專利名稱：一種診斷肝癌的標記物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤學和診斷領域。更具體地，本發明涉及一種診斷肝癌的標記物及其用途。
背景技術：
細胞色素p450 家族 17 亞家族 A 多妝 I (cytochrome P450, family 17, subfamily八，？017 印^(161，簡稱為“0￥ 1741”)。該蛋白亦稱為17&1 1^羥化酶/17，20碳鏈裂解酶，屬于細胞色素P450酶系(細胞色素P450cl7 a酶)，由508個氨基酸組成。CYP17A1蛋白主要定位在內質網上，具有類固醇17alpha單加氧酶，17alpha羥化酶及17，20裂解酶活性。它是類固醇類激素合成通路中的一個關鍵酶。參與包括黃體酮、鹽皮質激素、糖(腎上腺)皮質激素、雄激素、雌激素等物質的生成。CYP17A1基因的突變伴隨著非依賴型類固醇17alpha羥化酶缺陷、17alpha羥化酶及17、20裂解酶雙缺陷、假兩性畸形、腎上腺增生等。該基因敲除的小鼠模型具有胚胎致死性(Bair SR;Mellon SH,Deletion of the mouse P450cl7 gene causes early embryonic lethality. ， Mol CellBiol 2004)。其在性激素合成通路中的作用主要是將孕烯醇酮和黃體酮轉化成17-0H羥基化的形式，進而分別生成脫氫表雄酮(DHEA)和雄烯二酮，最后分別生成雌、雄激素(Chunget al. , 1987 ；Kagimoto et al. , 1988 ；Van Den Akker et al. ,2002)。目前關于CYP17A1的研究主要集中在腎上腺及生殖腺中的酶催化活性及其在膽固醇和類固醇合成代謝中的功能。未見CYP17A1與肝癌相關的報道。肝癌是我國常見的一種惡性腫瘤，位居腫瘤發生率的第三位，死亡率的第二位。原發性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見肝癌類型。中國的肝癌患者占全世界發病率的54%，男性較女性更易發病。目前肝癌患者的5年生存率不到5%。全世界每年大約有549000名患者死于此，且其發病率有逐年上升的趨勢(來自WHO死亡率數據庫)。因此，加大對肝癌的防治力度對降低死亡率具有重要意 義。目前肝癌的診斷主要依靠影像學檢查、肝穿刺組織學檢查以及實驗室檢查。影像學診斷在肝癌診斷中起重要的作用，但是在診斷小肝癌及區分良惡性結節中均具有一定的局限性。肝硬化基礎上肝內再生結節和發育不良的結節等良性病變較為常見，與肝癌的影像學特征有一定的重疊，放射學檢查對肝內小的良惡性病變鑒別仍很困難。與肝臟病理對t匕，CT診斷肝癌的敏感度較低。有創的組織病理學檢查是診斷肝癌的主要方法，即使是很好的細針穿刺仍因取材有限而有較高的假陰性率，并且有使腫瘤擴散和針道種植的危險。因此，臨床仍需要高度敏感的血清肝癌特異標志物來鑒別肝臟良惡性病變，或在高危人群進行隨訪提高肝癌的早期診斷率。肝癌的早期診斷是提高患者生存率的一項最重要因素。目前在臨床使用的肝癌血清診斷標記物主要是甲胎蛋白(Alpha fetoprotein, AFP),但其敏感性只有40% 65%,特異性76% 96%。雖然甲胎蛋白在肝癌的診斷中起了積極的作用，但其敏感性和特異性還不令人滿意，而且在新發病例中AFP陰性比例在不斷增加。因此，尋找新的具有診斷或聯合診斷價值的肝癌血清標志物是當務之急，也是HCC早發現早治療的關鍵。因此，提供在肝癌組織和血清中特異高表達的基因或蛋白質具有重要的診斷和治療意義，本領域迫切需要開發可用于檢測或判斷肝癌的血清特異標志物。

發明內容
本發明的目的就是提供一種可用于檢測或判斷肝癌的血清特異標志物及其用途。在本發明第一方面，提供了一種細胞色素P450家族17亞家族A多肽1(CYP17A1蛋白)的基因、mRNA、cDNA、或蛋白的用途，它被用作檢測肝癌的標志物；或用于制備檢測肝癌的試劑或試劑盒。更佳地，所述的檢測是血清檢測。
在另一優選例中，所述的試劑包括抗體、引物、探針、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白質芯片。在本發明第二方面，提供了細胞色素p450家族17亞家族A多肽1(CYP17A1蛋白)或其特異性抗體的用途，用于制備檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。更佳地，所述的檢測是血清檢測。在本發明第三方面，提供了一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒包含(a)抗細胞色素p450家族17亞家族A多肽I (CYP17A1蛋白)的抗體；和/或(b)特異性擴增CYP17A1 mRNA或CYP17A1 cDNA的引物或引物對。在另一優選例中，所述的試劑盒還包括標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測或診斷肝癌。在另一優選例中，所述的抗CYP17A1蛋白的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。在本發明第四方面，提供了一種檢測肝癌的方法，該方法包括a)準備受試者測試樣品；b)檢測測試樣品中細胞色素p450家族17亞家族A多肽I基因(CYP17A1)的表達量，并將表達量檢測結果與參比值進行比較，其中CYP17A1的表達量高于參比值表明受試者患有肝癌，或患肝癌的幾率高于正常人群。在另一優選例中，所述測試樣品為組織樣品、血液樣品、血清樣品或體液樣品。在另一優選例中，所述參比值為非肝癌樣品中CYP17A1的表達量。在另一優選例中，所述檢測步驟b包括檢測CYP17AlmRNA的量，或CYP17AlcDNA的量；和/或檢測CYP17A1蛋白的量。在另一優選例中，所述檢測步驟b包括通過RT-PCR或PCR方法進行檢測。在另一優選例中，所述的檢測步驟b包括使用抗CYP17A1蛋白的抗體進行檢測。在另一優選例中，檢測步驟b通過酶聯免疫反應法(ELISA法)或時間分辨免疫熒光法(TRFIA法)實現。在另一優選例中，所述抗CYP17A1蛋白的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體(如抗
血清)。在另一優選例中，其特征在于，所述方法還包括評估測試樣品中其他肝癌標記物的表達。
