專利名稱：：評估乳癌風險的方法評估乳癌風險的方法交叉參考本申請根據35U.S.C.§119(e)要求2005年11月16日提交的美國臨時申請No.60/737,281和2006年9月22日提交的美國臨時申請No.60/846，456的權益。政府支持本發明部分地得到國立衛生研究院(NIH)資助No.P01CA45548的支持。美國政府具有本發明的某些權利。
背景技術：
：乳癌是女性中最常見的癌癥并且在當今女性癌癥死亡原因中占第二位。女性一生中發生浸潤性乳癌的機率約為七分之一(13.4%)。乳癌是世界范圍內最常診斷出的癌癥之一，并且是世界上最流行的癌癥、美國癌癥協會估計在2005年有約211,240名美國女性將被診斷患有浸潤性乳癌并且將有40,410名女性死于該疾病2。僅僅浸潤性乳癌就構成女性中32%的所有新發癌癥病例的形成原因2。另外58，490名女性將被診斷患有原位乳癌，這是乳癌的非常早期形式2。征服乳癌的關鍵被認為是早期檢測并治療。但是乳癌被稱為"不可預測的疾病"，因為在乳房X射線攝影或觸診檢測限度下甚至非常小的損傷可能已經發展成轉移性疾病3。乳房X射線攝影(mammography)是目前篩查女性乳癌最靈敏、廣泛應用的方法。目前，盡管乳房X射線攝影是我們檢測乳癌的"金標準"，但是其不是完全可靠的39。當然，最近的進展比如數字乳房X射線攝影已經提高了診斷準確度并且在降低乳癌死亡率中具有顯著差異40，41。然而，就總體診斷準確性而言，乳房X射線攝影有10至30%的假陰性率并且其靈敏度和準確性在乳房密度高的女性中有所消弱42，43。假陽性也是一個實際問題。應當注意的是，在最近研究中，美國乳房X射線攝影人員將所有篩查中的10%判斷為異常-并且幾乎所有這些都是假陽性44，45。此外，盡管大多數女性有機會使用這些工具，但是在許多真正需要它們的人(包括老年人和經濟困難的女性)中并沒有得到充分利用46，47。最近研究顯示，在檢測浸潤性乳癌中，乳房MRI優于乳房X射線攝影，其靈敏度是乳房X射線攝影和超聲的兩倍48。然而，MRI昂貴，健康保險公司不總能支付其費用，并且對于所用技術以及結果解釋在各機構之間有相當大的差異。有機會使用乳房X射線攝影對于少數民族女性、低收入女性和老年女性來說是一個嚴肅的問題46，47，49。費用、害怕疼痛以及缺少對推薦篩查指導的教育也是限制乳房X射線攝影廣泛應用的因素5()，51。乳房X射線攝影檢查需要高技術的專業人員以及購買并放置大且昂貴的設備、以及維護工作和質量保證成本。所有這些因素限制都可限制其可用性，尤其是對于處于不利地位的女性。由于早期檢測的局限性，鑒定女性處于所述疾病風險中以及提供降低風險策略的目標是特別受歡迎的。乳癌風險評估正在成為對女性提供其健康咨詢中越來越重要的部分，尤其是成功技術正發展成為預測哪些女性具有發生乳癌之高風險以及預防癌癥損傷發生。生物標志物的鑒定尤其與改進乳癌的檢測、預后和治療相關。因此，本領域中需要可被快速、容易并安全地檢測的用于乳癌風險評估的替代生物標志物。利用這樣的生物標志物可得到具有高依從率的篩選方法以及鑒定更多需要隨后監測的對象。
發明內容我們顯示處于發生乳癌高風險的女性中尿液金屬蛋白酶(MMP)(例如MMP9)以及解聯蛋白金屬蛋白酶12(adisintegrinandmetalloprotease12，ADAM12)顯著升高，并且監測是否存在MMP9和ADAM12二者代表一種新的乳癌風險評估方法。此外，我們指出MMP9和ADAM12水平可作為乳癌風險的獨立預測因子。而且，我們已經確定，在根據Gai15年風險模型被預測不處于乳癌風險的對象中，尿液ADAM12水平升高預示著乳癌風險增加66，67。因此，本文提供了評估乳癌風險的方法以及指導醫療保健的方法。一方面，提供了通過檢測對象生物樣品中是否存在ADAM12以及是否存在MMP9來評估對象中乳癌風險的方法。ADAM12和MMP9同時存在表示乳癌風險增加。該方法還可包括評估對象歷史的一個或多個方面，比如年齡、種族特性、生育史、月經史、口服避孕藥的使用、體重指數、飲酒史、吸煙史、運動史、飲食、乳癌或其它癌癥家族史(包括其親屬癌癥診斷時的年齡)、個人的乳癌經歷、乳腺活組織檢查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一個實施方案中，評估對象年齡。另一方面，提供了在根據Gail5年風險模型被認為處于乳癌低風險的對象中評估乳癌風險的方法。在一個實施方案中，所述方法包括檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象之生物樣品中ADAM12水平，并將該水平與ADAM12標準水平進行比較，其中與標準水平相比較，ADAM12水平升高表示乳癌風險增加。在一個實施方案中，祁4tGail5年風險模型處于乳癌低風險的對象的分數小于1.67%。在另一個實施方案中，在根據Gail5年風險模型被認為處于乳癌低風險的對象中評估乳癌風險的方法包括檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象之生物樣品中的MMP9水平，并將該水平與MMP9標準水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的MMP9水平表示乳癌風險增加。