專利名稱：D-乳酸診斷/測定試劑盒及d-乳酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種具有D-乳酸特異性的D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時 本發明還涉及測定D-乳酸濃度的方法，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。
技術背景L-乳酸是近年來人們十分關注并發展較快的有機酸。同時L-乳酸具有 在食品、飼料、醫藥、塑料、飼料、農藥、日用化工、造紙及電子工業等 多領域應用前景。L-乳酸是大多數生物體代謝作用的終產物。僅少數微生物(例乳酸菌屬、 明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產酸奶時非常注意檢測乳酸鹽，以評估微 生物是否產生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微 生物造成了污染。乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關 系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5%。血乳酸測試作為一個監護、監測運動員訓練能力的手段，把血乳酸值作 為衡量運動員有氧耐力水平、無氧訓練能力、身體疲勞恢復等方面的一個 重要數據，供安排訓練時參考。酶法分析是國際上公認的分析方法，已被多個國際權烕組織或機構采 納如IFU (國際果汁生產者協會)，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產者聯盟),及MEBAK, OICC, VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標準檢測方法。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用具有D-乳酸特異性的酶比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(f禺)聯》去(Couple Reaction)技術，監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變 化，得以測定D-乳酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法 的D-乳酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行D-乳酸濃度測定，而且測定速度快、準確度 高，因而可以得到切實的推廣應用。本發明D-乳酸濃度測定方法原理如下D-乳酸+2高鐵細胞色素0D-乳酸脫氫酶 丙酮酸+2亞鐵細胞色素c 丙酮酸+ 二氧化碳+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)L-蘋果酸+輔酶這種方法應用具有D-乳酸特異性的D-乳酸脫氫酶(D-Lactate dehydrogenases; EC 1.1.2.4; EC 1.1.2.5)偶聯蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase; EC 1.1丄38; EC 1.1.1.39; EC 1.1.1.40; EC 1.1.1.83)酶促反應連續監測法/終點比色法。D-乳酸脫氫酶酶解D-乳酸反應產生丙酮酸， 再通過偶聯蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶 在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下降的程 度/速度，可以測算D-乳酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明D-乳酸診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 100 mmol/L穩定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L2高鐵細胞色素c 10 mmol/L二氧化碳 20 mmol/L乳酸脫氫酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 16000 U/L本發明的D-乳酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳、乳酸 脫氫酶、蘋果酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳。 試劑2緩沖液、穩定劑、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫 酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳。 試劑2緩沖液、穩定劑、蘋果酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩定劑、乳酸脫氫酶。還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫 酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定D-乳酸濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為單試劑，包括:三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑還原型輔酶2高鐵細胞色素c二氧化碳100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L乳酸脫氫酶10000U/L蘋果酸脫氫酶 16000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測D-乳酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃度大小。實施例二本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑還原型輔酶2高鐵細胞色素c:氧化碳100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑100 mmol/L 500 mmol/L乳酸脫氫酶 蘋果酸脫氫酶10000U/L 16000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測D-乳酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃度大小。實施例三本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為三試劑， 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑還原型輔酶2高鐵細胞色素c包括::氧化碳腦mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑100mmol/L 500 mmol/L蘋果酸脫氫〗16000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L乳酸脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定D-乳酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37i:，反應時 間IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測D-乳酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出D-乳酸的 濃度大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用具有D-乳酸特異性的酶比色法及酶聯法技術的D-乳酸濃度測定方法，其方法原理如下D-乳酸+2高鐵細胞色素c D-乳酸脫氫酶丙酮酸+ 2亞鐵細胞色素c丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)L-蘋果酸+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出D-乳酸的濃度大小測定結果。
2. —種D-乳酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括:緩沖液穩定劑還原型輔酶2高鐵細胞色素c二氧化碳乳酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶20-500 mmol/L-4000 mmol/L0.1--0.35 mmol/L50 mmol/L1000-50 mmol/L80000 U/L1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。二氧化碳可以碳酸氫鈉取代。
3.根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、2高鐵細胞色素C、 二氧化碳、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳、乳酸 脫氫酶、蘋果酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l,由緩沖液、穩定劑、還 原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳組成；試劑2,由緩沖液、穩 定劑、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、2高鐵細胞色素 c、 二氧化碳、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳、乳酸 脫氫酶、蘋果酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、還 原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳組成；試劑2，由緩沖液、穩 定劑、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、乳酸脫氫酶組 成。還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、 二氧化碳、乳酸脫氫酶、蘋果酸 脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用具有D-乳酸特異性的酶比色法及酶聯法技術的D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定D-乳酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、2高鐵細胞色素c、二氧化碳、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324558SQ20071002322
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司