在另一優選例中，所述的其他肝癌標記物包括甲胎蛋白AFP、甲胎蛋白異質體AFP-L3、血清巖藻糖苷酶AFU、硫酸肝素蛋白多糖3GPC3、異常凝血酶原DCP、谷氨酰胺轉移酶酶II (GGT II)或組合。在另一優選例中，所述方法還包括評估測試樣品中甲胎蛋白(AFP)的表達。在本發明的第五方面，提供了一種細胞色素p450家族17亞家族A多肽I (CYP17A1蛋白)或其特異性抗體的用途，它們被用于制備血清檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。
在另一優選例中，所述的CYP17A1蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。在另一優選例中，所述可檢測標記選自下組生色團、化學發光基團、熒光團、同位素或酶。在另一優選例中，所述診斷試劑是單克隆抗體。在另一優選例中，所述的試劑是蛋白質芯片。在另一優選例中，所述的核酸芯片包括基片和點樣在基片上的癌癥相關基因的特異性寡核苷酸探針，所述的癌癥相關基因的特異性寡核苷酸探針包括與CYP17A1多核苷酸(mRNA或DNA)特異性結合的探針。在另一優選例中，所述的蛋白質芯片包括基片和點樣在基片上的癌癥相關蛋白的特異性抗體，所述的癌癥相關蛋白的特異性抗體包括抗CYP17A1的特異性抗體。在另一優選例中，所述的特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。在另一優選例中，所述的血清檢測是ELISA法、或雙抗夾心時間分辨免疫熒光法(TRFIA 法)。在本發明的第六方面，提供了一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有CYP17A1蛋白或其特異性抗體；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于血清檢測或血清診斷肝癌。在另一優選例中，所述的標簽或說明書中注明以下內容如果檢測對象的血清CYP17A1濃度彡70ng/ml (較佳地彡80ng/ml，更佳地彡90ng/ml，最佳地彡100ng/ml)，則該對象發生肝癌的幾率大于正常人群。在另一優選例中，所述的CYP17A1蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。在另一優選例中，所述肝癌包括肝細胞肝癌，尤其是原發性肝細胞肝癌。在另一優選例中，所述的CYP17A1蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。在另一優選例中，所述可檢測標記選自下組生色團、化學發光基團、熒光團、同位素或酶。在另一優選例中，所述的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。在本發明的第七方面，提供了一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有特異性擴增CYP17A1 mRNA或cDNA的特異性引物；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于通過定量檢測CYP17A1的表達量來判斷患肝
癌的幾率。在另一優選例中，所述的標簽或說明書中注明以下內容
如果檢測對象的CYP17A1 mRNA的量與一般人群中CYP17A1 mRNA的量之比彡I. 5 (較佳地彡2. 0，更佳地彡2. 5)，則該對象發生肝癌的幾率大于正常人群。在本發明的第八方面，提供了一種細胞色素p450家族17亞家族A多肽I (CYP17A1蛋白)的用途，它被用作血清檢測肝癌的標志物。在本發明的第九方面，提供了一種細胞色素p450家族17亞家族A多肽I (CYP17A1蛋白)的拮抗劑的用途，它被用于制備抑制肝癌細胞生長的藥物。在另一優選例中，所述的拮抗劑包括 針對CYP17A1的siRNA、反義RNA、抗體、或其組合。在本發明的第十方面，提供了一種體外檢測肝組織中CYP17AlmRNA的表達是否異常的方法，包括以下步驟A、用特異性CYP17A1的引物，作定量PCR檢測，測定待測肝組織中CYP17AlmRNA的
數值；B、將步驟A測得的CYP17A1的數值與正常肝組織中的CYP17A1的數值進行比較，如測得的數值高于正常值，則表示被檢測肝組織中CYP17A1的表達異常。在本發明第十一方面，提供了一種體外檢測肝組織中CYP17A1蛋白的表達是否異常的方法，包括以下步驟A、用特異性抗CYP17A1的抗體檢測待測肝組織中CYP17A1蛋白的數量；B、將步驟A測得的CYP17A1的數量與正常肝組織中的CYP17A1的數量進行比較，如測得的蛋白數量高于正常值，則表示被檢測肝組織中CYP17A1的表達異常。在本發明的第十二方面，提供了一種體外檢測血清中CYP17A1蛋白的含量是否異常的方法，包括以下步驟A、用特異性抗CYP17A1的抗體檢測待測血請中CYP17A1蛋白的量；B、將步驟A測得的CYP17A1蛋白的量與正常人血清中的CYP17A1的量進行比較，如測得的蛋白量高于正常值，則表示被檢測血清中CYP17A1的含量異常。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。


圖I. CYP17AImRNA在33對肝癌及癌旁組織樣本中的差異表達結果，圖中T代表肝癌組織，N代表癌旁組織。圖2.免疫印跡(Western blot)法檢測CYP17A1蛋白在肝癌及癌旁組織樣本中的表達。圖中T代表肝癌組織，N代表癌旁組織。P-actin表示￠-肌動蛋白，被用作內參。圖3.免疫組化分析CYP17A1蛋白在肝癌患者的肝癌及相應的癌旁組織樣本中的表達，圖中所示為其中的I對組化樣品代表性圖片，放大倍數，200倍；標尺，IOOum0圖4.組織芯片檢測CYP17A1蛋白在肝癌患者的肝癌及對應的癌旁組織樣本中的差異表達。A，CYP17A1蛋白在組織芯片中的免疫組化染色。左圖為一對肝癌及癌旁代表性芯片點。右圖是這對芯片點的局部放大圖，放大倍數，200倍；圖中標尺，lOOiim。B為CYP17A1蛋白在87對肝癌及癌旁樣品中表達的差異比較。圖中T代表肝癌組織，N代表癌旁組織。
圖5. CYP17A1蛋白在正常人血清及肝癌病人血清中的含量以及作為肝癌血清學標志物的診斷價值分析。A.酶聯免疫反應(ELISA)測定CYP17A1蛋白在正常人血清及肝癌病人血清中的含量，正常人(Heal thy)代表正常人血清，HCC代表肝癌病人血清。B. ROC曲線分析CYP17A1作為肝癌血清學診斷標志物的價值。曲線所包圍的面積越大，判斷其價值就越高。圖6顯示了 CYP17A1在不同分化程度的HCC中的表達。圖中T表示肝癌組織樣本，N表示相對應的癌旁正常組織。圖7A顯示了測定CYP17A1血液含量的酶聯免疫吸附實驗(ELISA)原理。羊抗人的CYP17A1多抗為捕獲抗體(Capture antibody)，兔抗人的CYP17A1多抗為檢測抗體(Detection antibody)。