在一個實施方案中，根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象的分數小于1.67%。在一個實施方案中，在根據Gail5年風險模型被i人為處于乳癌低風險的對象中評估乳癌風險的方法包括檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象之生物樣品中MMP9水平和ADAM12水平，并將該水平與標準的MMP9水平和ADAM12水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌風險增加。在一個實施方案中，根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象的分數小于1.67%。另一方面，提供了評估患者乳癌風險的方法，所述方法包括檢測在一定時期內定期從對象中得到的多個生物樣品中的ADAM12水平和MMP9水平。然后測量生物樣品中所測ADAM12水平和所測MMP9水平的變化。所測ADAM12水平和所測MMP9水平隨時間的升高表示乳癌風險增加。所述方法還可包括評估對象歷史的一個或多個方面，比如年齡、種族特性、生育史、月經史、口月git孕藥的使用、體重指數、飲酒史、吸煙史、運動史、飲食、乳癌或其它癌癥家族史(包括其親屬癌癥診斷時的年齡)、個人的乳癌經歷、乳腺活組織檢查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一個實施方案中，評估了對象年齡。在另一個實施方案中，提供了評估患者乳癌風險的方法，所述方法包括檢測在一定時期內定期從對象中得到的多個生物樣品中的ADAM12水平，然后測量生物樣品中所測ADAM12水平的變化。所測ADAM12水平隨時間的升高表示乳癌風險增加。所述方法還可包拾泮估對象歷史的一個或多個方面，比如年齡、種族特性、生育史、月經史、口服避孕藥的使用、體重指數、飲酒史、吸煙史、運動史、飲食、乳癌或其它癌癥家族史(包括其親屬癌癥診斷時的年齡)、個人的乳癌經歷、乳腺活組織檢查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一個實施方案中，評估了對象年齡。在又一個實施方案中，提供了評估患者乳癌風險的方法，所述方法包括檢測在一定時期內定期從對象中得到的多個生物樣品中的MMP9水平，然后測量生物樣品中所測MMP9水平的變化。所測MMP9水平隨時間的升高表示乳癌風險增加。所述方法還可包括評估對象歷史的一個或多個方面，比如年齡、種族特性、生育史、月經史、口服避孕藥的使用、體重指數、飲酒史、吸煙史、運動史、飲食、乳癌或其它癌癥家族史(包括其親屬癌癥診斷時的年齡)、個人的乳癌經歷、乳腺活組織檢查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一個實施方案中，評估了對象年齡.在一個實施方案中，所述生物樣品是血液、組織、血清、尿液、大便、唾液、血漿、腦脊液、乳頭吸出物、或細胞裂解物上清。在一個實施方案中，所述生物樣品是尿液。在另一些實施方案中，評估乳癌風險的方法還可包括決定對象癌癥診斷檢測的時間安排和/或頻率，或決定對象預防性癌癥治療的時間安排和/或頻率。還提供了指導對象醫療保健的方法。在一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括利用來自對象的生物樣品中ADAM12存在狀況和MMP9存在狀況來評估對象中乳癌風險，其中ADAM12和MMP9同時存在表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估指導醫療保健(包括第二次檢測方法)。在一個實施方案中，分別通過檢測MMP9水平變化和ADAM12水平變^ttl來測量MMP9存在狀況和ADAM12存在狀況。在一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括通過檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中ADAM12水平評估對象中乳癌風險，并將該水平與ADAM12標準水平進行比較，其中與標準水平相比較，ADAM12水平升高表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估指導包含第二次檢測方法的醫療保健。在一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括通過檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中MMP9水平來評估對象中乳癌風險，并將該水平與標準的MMP9水平相比較，其中與標準水平相比較，升高的MMP9水平表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估用于指導包括第二次檢測方法的醫療保健。在一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括通過檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中MMP9水平和ADAM12水平來評估對象中乳癌風險，并將該水平與標準的MMP9水平和ADAM12水平相比較，其中與標準水平相比較，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估用于指導包括第二次檢測方法的醫療保健。