專利名稱：D-乳酸診斷/測定試劑盒及d-乳酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種具有D-乳酸特異性的D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本 發明還涉及測定D-乳酸濃度的方法，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。
技術背景L-乳酸是近年來人們十分關注并發展較快的有機酸。同時L-乳酸具有在 食品、飼料、醫藥、塑料、飼料、農藥、日用化工、造紙及電子工業等多領 域應用前景。L-乳酸是大多數生物體代謝作用的終產物。僅少數微生物(例乳酸菌屬、 明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產酸奶時非常注意檢測乳酸鹽，以評估微生 物是否產生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微生 物造成了污染。乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關 系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的卜5%。血乳酸測試作為一個監護、監測運動員訓練能力的手段，把血乳酸值作 為衡量運動員有氧耐力水平、無氧訓練能力、身體疲勞恢復等方面的一個重 要數據，供安排訓練時參考。酶法分析是國際上公認的分析方法，已被多個國際權威組織或機構采納 如IFU (國際果汁生產者協會)，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產者聯盟)，及MEBAK， OICC, VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標準檢測方》去。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用具有D-乳酸特異性的酶循環擴增》去(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯法(Couple Reaction)技術，計量通過酶聯反應生成吲嗒胺 色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導致在400—700nm 波長處吸光度的上升，得以測定D-乳酸濃度的方法，同時，本發明還將給 出用以實現該方法的D-乳酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在可見 光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行D-乳酸濃度測定，而且測定速度 快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明D-乳酸濃度測定方法原理如下 D-乳酸+2高鐵細胞色素0D-乳酸脫氫酶丙酮酸+2亞鐵細胞色素c 丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水這種方法應用具有D-乳酸特異性的D-乳酸脫氫酶(D-Lactate dehydrogenase; EC 1.1.2.4; EC Ll.2.5)酶聯丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19) 及過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反應終點/速率比色法。D誦乳酸脫氫酶作為作用酶，功能為將D-乳酸酶解產生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶也 作為作用酶，它的酶促作用使丙酮酸產生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作為循環酶 可以一再將丙氨酸再次變回丙酮酸，使丙酮酸不斷地被重復循環利用；同時 不斷地重復循環產生過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1 l丄7)作 為顯色酶，通過和過氧化氫的作用，使無色的還原型色原體組合氧化成有色 的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400—700nrn (根據還原型色原 體組合的不同而定)波長處測定染料一剛嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞 胺色原(Quioneiminedye)—含量高低的光吸收大小程度/速度，得出氨基酸 (氮)濃度大小測定結果。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮， 如下成分關系的本發明D-乳酸診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液100mmol/L穩定劑500 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L2高鐵細胞色素c10 mmol/L氨離子20 mmol/LD-乳酸脫氫酶10000 U/L丙氨酸脫氫酶10000 U/L甘氨酸氧化酶10000U/L過氧化物酶30000 U/L還原型色原體組合0.1-20mmol/L所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何一個配 對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻哇酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一W- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗石比4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本發明的D-乳酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、 丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1緩沖液、穩定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶、2高鐵細胞色素 c、氨離子。 試劑2緩沖液、穩定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、D-乳酸脫氫酶、 丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、氨離 子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶、2高鐵細胞色素 c、氨離子。 試劑2緩沖液、穩定劑、還原型色原體組合、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、 過氧化物酶。 試劑3緩沖液、穩定劑、D-乳酸脫氫酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。實施例一本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為單試劑, 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 2高鐵細胞色素cD-乳酸脫氫酶丙氨酸脫氫酶甘氨酸氧化酶過氧化物酶4-氨基抗砒石碳酸包括100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L 10000U/L 10000U/L 30000 U/L 2 mmol/L 10 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，測試主波 長505nm，測試副波長600nm，被測D-乳酸樣品與試劑的體積比例為1/25， 反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃 度大小。 實施例二本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑還原型輔酶2高鐵細胞色素c試劑22，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑D-乳酸脫氫酶100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 0.2 mmol/L甘氨酸氧化酶 過氧化物酶100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000U/L 10000U/L 25000 U/L 0.6 mmol/L4-氨基抗砒試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37X:，反應時間IO分鐘，測試主波長14546nm，測試副波長600nm，被測D-乳酸樣品與試劑的體積比例為1/20，反 應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約1分 鐘左右，檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃 度大小。 實施例三本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑還原型輔酶2高鐵細胞色素c試劑23_甲基_2_苯噻唑酮腙三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L0.6 mmol/L甘氨酸氧化 過氧化物酶雙甲基苯胺100mmol/L 500 mmol/L10000U/L10000U/L20000 U/L 2 mmol/L試劑15三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/LD-乳酸脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間IO分鐘，測試主波長 578nm，測試副波長660nm，被測D-乳酸樣品與試劑的體積比例為1/30，反 應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約1分 鐘左右，檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃 度大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色原 體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不 另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過可見光分析儀器 得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質量污染。
權利要求
1.一種具有D-乳酸特異性的酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的D-乳酸濃度測定方法，其方法原理如下D-乳酸+2高鐵細胞色素c D-乳酸脫氫酶丙酮酸+ 2亞鐵細胞色素c丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸 +水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+ 過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出D-乳酸濃度大小測定結果。
全文摘要
本發明涉及一種利用具有D-乳酸特異性的酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定D-乳酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩定劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出D-乳酸濃度的大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324561SQ200710023230
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司