圖7B顯示了 ELISA測定所用標準曲線。通過將CYP17A1蛋白標準品倍比稀釋成不同濃度梯度(Opg/ml, 156. 25pg/ml, 312. 5pg/ml, 625pg/ml, 1250pg/ml, 2500pg/ml, 5000pg/ml,7500pg/ml, lOOOOpg/ml)，測定其OD值，以制作標準曲線。圖8顯示了 ELISA方法測定的CYP17A1在212例不同人群的血清樣本中的表達。圖9顯示了 CYP17A1蛋白在AFP陰性及AFP陽性肝癌患者血清樣本中的含量及分析。樣本包括AFP陰性(AFP-)樣本45例，AFP陽性(AFP+)樣本70例和健康樣本30例。圖10顯示了 ROC曲線比較分析CYP17A1與AFP應用于肝癌診斷的靈敏度和特異度。圖11顯示了 CYP17A1與AFP在肝癌血清樣本中的表達情況，表明CYP17A1在肝癌病人血清中的高表達比率大于AFP。圖中，以CYPl7AI濃度34. 5ng/ml，AFP濃度20ng/ml為臨界值。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，CYP17A1在肝癌組織高表達且在正常肝臟組織中低表達，因此可用作肝癌標志物。此外，肝癌細胞中還產生分泌性CYP17A1進入血液，因此血清中CYP17A1濃度與檢測對象患肝癌的幾率呈正相關。因此，血清CYP17A1可以作為檢測肝癌的標志物。在此基礎上完成了本發明。具體地，本發明人通過高通量的基因表達譜芯片篩選技術，發現CYP17A1基因在肝癌中高表。然后對33對臨床肝癌及癌旁組織樣本中CYP17AlmRNA的表達量進行檢測，采用定量RT-PCR實驗檢測結果表明，CYP17AlmRNA在肝癌中表達較癌旁高2倍以上的有23對，其高表達的比例約為70% (23/33)[圖1，實施例I]。本發明人進一步用免疫印跡實驗(Western blotting)檢測了 60對肝癌及癌旁組織樣本中CYP17A1蛋白的表達水平，結果證明CYP17A1蛋白在44對樣品中上調表達，其比例約為73% (44/60)[圖2，實施例3]。本發明人又采用免疫組化實驗檢測了 5對肝癌和癌旁組織樣本，結果表明在5對組化樣品中，其在肝癌組織中的表達均明顯高于相應的癌旁組織[圖3，實施例4]。本發明人還對含有87對肝癌和癌旁組織樣本的組織芯片進行免疫組化實驗檢測，結果證明，CYP17A1蛋白在肝癌組織中的表達高于癌旁組織的有58對，比例約為66. 7%(58/87)[圖 4，實施例 5]。
上述結果表明，在肝癌的臨床組織樣本中，CYP17AlmRNA和CYP17A1蛋白在肝癌中
聞表達。此外，本發明人還利用酶聯免疫技術，檢測了 CYP17A1在人血清中的表達。結果顯示CYP17A1在肝癌病人血清中的表達顯著高于正常人[圖5，實施例6]。CYP17A1蛋白在正常人(n = 30例)血清中的平均含量為25. 5ng/ml，在肝癌病人(n = 115例)血清中的平均含量為115ng/ml。統計分析表明，CYP17A1蛋白在肝癌病人血清中的高表達具有顯著差異(P < 0. 001)。根據CYP17A1在正常人血清中含量的95%置信區間，以CYP17A1濃度34. 5ng/ml為臨界值(Cut-off Point)時，其檢測靈敏度和特異度分別可以達到為86. I %和70%。ROC曲線分析，其結果如圖5B所示，圖中ROC曲線下的面積越大表明診斷價值越高，CYP17A1的ROC曲線面積為0. 889，顯著大于參考曲線面積0. 5(P < 0. 001)，表明CYP17A1作為肝癌的血清學分子標志物，具有很好的診斷價值。樣品本文中使用的術語“樣品”或“樣本”是指與受試者特異地相關聯的材料，從其中可以確定、計算或推斷出與受試者有關的特定信息。樣品可以全部或部分由來自受試者的生物材料構成。樣品也可以是以某種方式與受試者接觸過的材料，這種接觸方式使得對樣品進行的測試可以提供與受試者有關的信息。樣品也可以是已經與其它材料接觸過的材料，這種其它材料不是受試者的，但是能夠使第一材料隨后被測試以確定與受試者有關的信息，例如樣品可以是探針或解剖刀的清洗液。樣品可以為接觸受試者之外的生物材料源，只要本技術領域的專業人員仍然能夠從樣品確定與受試者有關的信息就行。表達如本文所用，術語“表達”包括mRNA從基因或基因部分的產生，并且包括由RNA或基因或基因部分所編碼的蛋白質的產生，還包括與表達相關的檢測物質的出現。例如，Cdna，結合配體(如抗體)與基因或其它寡核苷酸、蛋白質或蛋白質片段的結合以及結合配體的顯色部分都包括在術語“表達”的范圍內。因此，在免疫印跡如western印跡上半點密度的增加也處于以生物學分子為基礎的術語“表達”的范圍內。參比值 如本文所用，術語“參比值”是指當與分析結果相比時與特定結果統計學相關的值。在優選的實施方案中，參比值是根據對比較CYP17A1蛋白的表達與已知的臨床結果的研究進行的統計學分析來確定的。在本文的實施例部分中顯示了一些這樣的研究。但是，來自文獻的研究和本文公開的方法的用戶經驗也可用于生產或調整參比值。參比值也可以通過考慮與患者的醫療史、遺傳學、年齡和其它因素特別相關的情況和結果來確定。非肝癌樣品如本文所用，術語“非肝癌樣品”包括但不限于未患有肝癌的人群，肝癌患者的非肝癌組織。CYP17A1蛋白和基因在本發明中，術語“本發明蛋白”、“CYP17A1蛋白”、“CYP17A1多肽”或“細胞色素P450家族17亞家族A多肽I ”可互換使用，都指具有細胞色素p450家族17亞家族A多肽I氨基酸序列(NCBI蛋白序列號NP_000093或SEQ ID NO. 2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的CYP17A1蛋白。此外，該術語還包括全長的CYP17A1及其片段。本發明所指的CYP17A1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突變體以及其功能上活性的片段。在本發明中，術語“CYP17A1基因”、“CYP17A1多核苷酸”或“細胞色素p450家族17亞家族A多肽I基因”可互換使用，都指具有人CYP17A1核苷酸序列的核酸序列。CYP17A1基因全長7003bp (NCBI GenBank登錄號為NC_000010. 10)，其轉錄產物mRNA序列全長1895bp (NCBI GenBank登錄號為NM_000102或如SEQ ID NO. :1所示)。