所述第二次檢測方法包括例如乳房X射線攝影、早期乳房X射線攝影程序、定期乳房X射線攝影程序、活組織檢查程序、超聲、磁共振成像、電阻抗(T-掃描)分析、導管灌洗、ductagram、核醫學分析、熱成像、或前述方法的任意組合。在一個實施方案中，所述指導對象醫療保健的方法包括利用對象生物樣品中ADAM12存在狀況和MMP9存在狀況來評估對象中乳癌風險，其中ADAM12和MMP9同時存在表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估指導包括降低乳癌風險的醫療保健。在一個實施方案中，分別通過檢測MMP9水平變4t和ADAM12水平變4t來測量MMP9存在狀況和ADAM12存在狀況。在一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括通過檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中ADAM12水平來評估對象中乳癌風險，并將該水平與標準的ADAM12水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的ADAM12水平表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估指導醫療保健(包括降低乳癌風險)。在一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括通過檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中MMP9水平和ADAM12水平來評估對象中乳癌風險，并將該水平與標準的MMP9水平和ADAM12水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估指導醫療保健包括降低乳癌風險。在一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括通過檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中ADAM12水平和MMP9水平來評估對象中乳癌風險，并將該水平與標準的ADAM12水平和MMP9水平相比較，其中與標準水平相比較，升高的ADAM12水平和MMP9水平表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估指導醫療保健包括降低乳癌風險。降低乳癌風險可以例如施用選擇性激素受體調節劑，例如施用他莫昔芬或雷洛昔芬，或抗血管生成治療。在一個實施方案中，至少每季度、至少每兩月、至少每兩周、至少每周、至少每三天、或至少每天連續監測ADAM12存在狀況和MMP9存在狀況。在一個實施方案中，至少每季度、至少每兩月、至少每兩周、至少每周、至少每三天、或至少每天連續監測ADAM12水平。還提供了用于監測乳癌風險降低策略的治療效果的方法。在一個實施方案中，應用對象生物樣品中ADAM12存在狀況和MMP9存在狀況來評估對象中乳癌風險，其中ADAM12水平降低和/或MMP9水平降^J^示乳癌風險降低策略是有效的。可通過檢測生物樣品中ADAM12水平變化或MMP9水平變化來測量生物樣品中ADAM12存在狀況和MMP9存在狀況。在另一個實施方案中，監測乳癌風險降低策略的治療效果的方法包括以下步驟a)檢測在一定時期內定期從對象中得到的多個生物樣品中的ADAM12水平和MMP9水平；和b)測量所測ADAM12水平變化和所測MMP9水平變化。所測ADAM12水平和/或所測MMP9水平隨時間的降低表示乳癌風險降低策略是有效的。在一個實施方案中，應用根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中ADAM12水平來評估對象中乳癌風險，其中ADAM12水平降低表示乳癌風險降低策略是有效的。在另一個實施方案中，應用根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中MMP9水平來評估對象中乳癌風險，其中MMP9水平降低表示乳癌風險降低策略是有效的。在又一個實施方案中，應用根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中MMP9水平和ADAM12水平來評估對象中乳癌風險，其中MMP9水平降低和ADAM12水平降低表示乳癌風險降低策略是有效的。本發明的另一些方面包括指導對象治療的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在來自對象的生物樣品中檢測對象ADAM12的存在和MMP9的存在，其中臨床醫生評價結果，并且如果生物樣品中ADAM12和MMP9的存在呈陽性，臨床醫生指導對象進行適當的醫學治療。在一個實施方案中，檢測在一定時期內定期從對象中得到的多個生物樣品并測量生物樣品中所測ADAM12水平和所測MMP9水平的變化。如果檢測到MMP9水平和/或ADAM12水平升高，則臨床醫生指導對象進行適當的醫學治療。