專利名稱：山梨醇脫氫酶診斷試劑盒及山梨醇脫氫酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測 定山梨醇脫氫酶活性濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
山梨醇脫氫酶能可逆地催化D-山梨醇氧化為D-果糖。人體內此酶 主要分布肝臟，腎、腦、心、脾等組織中含量極少，血清中此酶活力 很低，如酶活力升高，強烈提示肝損害。檢測血清SDH在反映肝損傷 方面較ALT可能更具特異性。
山梨醇脫氫酶測定方法國內多采用終點法，此法無需特殊試劑和儀 器，適合基層實驗室應用，但操作繁瑣，需除蛋白，敏感性低，干擾 因素多，且不能用于自動生化分析儀。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術，連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定山梨醇脫氫酶活性濃度的方 法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的山梨醇脫氫酶診斷試劑 盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分 析儀上進行山梨醇脫氫酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高， 因而可以得到切實的推廣應用。本發明山梨醇脫氫酶活性濃度測定方法原理如下
山梨醇+輔酶 山梨醇脫氫酶 山梨糖+還原型輔酶
這種方法應用山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase ; EC 1.1.99.21)
酶促反應連續監測法。山梨醇脫氫酶酶解山梨醇反應，最終將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量 340nm處吸光度上升的速度，可以測算山梨醇脫氫酶的活性濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑還是雙劑，如下成分關系的本發明山梨醇脫氫酶診斷
試劑較為理想
緩沖液 lOOmmol/L
穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
山梨醇 30 mmol/L
本發明的山梨醇脫氫酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、輔酶、山梨醇。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩定劑、山梨醇。 輔酶、山梨醇在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是
干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑還是雙劑，本發明測定山梨醇脫氫酶活性濃度的方法， 其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的山梨醇脫氫酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
山梨醇 30mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測山梨醇 脫氫酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)， 延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出山梨醇
脫氫酶的活性濃度大小。 實施例二
本實施例的山梨醇脫氫酶診斷試劑為雙試劑，包括:
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
輔酶
100mmol/L
50 mmol/L
mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
山梨醇
100mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測山梨醇 脫氫酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應 (上升反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論 K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出山梨醇 脫氫酶的活性濃度大小。 實施例三
本實施例的山梨醇脫氫酶診斷試劑為雙試劑，包括
訓mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L
層mmol/L 50 mmol/L 2 mmol/L
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑 山梨醇 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑 輔酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
測定山梨醇脫氫酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度 37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測 試副波長405nm，被測山梨醇脫氫酶樣品與試劑1、試劑2的體積比 例為4/40/10，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘 左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出山梨醇 脫氫酶的活性濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法技術的山梨醇脫氫酶活性濃度測定方法，其方法原理如下山梨醇+輔酶 山梨醇脫氫酶 山梨糖+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出山梨醇脫氫酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩定劑 1——50 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L山梨醇 1- 50mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、山梨醇組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、山梨醇組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、山梨醇組成。 輔酶、山梨醇在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩定劑1－4000mmol/L或0.1％100％體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法技術的山梨醇脫氫酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定山梨醇脫氫酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、山梨醇及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出山梨醇脫氫酶的活性濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N21/78GK101173896SQ200610097310
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優先權日2006年10月30日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司