需理解的是，當編碼相同的氨基酸時，密碼子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產生保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換也是可被接受的。在得到了 CYP17A1的氨基酸片段的情況下，可根據其構建出編碼它的核酸序列，并且根據核苷酸序列來設計特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的CYP17A1核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知 的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的CYP17A1多肽。一般來說有以下步驟(I).用本發明的編碼人CYP17A1多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，CYP17A1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含CYP17A1編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞；動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導) 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
口 o特異性抗體在本發明中，術語“本發明抗體”和“抗CYP17A1的特異性抗體”可互換使用。本發明還包括對人CYP17A1多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人CYP17A1基因產物或片段。較佳地，指那些能與人CYP17A1基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人CYP17A1蛋白的分子，也包括那些并不影響人CYP17A1蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人CYP17A1基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No. 4，946，778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人CYP17A1基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人CYP17A1蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur. .I. Immunol. 6 :511,1976 ；Kohler 等人，Eur. .I. Immunol. 6 :292,1976 ；Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。本發明的抗體包括能阻斷人 CYP17A1蛋白功能的抗體以及不影響人CYP17A1蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人CYP17A1基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CYP17A1基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E. Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。抗人CYP17A1蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測標本(尤其是血清樣本)中的人CYP17A1蛋白。檢測方法 利用CYP17A1存在于血清中，且與肝癌密切相關這ー特點，本發明還提供了檢測或判斷肝癌的方法，尤其是血清學檢測方法。在本發明的一個優選例中，本發明提供一種檢測血清CYP17A1的ELISA法以及時間分辨免疫熒光法(TRFIA)。檢測試劑盒基于CYP17A1與肝癌的相關性，即CYP17A1在肝癌組織中高表達并且在肝癌病人血清中含量高，因此CYP17A1可以作為肝癌的ー種血清診斷標志物。本發明還提供了一種檢測肝癌的試劑盒，它含有本發明的抗CYP17A1的免疫球蛋白或免疫偶聯物，或其活性片段；或者含有特異性擴增CYP17A1的mRNA或cDNA的引物。在另ー優選例中，本發明還提供了 CYP17A1的診斷試劑盒，包括CYP17AlmRNA診斷試劑盒[實施例2]或CYP17A1酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒[實施例7]。本發明的人肝癌血清學診斷試劑盒，已完成實驗上百例，陽性率為約70%。用本發明的人肝癌的血清學診斷試劑盒檢測為陽性的對象，其肝癌的幾率明顯高于正常人群或一般肝癌患者。藥物組合物本發明還提供了ー種藥物組合物，它含有上述的CYP17A1的拮抗劑，以及藥學上可接受的載體。所述的藥物組合物可用于抑制肝癌細胞的生長。在本發明中，所述的拮抗劑包括針對CYP17A1的siRNA、反義RNA、抗體、或其組合。此外，所述的拮抗劑還包括可以降低CYP17A1表達或活性的小分子化合物。通常，可將CYP17A1拮抗劑配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限干)腹膜內、靜脈內、或局部給藥。本發明的藥物組合物可直接用于抑制肝癌細胞的生長。此外，還可與其他腫瘤治療劑聯用。本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明上述的CYP17A1拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、こ醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約I微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明的CYP17A1拮抗劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約I毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。