在一個實施方案中，所述指導對象治療的方法包括在來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中檢測對象ADAM12水平，其中臨床醫生將其與標準的ADAM12水平進行比較并評價結果，并且如果與標準水平相比較，生物樣品的ADAM12水平升高，則臨床醫生指導對象進行適當的醫學治療。適當的醫學治療可以是例如包括第二次檢測方法或乳癌降低治療的醫療保健。在一個實施方案中，所述指導對象治療的方法包括在來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中檢測對象MMP9水平，其中臨床醫生將其與標準的MMP9水平進行比較并評估結果，并且如果與標準水平相比較，生物樣品的MMP9水平升高，則臨床醫生指導對象進行適當的醫學治療。適當的醫學治療可以是例如包括第二次檢測方法或乳癌降低治療的醫療保健。在一個實施方案中，所述指導對象治療的方法包括在來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中檢測對象ADAM12水平和MMP9水平，其中臨床醫生將其與標準的ADAM12水平和MMP9水平進行比較并評估結果，并且如果與標準水平相比較，生物樣品的ADAM12水平和MMP9水平升高，則臨床醫生指導對象進行適當的醫學治療。適當的醫學治療可以是例如包括第二次檢測方法或乳癌降低治療的醫療保健。可以在對象居住的相同國家或另一個國家進行檢測，并且結果是可以得到的，例如通過網絡，或者傳送給臨床醫生。在一個實施方案中，所述第二次檢測方法包括例如乳房X射線攝影、早期乳房X射線攝影程序、定期乳房X射線攝影程序、活組織檢查程序、超聲、磁共振成像、電阻抗(T-掃描)分析、導管灌洗、ductagram、核醫學分析、熱成像、或前述方法的任意組合。在一個實施方案中，乳癌風險降低治療是利用激素受體調節劑治療或抗血管生成治療。圖1A至1B分別顯示酶鐠和Western印跡。圖1A，尿液MMP存在于處于發生乳癌風險的女性尿液中，MMP-2(明膠酶A)、MMP-9(明膠酶B)、MMP-9/NGAL復合物以及高分子量MMP類4_人尿液中可通過明膠酶鐠檢測的主要MMP類型。圖IB,ADAM12以顯著高于正常對照的水平存在于被診斷患有AH或LCIS以及處于發生乳癌風險增加的女性尿液中。ADAM12的68kDa活性形式是利用ADAM12特異性抗體通過免疫印跡分析在人尿液中檢測的主要類型。分析條帶強度并利用UN誦SCAN-ITtm(SilkScientific,Orem,UT)軟件數字轉換技術轉化成DU73。圖2A至2B顯示，與正常對照相比較，舉例說明針對ADAM12水平的AH(圖2A)和LCIS(圖2B)概率的理論曲線。經驗數據顯示為柱狀圖，其代表每組中ADAM12水平位于X-軸上每個區間內的女性百分率。Logistic回歸分析表明ADAM12水平增加與AH(1自由度上LRT=58.4，PO.0001)和LCIS(1自由度上LRT=53.3，P〈0.0001)概率增加之間非常顯著的非線性相關。約60%對照的ADAM12水平為0，而75%被一診斷患有AH的女性和80%被診斷患有LCIS的女性中ADAM12水平大于10個密度計量單位。圖3顯示利用ADAM12水平和Gail分數的組合預測AH可能性的概率曲線。通過多元Logistic回歸產生Gail風險亞組的曲線，這種回歸分析證實了ADAM12水平和Gail分數可以各自獨立地預示AH的異常診斷。對于低風險Gail5年分數<1.67%的女性，如果其ADAM12水平還<12個密度計量單位，她的AH預測概率則較低。發明詳述本發明是基于這種發現，即女性尿液中同時存在ADAM12和MMP9與非常高的乳房病變發病率有關，它們本身則表示發生浸潤性乳癌的風險增加。在對151名女性的研究中，盡管ADAM12和MMP9存在單獨地分別表示50至67%和25至40%的與發生乳癌風險增加相關的病變概率，而兩者同時存在則表示100%的概率。還已經確定，在根據Gail5年風險模型顯示乳癌風險較低的對象中，ADAM12水平升高表示乳癌風險增加。因此，本發明的實施方案提供了通過檢測來自對象的生物樣品中是否存在ADAM12以及是否存在MMP9來評估乳癌風險的方法。同時存在ADAM12和MMP9表示乳癌風險增加。在一個實施方案中，分別通過檢測MMP9水平變化與ADAM12水平變化來測量MMP9的存在狀態與ADAM12的存在狀態。因為ADAM12水平和MMP9水平也可用作乳癌風險的獨立預測因子,本發明的實施方案進一步提供通過測量對象的生物樣品中MMP9水平或ADAM12水平來評估對象中乳癌風險的方法，其中MMP9水平升高或ADAM12水平升高表示乳癌風險增加。可在一定時期內定期從對象中得到的多個生物樣品中檢測ADAM12水平和MMP9水平。本發明還提供在根據Gail5年風險模型被認為處于乳癌低風險的對象中評估乳癌風險的方法。所述方法包括檢測來自才艮據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象之生物樣品中的ADAM12水平，并將該水平與標準的ADAM12水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的ADAM12水平表示乳癌風險增加。