專利名稱：D-乳酸診斷/測定試劑盒及d-乳酸的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定D-乳酸濃度的方法，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。
技術背景L-乳酸是近年來人們十分關注并發展較快的有機酸。同時L-乳酸具有 在食品、飼料、醫藥、塑料、飼料、農藥、日用化工、造紙及電子工業等 多領域應用前景。L-乳酸是大多數生物體代謝作用的終產物。僅少數微生物(例乳酸菌屬、 明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產酸奶時非常注意檢測乳酸鹽，以評估微 生物是否產生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微 生物造成了污染。乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關 系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5%。血乳酸測試作為一個監護、監測運動員訓練能力的手段，把血乳酸值作 為衡量運動員有氧耐力水平、無氧訓練能力、身體疲勞恢復等方面的一個 重要數據，供安排訓練時參考。酶法分析是國際上公認的分析方法，己被多個國際權威組織或機構采 納如IFU (國際果汁生產者協會),AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產者聯盟),及MEBAK， OICC, VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標準檢測方法。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用具有D-乳酸特異性的雙倍擴增法(Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及 偶聯法(Couple Reaction)技術，計量/連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原 型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定D-乳酸濃度的方法，同 時，本發明還將給出用以實現該方法的D-乳酸診斷/測定試劑盒，采用該試 劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行D-乳酸濃 度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明D-乳酸濃度測定方法原理如下D-乳酸+輔酶D-乳酸脫氫酶丙酮酸+還原型輔酶 丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶 這種方法應用具有D-乳酸特異性D-乳酸脫氫酶(D-lactic acid dehydrogenase; EC 1丄1.28 )偶聯丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ; EC1.2丄51)酶促反應速率比色法/終點法。D-乳酸脫氫酶酶解D-乳酸反應 產生丙酮酸，同時將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶 (在340nm處有吸收峰)。D-乳酸脫氫酶酶解D-乳酸產生的丙酮酸，再通 過偶聯丙酮酸脫氫酶的作用，又再次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還 原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，由于二次將輔酶還原成為還 原型輔酶，因此可以將反應靈敏度提高二倍；從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算D-乳酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明D-乳酸診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L輔酶A 5 mmol/LD-乳酸脫氫酶 12000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L本發明的D-乳酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括-緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A。 試劑2緩沖液、穩定劑、D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。 輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A。 試劑2緩沖液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩定劑、D-乳酸脫氫酶。輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定D-乳酸濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為單試劑，包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 100 mmol/L穩定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L輔酶A 5 mmol/LD-乳酸脫氫酶 12000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C,反應時間10分鐘，起始吸光 度《0.1,測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測D-乳酸樣品與試 劑的體積比例為1/25,反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的 濃度大小。 實施例二
本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 100 mmol/L
穩定劑 5Ommol/L 輔酶 ■ 3 mmol/L
輔酶A
5 mmol/L
試劑2
甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 穩定劑
D-乳酸脫氫酶 丙酮酸脫氫酶
100 mmol/L
500 mmol/L
12000U/L
12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用,在全自動生化分析儀上設定溫度37'C,反應時間10分鐘，起始吸光
度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測D-乳酸樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲 時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的 濃度大小。 實施例三
本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 穩定劑
輔酶A
試劑2
甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 穩定劑
丙酮酸脫氫酶
試劑3
甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 穩定劑
D-乳酸脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定D-乳酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm, 被測D-乳酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的 濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種具有D-乳酸特異性的雙倍擴增法、酶比色法及酶聯法的D-乳酸的濃度測定方法，其方法原理如下D-乳酸+輔酶D-乳酸脫氫酶丙酮酸+還原型輔酶丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出D-乳酸的濃度大小測定結果。
2. —種D-乳酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩定劑 1——4000 mmoI/L輔酶 1- 6 mmol/L輔酶A 1- 6 mmol/LD-乳酸脫氫酶 1000——80000 U/L丙酮酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶組成 單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶組成 雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑、D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶組成 多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、 D-乳酸脫氫酶組成。輔酶、輔酶A、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用具有D-乳酸特異性的雙倍擴增法、酶比色法及酶聯法技術的D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定D-乳酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、輔酶A、D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324556SQ20071002322
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司