本發明的主要優點包括(I)肝癌作為病死率最高的惡性腫瘤之一，早發現早治療是提高病人存活率的最有效手段。由于目前肝癌早期診斷的血清標記物稀少，發現癌變病人大多為晩期。CYP17A1是本發明人首次發現的一個肝癌血清標志物，可應用于肝癌的早期診斷。(2)提供了ー種新的通過血清標志物檢測和判斷肝癌的方法，有助于早期檢測或輔助檢測肝癌，從而有助于盡早確診并采取相應治療措施。(3)血清檢測方法更方便快速，更容易為病人接受。 (4)本發明還提供了 CYP17A1應用于肝癌診斷的檢測方法和試劑盒，為CYP17A1的具體實施提供了可靠保證。下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊 (New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例I、熒光定量RT-PCR檢測CYP17AlmRNA在人肝癌組織樣本中的表達檢測材料及其制備選取33例肝癌患者的肝癌及其癌旁組織的新鮮樣本，保存在液氮中。采用TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)，按照說明書推薦的方法制備各組織樣本的總RNA，逆轉錄制備cDNA模板。設計合成CYP17A1熒光定量PCR引物，以及用作內參的GAPDH引物CYP17A1 上游引物序列為5’ -ITCGTATGGGCACCAAGACT-3’ [SEQ ID NO. 3]；CYP17A1 下游引物序列為:5，-GTTGTTGGACGCGATGTCTA-3’ [SEQ ID NO. 4]；GAPDH 上游引物序列為5’ -GITCGACAGTCAGCCGCATC-3’ [SEQ ID NO. 5]；GAPDH 下游引物序列為5’ -GGAATTTGCCATGGGTGGA-3’ [SEQ ID NO. 6]；操作方法在20 ill反應體系中，依次加入I U I cDNA模板(來自于待測的組織樣本)，10 U I SYBR Master Mix (購自 Applied Biosystems 公司)，上游和下游引物(IOiiM)各I Ul，最后補加去離子水至20 ill。然后按如下條件進行PCR反應測定CYP17A1的PCR反應條件為95°C 10分鐘預變性，之后進行40個循環，每循環包括95°C 20秒，60°C 20秒，72°C25秒。測定GAPDH的反應條件相同。所用的PCR儀器為Applied Biosystems公司的7500fast熒光定量PCR儀，并采用該公司提供的定量分析軟件對結果進行分析。結果如附圖I所示，在檢測的33對肝癌及癌旁組織樣本中，CYP17AlmRNA在肝癌中表達較癌旁高2倍以上的有23對，其比例約為70%。因此，CYP17AlmRNA在肝癌中顯著高表達(p < 0. 001)。實施例2、CYP17AImRNA檢測試劑盒的制備如實施例I所述，CYP17AlmRNA的高表達與肝癌疾病密切相關，據此可制備CYP17AlmRNA檢測試劑盒。該試劑盒含有試劑1，濃度為IOOiiM的CYP17A1上游引物。試劑2，濃度為IOOiiM的CYP17A1下游引物。試劑3，2 XPCR反應液，包括Taq DNA聚合酶，dNTP，鎂離子，SYBR熒光染料。該試劑可從Applied Biosystems公司購置。 試劑4，無核酶水。試劑5，內參GAPDH引物對，濃度各為100 ii M。操作說明(步驟)(I)待測樣品的制備，從待測樣品中提取mRNA，并反轉錄為cDNA。可使用常規方法或試劑盒(如TRIzol RNA抽提試劑盒)。(2)按如下體系配制PCR反應液cDNA 模板，0. 5-2 U I試劑1，I ill (終濃度 0.5 ii M/ill)試劑2，I ill (終濃度 0.5 iiM/ill)試劑3，10 ill試劑4，補足 20 ill注同時在同等條件下按相同體系配制內參對照GAPDH PCR反應液。(3) PCR反應在熒光定量PCR儀上進行，PCR反應條件可根據需要調整，建議條件為950C 10分鐘預變性，之后進行40個循環，每循環包括95°C 20秒，60°C 20秒，72°C 25秒。(4)分析實驗結果，并與正常對照組織樣品進行比較，CYP17AlmRNA表達量高于正常對照2倍或2倍以上的為異常。實施例3、免疫印跡(Western blot)檢測CYP17A1蛋白在人肝癌組織樣本中的表達檢測材料及其制備選取60例肝癌患者的肝癌及其癌旁組織的新鮮樣本，置于液氮中并快速研磨成組織碎片。將組織碎片溶于適量RIPA裂解緩沖液中(50mM Tris HClpH 7. 4,150mM NaCl, I NP-40,1 脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate), 0. I % SDS ；ImlRIPA/0. Ig組織樣品)，冰上放置30min，15000轉/min、4°C條件下離心20min。取上清液，利用BCA蛋白質定量檢測試劑盒(購自上海生エ生物有限公司)進行總蛋白定量井分裝成50iig每份，-80°C保存備用。操作方法各取50 U g蛋白質樣品進行12% SDS-PAGE電泳，待溴酚藍跑至膠的最底層時，用Bio-Rad公司的轉膜儀將蛋白轉至硝酸纖維素膜(購自Amersham Biosciences公司)上，5%脫脂牛奶室溫封閉I小時后，ー抗使用兔抗人CYP17A1多克隆抗體(購自Proteintech 公司，I 1000 稀釋)4°C孵育過夜。孵育結束后，用 TBST(50mM Tris, 150mMNaCl，0. 05% Tween 20，用HCI調節pH到7. 6)洗膜三次，每次IOmin0加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔ニ抗(購自Santa Cruz公司，I 2000稀釋)，室溫孵育I小吋。TBST洗膜三次，每次10分鐘，最后用ECL化學發光試劑(購自Pierce公司)顯色，X-光片曝光檢測蛋白條帶。同時采用P-actin作為等量上樣對照(0-actin單抗購自sigma公司，I : 2000稀釋)。