在一個實施方案中，所述方法包括檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象之生物樣品中MMP9水平，并將該水平與標準的MMP9水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的MMP9水平表示乳癌風險增加。在一個實施方案中，所述方法包括檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險的對象之生物樣品中MMP97JC平和ADAM12水平，并將該水平與標準的MMP9水平和ADAM12水平相比較，其中與標準水平相比較，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌風險增加。乳癌風險的評估提供了鑒定需要第二次檢測方法之對象的方法，所述第二次檢測方法例如能夠檢測任何異常病變的位置或檢測乳房中癌變的存在。本文所用的"ADAM12"或"解聯蛋白金屬蛋白酶結構域12"或"ADAM金屬蛋白酶結構域12"指Genbank登記號NM_003474、NM—021641、NP_003465、NP—067673(人)的ADAM12蛋白質(SEQIDNO:l)。該術語還包括其變4、同源物、等位基因形式、突變形式、以及等價物。已知ADAM12通過syndecan介導細胞粘附和擴展并且最近已經提出整合素相互作用可作為肝癌中腫瘤4曼襲和近艮的標志物(Pabicetal.Hepatology.2003;37(5):1056-1066)。ADAM12與乳癌相關是已知的(Kveiborgetal.CancerRes.2005;65:4754畫61.;Thodetietal.FEBSLett.2005;579:5589-95.;Royetal.JBiolChem.2004;279:51323-30;WO05/071387)因為其存在于具j非癌病變的對象的尿液中(Royetal.JBiolChem.2004;279:51323-30)。然而，單獨使用ADAM12作為生物標志物僅^t惡性乳癌得到證明。本文所用的"MMP9"或"基質金屬蛋白酶9"指GenBank登記號NM_004994、NP_004985的92kDa明膠酶(EC3.4.24.35)。MMP9是分泌蛋白，由Wilhelm等(1989)首次純化然后克隆并確定其序列。Vu&Werb(1998)的MMP9評論提供了有關該蛋白酶的詳細信息和極好的參考資源。與其它分泌型MMP—起，MMP9^L釋放為無活性的前酶或包含前肽結構域的前體。隨后前酶被切割形成活性酶。本文所用的術語"目標蛋白質"或單獨或一起指ADAM12和MMP9。本文所用的"非典型增生"(Atypia,AtypicalHyperplasia)或"AH"或"非典型小葉增生"或"ALH"或"非典型導管增生"或"ADH"可互換使用。非典型增生已被證實是將來發生乳癌的主要風險因子，使得女性的相對風險增加為普通人群的5.3倍。如果對象的一級親屬中有人患有乳癌，該風險進一步增加(10倍風險)2"8。無論如何命名，小葉原位癌(LobularCarcinomaInSitu，LCIS)還被認為AX險增加的標志物而不是前期病變(precursorlesion)29，3°。然而，現在漸漸認識到LCIS可包括一系列病癥，這些病癥的小亞類比如多形性變體實際上可代表前期病變31，32。根據參與監測、流行病學和最終結果(SEER)項目的9個基于幹沐的癌癥登記，從1978年至1998年絕經后女性中LCIS診斷率增加4倍29。似乎非典型增生(AH)的診斷還可能正在增加。非典型增生的比率難于追蹤，因為該診斷的報告不是腫瘤登記中所必需的，并且該診斷在SEER數據中沒有記錄。在20世紀80年代和90年代，幾個大型研究證明AH構成所有良性乳腺活組織檢查的少于5%33，34。在近來的大型病史事件中，非典型增生代表所有良性乳腺活組織檢查的4%35。更近來的非典型增生比率報告達到所有良性乳腺活組織檢查的7%36。在奧博恩山醫院跟蹤活組織檢查結果顯示從1997年至2004年ADH加倍并且LCIS增加3倍(表A)。這最可能至少部分地是由于乳房X射線攝影篩查增加，因為ADH最經常隨著異常乳房X射線攝影而被鑒定37。應當注意的是，在經歷預防性乳房切除術、處于極高的乳癌遺傳風險的女性乳房樣本的最近前瞻性研究中，57%的所述女性中發現這些高風險病變38。在這些當中，37%是非典型小葉增生(ALH),39%是非典型導管增生(ADH)、以及25%是LCIS38。非典型增生最經常是在為異常乳房X射線攝影或物理發現所做的乳腺活組織檢查中被診斷，而且還可以被乳頭吸取、隨機乳暈旁細針抽取和導管灌洗所證實8。表A.活組織檢查結果的變化趨勢ADH/ALHLCISDCIS浸潤性總活組織檢查1997l月至6月7(3.3%)2(0.9%)16(7.6%)40(18.90/o)2112004l月至6月20(5,7%)12(3.4%)20(5.7%)55(1.5.60/o)352本文所用的"生物樣品"指從對象(優選人類對象)中得到的生物材料樣品，包括組織、組織樣品、細胞樣品，例如組織活組織檢查比如抽吸活組織檢查、刷拭活組織檢查、表面活組織檢查、針吸活組織檢查、鉆取活組織檢查、切除活組織檢查、開放性活組織檢查、切口活組織檢查或內窺鏡活組織檢查，以及腫瘤樣品。生物樣品還可以是生物流體樣品。在一個實施方案中，所述生物樣品是尿液。