢測到突變）的樣品完全一致，本檢測方法的檢測特異性為100%。
[0035] 檢測引物和驗證引物檢測結果為陽性（檢測到突變）的樣品完全一致，突變位點 及類型也完全一致，結果如表6所示，本檢測方法的檢測靈敏度為100%。
[0036]
實施例六檢測MI^L基因外顯子10突變的方法的檢測下限 本檢測方法采用Sanger測序法進行檢測，本檢測方法的最低檢測下限化OD)為20%，當 突變細胞與正常細胞的比值低于40%時，不排除假陰性的可能。
[0037] DNA輸入量的檢測結果如表8所示，在DNA量輸入范圍12. 5~200ng/reaction間， 可保證突變樣品檢測結果一致。
[003引實施例屯檢測M化基因外顯子10突變的方法的精密度 本檢測方法的精密度定義為對樣品進行重復檢測得到同一結果的能力。
[0039] 本檢測方法對7例樣品進行了MI^L基因外顯子10的S次重復檢測。同一樣品不 同批次的擴增均成功，Sanger測序結果如表7所示。結果顯示，同一樣品不同批次的檢測 結果一致，本檢測方法批間精密度為100%。
[0040]
注：NMD即未檢測到突變。 陽0川本檢測方法對1例陽性樣品和1例陰性樣品進行了M化基因外顯子10的3復孔 檢測。同一樣品不同孔間的擴增均成功，Sanger測序結果如表8所示。結果顯示，同一樣 品不同孔間的檢測結果一致，本檢測方法的批內精密度為100%。
[0042]
注：NMD即未檢測到突變。
[0043]因此，本發明所提供的引物和檢測方法可作為一種獨立的、應用廣泛的檢測方法， 解決了MPL基因外顯子10突變的檢測問題，可作為JAK2V617F陰性的ET和PMF患者的輔 助檢測方法，進而為其臨床用藥提供指導，減少不良反應，在幫助指導用藥和個性化治療方 面具有重要意義。
[0044] W上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于運些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的 保護范圍。
【主權項】
1. 一種檢測MPL基因突變的引物，其特征在于：包括針對MPL基因外顯子10的上游引 物 TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC 和下游引物 CAGGAAACAGCTATGACCGATCTGGGGTC ACAGAGCGAo2. 根據權利要求1所述的檢測MPL基因突變的引物，其特征在于：所述引物中，外顯子 10的上游引物和外顯子10的下游引物濃度比為1 :1。3. -種檢測MPL基因突變的方法，其特征在于：包括如下步驟：A)提取DNA樣品；B)采 用權利要求1或2中所述的引物進行PCR擴增；C)對擴增產物進行凝膠電泳分析后，采用 Sanger測序法檢測，對檢測結果進行分析。4. 根據權利要求3所述的檢測MPL基因突變的方法，其特征在于：所述步驟A)中的DNA 樣品為EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。5. 根據權利要求3所述的檢測MPL基因突變的方法，其特征在于：所述步驟B)中的PCR 擴增反應條件包括：階段I :98°C 3min ;階段2 :98°C IOs ;階段3 :63°C 30s ;階段4 :72°C 11^11;階段5:返回到階段2,34個循環；階段6:72 1€51^11;階段7:25°(：保溫。6. 根據權利要求3所述的檢測MPL基因突變的方法，其特征在于：所述步驟C)中，采 用Sequencher 4. 1. 4軟件對檢測結果進行分析。7. 根據權利要求1或2所述的檢測MPL基因突變的引物在制備檢測MPL基因突變試劑 中的用途。
【專利摘要】本發明提供一種檢測MPL基因突變的引物，包括針對MPL基因外顯子10的上游引物和下游引物。本發明屬于生物檢測技術領域，本發明提供的引物可以實現MPL基因外顯子10突變的特異性檢測，引物的特異性好，準確性好，提高了檢測效率。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105154545
【申請號】CN201510568599
【發明人】燕啟江, 趙薇薇, 于世輝, 梁耀銘, 胡昌明
【申請人】廣州金域醫學檢驗中心有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月9日