結果在檢測的60對肝癌及癌旁組織蛋白樣本，CYP17A1在44對樣品中上調表達，其比例約為73%。因此，CYP17A1蛋白在肝癌組織中存在顯著高表達(P < 0.001)，該結果與其mRNA在肝癌組織中的上調表達比例(70% )基本一致。圖2顯示CYP17A1在8對肝癌組織樣本高表達。實施例4、免疫組化分析CYP17A1蛋白在人肝癌組織中的表達檢測材料及其制備選取5例肝癌患者的肝癌及相應的癌旁組織樣本，4%多聚甲醛4°C條件下固定I小時或過夜。PBS緩沖液浸洗三次，每次IOmin至I小吋。結束后，將樣品置于30^,50%こ醇中各30min，最后4°C保存于70%こ醇中，完成固定。制備組織切片時，將固定好的樣品先經梯度こ醇脫水、ニ甲苯透明，然后在52-54°C條件下進行石蠟包埋 ，切片機切片，切片厚4-10 u m,貼于多聚賴氨酸處理過的干凈載玻片上，34°C烤片過夜，之后收集于載片盒中，4°C密封保存。操作方法取制備好的組織切片，首先進行ニ甲苯脫蠟、梯度こ醇復水，然后加入0. 3%過氧化氫37°C孵育20分鐘，去內源性過氧化物酶；切片浸于PH6. 0檸檬酸緩沖液中，微波進行抗原修復15分鐘，自然冷卻；PBS浸洗，5分鐘X3次；加入兔抗人CYP17A1多抗(購自Proteintech公司，I 200稀釋)，37°C反應I小時后4°C孵育過夜；PBS浸洗，5分鐘X 3次；加入HRP標記的羊抗兔即用型ニ抗(購自Dako公司)，37で反應I小時；PBS浸洗，5分鐘X 3次；DAB底物溶液(購自Dako公司)顯色，蘇木素復染，こ醇脫水，ニ甲苯透明，中性樹膠封片。結果如附圖3所示，CYP17A1蛋白主要定位于細胞質中，并呈彌散性分布。在檢測的5對組化樣品中，其在肝癌組織中的表達均明顯高于相應的癌旁組織。圖3所示為其中的I對組化樣品代表性圖片，圖中棕黃色越深，表明CYP17A1蛋白表達越強。實施例5、采用組織芯片檢測CYP17A1蛋白在人肝癌組織樣本中的表達檢測材料為了進一步證實CYP17A1蛋白在臨床人肝癌組織中的高表達并擴大檢測規模，本實施例采用了 200點肝癌組織芯片(購自上海生物芯片公司)進行免疫組化分祈。該芯片包含了 87例肝癌患者的肝癌及相應的癌旁組織，13例非肝癌患者的癌及相應的癌旁組織(包括3對膽管細胞癌及對應的癌旁組織，6對腺癌及對應的癌旁組織，3對血管瘤及對應的癌旁組織，I對鱗狀細胞癌及對應的癌旁組織)。操作方法免疫組化采用標準化的程序進行，由芯片公司完成。一抗采用兔抗人CYP17A1多克隆抗體(購自Proteintech公司)，(HRP)標記的羊抗兔抗體為ニ抗(購自Santa Cruz公司。CYP17A1蛋白在組織芯片中的表達結果由兩位病理學家分別獨立進行分析。組織芯片分析主要根據ニ個指標，染色細胞百分比(0-100%)，以及染色強度(采用0-3級系統0，無染色；1，弱染色；2，中度染色；3，強陽性染色)。綜合評估兩個指標，得出免疫染色評分結果(免疫染色評分等于染色細胞百分與染色強度相乘)。結果如圖4A所示，左圖是CYP17A1在一對肝癌及其癌旁組織芯片點中表達的代表性圖片，右圖是該芯片點的局部放大圖(放大倍數為200倍)。圖中顯示CYP17A1蛋白在肝癌組織中高表達，主要定位于細胞質中，并呈彌散性分布。圖4B所示CYP17A1蛋白在每對肝癌(T)及對應癌旁組織(N)中的表達差異，T/N > I為肝癌中高表達；T/N < I為肝癌中低表達，T/N= I為表達無差異。在芯片的87對肝癌組織樣本中，CYP17A1蛋白在肝癌組織中的表達高于癌旁組織的有58對，其比例約為66. 70ん統計分析表明，CYP17A1蛋白在肝癌中顯著高表達(P< 0. 001)。實施例6、酶聯免疫反應(ELISA)測定CYP17A1蛋白在肝癌病人血清及正常健康人血清中的含量檢測材料及其制備收集30例正常健康人及115例肝癌患者血液樣品，這些樣品均來自東方肝膽外科醫院。將血液樣品室溫靜置2小時，使其自然凝固，2500轉/min、4°C條件下離心20min。仔細收集上清，如收集過程中出現沉淀，應再次離心。所得上清液即為血清樣品，分裝后置于_80°C保存。操作方法按I : 400比例稀釋羊抗人CYP17A1多抗(購于Santa Cruz公司，捕 獲抗體)于I XELISA包被液(購于KPL公司)中，100 iil/孔加到酶標板(購于上海吉泰公司)中，室溫孵育I小時；棄去孔內液體，甩干；每孔加IXBSA封閉液(購于KPL公司)300iU，室溫封閉10分鐘；棄去孔內液體，甩干；將待測血清樣品按I : 100比例稀釋于I XBSA封閉液中，100 iil/孔加到酶標板中，室溫孵育I小時或4°C過夜；棄去孔內液體，甩干，I XELISA洗滌液(購于KPL公司)洗板5次，大約400 U I/每孔，每次浸泡1_2分鐘；按I 2000比例稀釋兔抗人CYP17A1多抗(購于Proteintech公司，檢測抗體)于IXBSA封閉液中，100 iil/孔加到酶標板中，室溫孵育I小時；棄去孔內液體，甩干，重復如上洗板步驟；按I : 3000比例稀釋辣根酶標記的羊抗兔ニ抗(購于Proteintech公司)于I XBSA封閉液中，100 iil/孔加到酶標板中，室溫孵育I小時；棄去孔內液體，甩干，重復如上洗板步驟；每孔加ABTS底物溶液(購于KPL公司)100 u 1，避光顯色10分鐘；每孔加終止溶液(購于KPL公司)100 yl，終止反應；立即用酶標儀在405nm波長測量各孔的光密度(0. D.值)。同時,將CYP17A1重組蛋白標準品(購于Proteintech公司)按如下濃度梯度稀釋0pg/ml,156. 25pg/ml,312. 5pg/ml,625pg/ml,1250pg/ml,2500pg/ml,5000pg/ml,lOOOOpg/ml,與待測血清樣品一起在同等條件下測定0. D.值，以制作標準曲線。結果如圖5A所示，CYP17A1蛋白在正常人(n = 30)血清中的平均含量為25. 5ng/ml ；在肝癌病人(n = 115)血清中的平均含量為115ng/ml。統計分析表明，CYP17A1蛋白在肝癌病人血清中的含量顯著高于其在正常人血清中的含量(P < 0. 001)。對CYP17A1在正常人血清及肝癌病人血清中的表達水平進行ROC曲線分析，其結果如圖5B所示，圖中ROC曲線下的面積越大表明診斷價值越高，CYP17A1的ROC曲線面積為0. 889，顯著大于參考曲線面積0. 5(P < 0. 001)，表明CYP17A1作為肝癌的血清學分子標志物，具有很好的診斷價值。根據CYP17A1在正常人血清中含量的95%置信區間，以CYP17A1濃度34. 5ng/ml為臨界值(Cut-off Point)時，其檢測靈敏度和特異度分別可以達到為86. 1%和 70%。實施例7、CYP17A1酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒的制備如實施例6所述，CYP17A1蛋白可以分泌到肝癌病人的血清中，并且其在肝癌病人血清中的含量顯著高于正常人血清中的含量。統計分析結果表明，以其濃度34. 5ng/ml為判斷臨界值時，其檢測誤差最小，靈敏度和特異度最好。據此可制備其ELISA檢測試劑盒。該試劑盒含有96孔酶標板一塊，試劑A，羊抗人CYP17A1多克隆，臨用前做I : 400倍稀釋。