然而，還可以使用血液、血清、血漿、唾液、腦脊液、乳頭吸出物、以及細胞裂解物上清。本發明的實施方案還包括在本發明的方法中使用生物樣品的分離物。本文所用的生物樣品的"分離物"(例如組織活肺瘤樣品的分離物)指從樣品中隔離、衍生、提取、純化或分離出來的材料或組分(例如生物材料或組分)，并且優選地基本不含有不期望的組分和/或與生物樣品相關的雜質或污染物。本文所用的"組織樣品"指從對象(例如人類對象)的完整組織中得到或取出的組織部分(portion)、片(piece)、局部(part)、片段(segment)或塊(fraction),在一個實施方案中，所述組織樣品是乳房組織。本文所用的"對象"或"患者"通常指哺乳動物。在一個實施方案中，處理生物樣品從而阻止蛋白質或mRNA的降解，例如ADAM12蛋白、ADAM12mRNA、MMP9蛋白、MMP9mRNA。抑制或阻止降解的方法包括但不限于利用蛋白酶或RNA酶抑制劑處理生物樣品，冷凍生物樣品，或將生物樣品放置在冰上。優選地，在分析之前，一直將生物樣品或分離物放置在防止蛋白質或RNA(例如ADAM12蛋白、ADAM12mRNA、MMP9蛋白質、MMP9mRNA)降解的條件下。本文所用的術語"乳癌風險增加"用于指不同于一般人群的乳癌風險增加。乳癌風險增加的人需要監測乳癌的發生。乳癌風險增加的人需要監測乳癌風險標志物的連續存在、新的乳癌風險標志物的產生或發現存在乳癌風險標志物。乳癌風險標志物包括本發明的蛋白質、風險的遺傳標志物(包括但不限于BRCA1和BRCA2)、乳癌家族史、吸煙習慣或既往吸煙習慣、飲酒和技術人員已知的其它乳癌風險標志物。本文所用的"連續監測"是否存在MMP9或ADAM12、或"連續監測"ADAM12水平是指不止一次地例如每季度、每兩月、每月、每兩周、每周、每三天或每天檢測樣品中是否存在MMP9或ADAM12,或測量樣品中ADAM12水平。連續監測包括在技術人員認為必要的規律性間隔內定期測量。本文所用的術語"標準水平"指從被認為未患癌癥的"正常"或"健康"對象中得到的一個或多個生物樣品中測定的ADAM12或MMP9的基線量。一旦為標準群體很好地建立了水平，來自試驗生物樣品中的結果可直接與已知的標準水平進行比較。例如，可至少從一個對象中得到基線并且優選地從對象的平均數(例如n=2至100或更多)得到基線，其中所述對象沒有既往癌癥史。本文所用的術語"標準水平"還旨在包括根據進行乳癌風險監測的對象測定的ADAM12或MMP9的基線量。例如，不必直接將對象樣品中ADAM12或MMP9的量與從正常對象中得到的標準水平進行比較，而是可以測量從對象中得到的多個生物樣品中存在的ADAM12或MMP9水平在一定時期內的變化，例如用于比較的標準水平是從對象得到的第一個生物樣品中所測的ADAM12或MMP9。在一定時期內所測ADAM12或MMP9水平升高表示乳癌風險增加。作為替代，當測試乳癌風險降低策略的治療效果時，所測ADAM12水平和/或所測MMP9水平隨時間的降低表示乳癌風險降低策略是有效的。本文所用的"一定時期"旨在包括幾天、幾周、幾月或甚至幾年的時期。一定時期內從對象中得到的多個生物樣品，即在不同時間間隔內定期從對象得到生物樣品，可以任何間隔從對象得到生物樣品。例如，可數周、數月或數年地每天得到生物樣品。作為替代，可每周一次、每周兩次、每周三次、每周四次、每周五次、或每周六次在數周、數月或數年的時期內得到生物樣品。在一個實施方案中，在3個月的時期內每周一次得到生物樣品。在一個實施方案中，在數月或數年的時期內每月一次得到生物樣品。為了進行比較，待測生物樣品中ADAM12或MMP9水平與用于基線標準水平測定的類型相同(從相同生物源中得到)。例如，在本發明的一個實施方案中，通過測量尿液中ADAM12蛋白水平來測量ADAM12水平。因此，通過測量正常、健康對象尿液中ADAM12蛋白水平來測量基線標準水平。在另一個實施方案中，通過測量組織樣品中ADAM12mRNA轉錄物的量來測量ADAM12水平，并因此通過測量正常、健^象尿液中ADAM12mRNA轉錄物的量來測量基線標準水平。本文所用的相對于標準水平所測ADAM12或MMP9水平的"升高"意指，相對于標準ADAM12或MMP9水平，對象生物樣品中ADAM12或MMP9的量或濃度更大。例如，相對于標準水平所測水平的升高可以是任何可檢測的統計學顯著的升高。這樣的升高可包括但不限于相對于標準約1%、約10%、約20%、約40%、約80%、約2倍、約4倍、約8倍、約20倍、或約100倍升高，或更多。本文所用的術語"約"指lt值加或減所述數值的10%。ADAM12和MMP9的檢測ADAM12和MMP9的檢測(包括測量如本文所述的表達水平)可利用本領域技術人員公知的任何方法完成，包括但不限于亂歐電泳、色鐠技術、免疫印跡分析、免疫組織化學、基于酶的免疫分析、質鐠、高效液相色鐠、表面等離子體共振、光學生物傳感器、和/或抗體和蛋白質陣列(Ausubel,F.A.etal"eds"1990,CurrentProtocolsinMolecularBiology-GreenePublishingandWiley隱Interscience,NewYork,USA,Chapter10;MyszkaandRich2000，Pharm.Sci.Technol.Today3:310-317)。在一個實施方案中，應用抗體或抗體等價物來檢測生物樣品中的ADAM12和MMP9蛋白。在另一些實施方案中，使用其它的方法檢測ADAM12和MMP9表達，比如通過分析mRNA轉錄物來測量表達。可以優選測量mRNA，例如當生物樣品是腫瘤或組織樣品時。在一個實施方案中，檢測ADAM12的方法不同于檢測MMP9的方法。例如，MMP9可通過酶鐠法檢測，而ADAM12可通過Western印跡檢測。在一個實施方案中，本發明的方法可以與檢測對象生物樣品中其它分析物的方法同時進行，例如其它mRNA或蛋白質或小分子，例如其它的與癌癥風險相關的標志物，例如與乳癌風險增加相關的標志物，例如與癌癥相關的標志物。檢測mRNA水平的方法是本領域技術人員熟知的。例如，通過Northern印跡可實現RNA轉錄物的檢測，其中將RNA制備物進行變性瓊脂糖凝膠電泳，并且轉移到適當的支持物上，比如活化纖維素、硝化纖維素或玻璃膜或尼龍膜。然后將標記(例如放射性標記)cDNA或RNA與所述制備物雜交、沖洗并利用比如放射自顯影進行分析。基于目標mRNA的已知序列(例如ADAM12，例如MMP9)產生雜交探針的方法是技術人員公知的。利用已知擴增方法可進一步實現RNA轉錄物的檢測。例如，在本發明的范圍內將mRNA反轉錄成cDNA之后進行聚合酶鏈式反應(RT-PCR);或如美國專利No.5,322,770所述在兩個步驟中利用單一酶，或將mRNA反轉錄成cDNA之后進行R.L.Marshall等人(PCRMethodsandApplications4:80-84(1994))所述的對稱缺口脂肪酶鏈式反應(RT-AGLCR)。一種檢測ADAM12mRNA轉錄物的適當方法描述于參考文獻Pabic等人Hepatology,37(5):1056-1066,2003中，在此以其整體通過參考并入本文。基于已知的目標基因之核,列產生擴增引物的方法是技術人員熟知的。在此可使用的其它已知的擴增方法包括但不限于描述于PNASUSA87:1874-1878(1990)中以及描述于Nature350(No.6313):91-92(1991)中的所謂"NASBA"或"3SR"技術、描述于公開的歐洲專利申請(EPA)No.4544610中的Q-P擴增、描述于GT.Walker等人Clin.Chem.42:9-13(1996)和歐洲專利申請No.684315中的鏈置換擴增法、以及PCT公開WO9322461中所述的乾介導的擴增。還可使用原位雜交顯示，其中放射性標記的反義RNA探針與活組織檢查樣品的薄切片雜交、清洗、用RNA酶切割并暴露于感光乳劑中用于放射自顯影。可用蘇木素對樣品進行染色以確定樣品的組織學組成，并利用適當的濾光器進行暗場成像顯示已顯影的乳劑。還可使用非放射性標記比如洋地黃毒普。作為替代，可在DNA陣列、芯片或微陣列上檢測mRNA表達。與目標基因(例如ADAM12或MMP9)對應的寡核苷酸被固定在芯片上，然后所述芯片與從對象所得試驗樣品的標記核酸進行雜交。利用含有目標基因(例如ADAM12或MMP9)之轉錄物的樣品得到陽性雜交信號。制備DNA陣列的方法及其應用是本領域熟知的(見例如美國專利Nos:6，618，6796、6，379，897、6,664,377、6,451,536、548,257;U.S.20030157485和Schenaetal.1995Science20:467-470;Gerholdetal.1999TrendsinBiochem.Sci.24,168-173;和Lennonetal.2000DrugdiscoveryToday5:59-65,在此以其整體通過參考并入本文)。還可進行基因表達系列分析(SAGE)(見例如美國專利申請20030215858)。為了監測mRNA水平，例如，從待檢測生物樣品中提取mRNA并進行反轉錄，產生熒光標記的cDNA探針。然后用標記cDNA探針探測能與目標cDNA(例如ADAM12或MMP9)雜交的微陣列，掃描微陣列并測量熒光強度。該強度與雜交強度和表達水平相關。當生物樣品是流體樣品比如血液或尿液時，還可檢測蛋白質(例如ADAM12或MMP9)，包括測量蛋白質水平，包括測量蛋白質活性。在一個實施方案中，通過將生物樣品與基于抗體的結合結構相接觸來檢測蛋白質例如ADAM12或MMP9，所逸基于抗體的結合結構與該蛋白質或該蛋白質的片段特異性結合。然后檢測抗體-蛋白質復合物的形成，并可以測量這種形成以指示蛋白質水平。術語"基于抗體的結合結構"或"抗體"包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性決定簇，例如含有與目標蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)特異性結合的抗原結合位點的分子。術語"基于抗體的結合結構"意指包括例如任何亞型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的所有抗體并包括還與目標蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)特異性反應的其片段。可利用常規技術切割抗體片段。因此，該術語包括抗體分子的能與某蛋白質選擇性反應的蛋白水解切割或重組制備部分的片段。這種蛋白水解和/或重組片段的非限定性實例包括Fab、F(ab，)2、Fab，、Fv、dAb以及含有通過連接肽連接的VL以及VH域的單鏈抗體(scFv)。