試劑B，兔抗人CYP17A1多抗，臨用前做I 2000倍稀釋。試劑C，辣根酶標記的羊抗兔ニ抗，臨用前做I : 3000倍稀釋。試劑D，人CYP17A1重組蛋白標準品，濃度為lmg/ml (0. Iml體積)。其他任選試劑，包括ELISA包被液，ELISA封閉液，ELISA洗滌液，ELISA顯色液， ELISA終止液。操作說明(步驟)(I)制備待測血清樣品,全血標本于室溫靜置2小時后，2500轉/min離心20分鐘，取上清暫置于4°C待測，或_80°C保存。(2)取酶標板ー塊，設置好標準品孔、待測樣品孔及對照孔后，每孔加試劑AlOOiil，室溫孵育I小時。(3)棄去孔內液體，甩干；姆孔加ELISA封閉液300 iil，室溫封閉10分鐘。(4)將待測血清樣品均按I : 100比例稀釋于ELISA封閉液中，IOOiil/孔加到酶標板中，室溫孵育I小時或4°C過夜；同時將試劑D按如下濃度梯度稀釋0pg/ml，156. 25pg/ml,312. 5pg/ml,625pg/ml,1250pg/ml,2500pg/ml,5000pg/ml,lOOOOpg/ml,與待測血清樣品一起按同樣步驟測定0. D.值，以制作標準曲線。(5)棄去孔內液體，甩干，ELISA洗滌液洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 ii I/每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。(6)每孔加試劑B 100 U 1，室溫孵育I小時。(7)棄去孔內液體，甩干，ELISA洗滌液洗板5次，方法同步驟5。(8)每孔加試劑C lOOiil，室溫孵育I小時。(9)棄去孔內液體，甩干，ELISA洗滌液洗板5次，方法同步驟5。(10)每孔加ELISA顯色液100 ，室溫避光反應10分鐘。(11)每孔加ELISA終止液lOOiU，終止反應；立即用酶標儀在405nm波長測量各孔的光密度(0. D.值)(12)繪制標準曲線，計算樣品濃度。以34. 5ng/ml為臨界值進行分析，大于或等于該臨界值判斷為肝癌血清樣品。小于該臨界值判斷為正常樣品。實施例8檢測肝癌的試劑盒制備ー用于血清學檢測肝癌的試劑盒，所述試劑盒包括(a)第一容器，以及位于容器內的特異性針對CYP17A1的以下抗體羊抗人CYP17A1多抗(可購自Santa Cruz公司，捕獲抗體)；(b)以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測或診斷肝癌；以及(c)任選的第二容器，以及位于容器內的檢測抗體兔抗人CYP17A1多抗(可購自Proteintech公司，檢測抗體)
用上述檢測試劑盒，通過ELISA法定量檢測了未知血清樣本(145例，其中115例為HCC患者樣本)中CYP17A1的含量。結果表明，當陽性閾值取70ng/ml時，評定81例肝癌樣本為CYP17A1陽性，陽性率約 70% ；實施例9CYP17A1蛋白的表達強度與肝癌分化程度有相關性在本實施例中，進ー步分析CYP17A1蛋白在肝癌中的表達與臨床病理參數的相關性。 結果如Table I所示，CYP17A1的表達與年齡、性別未發現有相關性，但是其表達與組織分級顯著相關(P = 0. 036)。其中Gl為分化程度較好的肝細胞肝癌(HCC)，G2為中度分化HCC，G3為分化較差HCC。通過統計分析，我們發現CYP17A1強表達在分化較好的HCC(Gl)中占55%，在G2或G3中分別為27%或20%。這表明CYP17A1的表達可能與肝癌的惡性程度有夫。CYP17A1在不同分化程度的HCC中的表達見圖6。表I CYP17A1表達與臨床病理參數的相關性
_病人數(%)_
_ 參數__病人__CYP17A1 弱__CYP17A1 強__P 值*_
組織
HCC87 37 (42. 5)50 (57. 5)
〈O. 001
_ 癌旁組織__87 —— 78 (89.7)__9 (10. 3)__
病人年齡
<6057 42 (73. 7)15 (26. 3) >0. 05
_彡60__30__19 _(63.4)__11_(36.6)__
性別
男 80 54(67.5) 26 (32. 5) >0. 05_ 女__7__7 _(100)__0 _(0)__
組織學分級
Gl188 (44. 4)10(55. 6)
0. 036
G24029(72.5)11 (27. 5)
_ G325 _20 (80)5 (20 ) __*P值用卡方檢驗(Chi-square test)計算，P < 0. 05視為顯著。實施例10ELISA檢測CYP17A1在肝癌病人血清中的高表達I.酶聯免疫吸附實驗(ELISA)設計方案采用羊抗人的CYP17A1多抗為捕獲抗體(Capture antibody),兔抗人的CYP17多抗為檢測抗體(Detection antibody)。捕獲抗體主要作用于CYP17A1蛋白的N-端,檢測抗體主要作用于CYP17A1蛋白的C-端。將重組的人全長CYP17A1蛋白作為標準參照品，制作ELISA測定所用標準曲線。通過將CYP17A1蛋白標準品倍比稀釋成不同濃度梯度(Opg/ml,156. 25pg/ml,312. 5pg/ml,625pg/ml,1250pg/ml,2500pg/ml,5000pg/ml,7500pg/ml,lOOOOpg/ml)，測定其OD值，以制作標準曲線。由標準曲線可見，該ELISA系統具有較好的靈敏度和準確性。R2，相關系數的平方，其值越接近1，表明曲線的準確度越高。(圖7A和7B)2.測定CYP17A1蛋白在肝癌、こ肝、肝硬化及肺癌患者血清中的含量及分析。利用上述的ELISA系統，共測定了 CYP17A1在212例不同人群血清樣本中的表達，其中包括115例肝癌患者(HCC)血清樣本，30例正常人(Healthy)血清樣本，40例こ肝病人(HBV)血清樣本，17例肝硬化病人(Cirrhosis)血清樣本，10例肺癌(Lung cancer)血清樣本。如圖8所示，其中CYP17A1在各種不同人群血清中的含量均用中位數表示。其在正 常人群中的含量為25. 5ng/ml (變化范圍0-65. 2ng/ml)，HBV中的含量為57. 7ng/ml (變化范圍 I. 3_116ng/ml)，Cirrhosis 中的含量為 39. 2ng/ml (變化范圍 8. 9-83. 7ng/ml)，Lungcancer中的含量為22. 9ng/ml (變化范圍0. 05-37. 5ng/ml)。而其在HCC病人中的含量為115. lng/ml (變化范圍0-407. 5ng/ml)，統計分析表明，CYP17A1在肝癌血清樣本中的含量顯著高于其他非肝癌血清樣本(***，P < 0. 001)。實施例11CYP17A1蛋白在AFP陰性及AFP陽性肝癌患者血清樣本中的含量及分析以臨床常用的20ng/ml為AFP的臨界值，CYP17A1在AFP陰性肝癌血清樣本中的含量為119. 9ng/ml (變化范圍0-279. 3ng/ml)，AFP陽性肝癌血清樣本中的含量為111. 2ng/ml (變化范圍 0-407. 5ng/ml)。統計分析表明，CYP17A1在AFP陰性或陽性肝癌患者中都呈高表達，均顯著高于其在正常人的含量(25. 5ng/ml，變化范圍0-65. 2ng/ml，P < 0. 001)(圖9)。值得注意的是，CYP17A1在AFP陰性肝癌血清樣本中亦存在高表達，說明CYP17A1可以補充AFP陰性肝癌的檢出率，在臨床診斷上有其特殊的價值。實施例12CYP17A1與AFP肝癌診斷試劑的比較進ー步分析了 CYP17A1蛋白用于肝癌診斷的靈敏度和特異度等指標，并與現有的肝癌診斷標志物AFP進行了比較。通過ROC曲線分析它們在區分肝癌患者和正常人群時的靈敏度和特異度。結果如圖10A所示，在區分肝癌病人和正常人吋，以34. 5ng/ml為臨界值，CYP17A1的AUC(R0C曲線下的面積，值越大，判斷價值越高)為0. 89，對應的靈敏度和特異度分別可以達到86%和70%，正確率為83%;而在同樣的樣本中，AFP的AUC為0. 73，對應的靈敏度和特異度分別為61%和67%，正確率為62%。CYP17A1顯著優于AFP(P<0. 001)。兩者聯合可以進ー步提高靈敏度和特異度至90 %和70 %，正確率為86 %，AUC則可以增加到0. 92。另外，如圖10B所示，在區分臨床I-II級早期肝癌病人(early HCC)和正常人吋，以34. 5ng/ml為臨界值，CYP17A1的AUC為0. 82，對應的靈敏度和特異度分別可以達到75%和67%，正確率為80% ;而在同樣的樣本中，AFP的AUC為0. 60，對應的靈敏度和特異度分別為45%和65%，正確率為57%。CYP17A1顯著優于AFP(P<0. 001)。兩者聯合可以進ー步提高靈敏度和特異度至75%和97%，正確率為88%，AUC則可以增加到0. 85。實施例13CYP17A1與AFP在肝癌血清樣本中的表達分析以CYP17A1濃度34. 5ng/ml, AFP濃度20ng/ml為臨界值兩種標志物在肝癌血清中的表達情況如圖11所示。樣本1-39號，CYP17A1高于臨界值，AFP處于正常范圍，其比例為33. 9% ;樣本40-45號，CYP17A1和AFP均處于正常范圍，其比例為5. 2% ;樣本46-55號，CYP17A1處于正常范圍，AFP高于臨界值，其比例為8. 7% ;樣本56-115，CYP17A1和AFP均高于臨界值，其比例為52. 2%。該結果表明，CYP17A1在肝癌病人血清中的高表達比率大于AFP，CYP17A1的肝癌、檢出率顯著優于現有的肝癌診斷標志物AFP (P < 0. 001)。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻被単獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種細胞色素p450家族17亞家族A多肽I (CYP17A1蛋白)的基因、mRNA、cDNA、或蛋白的用途，其特征在于，它被用作檢測肝癌的標志物；或用于制備檢測肝癌的試劑或試劑盒。
2.細胞色素p450家族17亞家族A多肽I(CYP17A1蛋白)或其特異性抗體的用途，其特征在于，用于制備檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。
3.一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含 (a)抗細胞色素p450家族17亞家族A多肽I(CYP17A1蛋白)的抗體；和/或 (b)特異性擴增CYP17AlmRNA或CYP17AlcDNA的引物或引物對。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測或診斷肝癌。
5.一種細胞色素p450家族17亞家族A多肽I (CYP17A1蛋白)或其特異性抗體的用途，其特征在于，用于制備血清檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述的CYP17A1蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。
7.一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有CYP17A1蛋白或其特異性抗體；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于血清檢測或血清診斷肝癌。
8.一種用于檢測肝癌的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有特異性擴增CYP17AlmRNA或cDNA的特異性引物；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于通過定量檢測CYP17A1的表達量來判斷患肝癌的幾率。
9.一種細胞色素p450家族17亞家族A多肽1(CYP17A1蛋白)的用途，其特征在于，它被用作血清檢測肝癌的標志物。
10.一種細胞色素p450家族17亞家族A多肽1(CYP17A1蛋白)的拮抗劑的用途，它被用于制備抑制肝癌細胞生長的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種檢測肝癌的標志物及其應用。具體地，本發明提供了細胞色素p450家族17亞家族A多肽1(CYP17A1蛋白)在制備檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒中的用途。研究表明，CYP17A1在肝癌組織中的表達量高于其癌旁正常組織，且CYP17A1在肝癌患者血清中的含量顯著高于正常人群。因此，CYP17A1可作為肝癌的診斷(尤其是血清學診斷)的標志物。本發明還提供了相應的檢測方法和試劑盒。本發明方法和試劑盒具有很好的血清檢測效果。
文檔編號A61P35/00GK102732608SQ20121009103
公開日2012年10月17日 申請日期2012年3月30日 優先權日2011年3月31日
發明者李載平, 王峰, 答亮, 許穎, 趙慕鈞, 邢振 申請人:中國科學院上海生命科學研究院