所述scFv可以共價鍵或非共價鍵相連接形成具有兩個或多個結合位點的抗體。因此，"基于抗體的結合結構"包括多克隆、單克隆、或其它純化的抗體制備物以及重組抗體。術語"基于抗體的結合結構"還包括人源化抗體、雙特異性抗體、以及具有至少一個來源于抗體分子的抗原結合決定簇的嵌合分子。在一個優選實施方案中，所述基于抗體的結合結構被可檢測地標記。本文所用的"標記抗體"包括通過可檢測的方法進行標記的抗體并且包括但不限于被用酶、放射性、熒光、以及化學發光標記的抗體。還可利用可檢測標簽標記，比如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5或HIS。在利用基于抗體的結合結構檢測目標蛋白質(例如ADAM12,例如MMP9)的本發明方法中，生物樣品中存在的目標蛋白質水平與可檢測標記之抗體發出的信號強度相關。在一個實施方案中，通過將抗體與酶相連接對基于抗體的結合結構進行可檢測標記。當暴露于其底物時，所述酶將依次與底物反應，以產生可被例如分光光度、熒光或可視方法檢測的化學結構。可用于可檢測標記本發明抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-類固醇異構酶、酵母醇脫氳酶、a-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、門冬跣胺酶、葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶以及乙酰膽喊酯酶。化學發光是可用于檢測基于抗體的結合結構的另一種方法。還可利用多種其他免疫分析中的任一種進行檢測。例如，通it^:射性標記抗體，可通過利用放射性免疫分析來險測抗體。可通過利用諸如y-計數器或閃爍計數器或放射自顯影等方法ilb險測放射性同位素。對于本發明目的特別有用的同位素是311、mI、35S、"C，并且優選1251。還可以利用熒光化合物來標記抗體。當熒光標記的抗體^L^露于適當波長的光時，可利用熒光檢測其存在。其中最常用的熒光標記化合物是CYE染料、異硫氰酸熒光素、羅丹明、phycoerytherin、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰&甲醛以及熒光胺。還可利用熒光發射金屬比如152Eu或其它鑭系金屬可檢測地標記抗體。這些金屬可利用比如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金屬螯合基團與抗體結合。還可通過將抗體與化學發光化合物偶聯可檢測標記抗體。然后在化學反應期間通過檢測是否存在發光的來測定化學發光-抗體的存在。特別有用的化學發光標記化合物的實例是魯米諾、勞光素、異魯米諾、theromatic吖咬絲酯、咪唑、吖咬鎗鹽以及草酸酯。如上所述，可通過免疫分析比如酶^JL疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)、Western印跡、或免疫組化來檢測本發明的蛋白質(例如ADAM12,例如MMP9)，下面更詳細地描述各種免疫分析法。通常更優選可非常快速地進行檢測的免疫分析比如ELISA或RIA。還可使用抗體陣列或蛋白質芯片，見例如美國專利申請No:20030013208A1、20020155493Al、20030017515以及美國專利No:6,329,209、6,365,418，，在此以其整體作為參考并入本文。免疫分析"放射免疫分析"是利用標記(例如放射性標記)形式的抗原檢測或測量抗原濃度的技術。抗原的放射性標記的實例包括311、"C、和1251。通過將生物樣品中抗原與標記(例如it射性標記)抗原竟爭性地與抗原之抗體相結合來測量生物樣品中抗原(例如ADAM12，例如MMP9)的濃度。為了保證標記抗原與未標記抗原之間竟爭性結合，標記抗原以足夠飽和抗體結合位點的濃度存在。樣品中抗原濃度越高，結合抗體的標記抗原的濃狄低。在放射免疫分析中，為了測定與抗體結合的標記抗原的濃度，必須將抗原-抗體復合物與游離抗原分開。將抗原-抗體復合物與游離抗原分開的一種方法是將抗原-抗體復合物與抗亞型抗血清沉淀。將抗原-抗體復合物與游離抗原分開的另一種方法是將抗原-抗體復合物與福爾馬林殺死的金黃色葡萄球菌(S.aureus)進行沉淀。將抗原-抗體復合物與游離抗原分開的又一種方法是當抗體與瓊脂糖微珠、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔、或微量滴定孔(例如共價鍵)結合時，進行"固相放射性免疫標記"。將與抗體結合的標記抗原濃度與基于樣品中已知濃度的抗原標準曲線相比較，可測定生物樣品中抗原的濃度。"免疫放射分析"(IRMA)是抗體試劑被放射性標記的免疫分析。IRMA需要產生多價抗原綴合物，這可以通過比如與例如兔血清白蛋白(RSA)等蛋白質相綴合的技術。多價抗原綴合物必須每分子中具有至少兩個抗原殘基并且所述抗原殘基必須分開有足夠的距離以允許至少兩個抗體與抗原結合。例如，在IRMA中，多價抗原綴合物可附著到固體表面比如塑料球上。未標記的"樣品"抗原與放射性標記的抗原之抗體添加到含有多價抗原綴合物包被球的試管中。樣品中的抗原與多價抗原綴合物竟爭抗原抗體結合位點。孵育適當的時間后，通過清洗除去未結合的反應物并測定固相中放射活性的量。結合的放射活性抗體的量與樣品中抗原濃度呈反比。最常用的酶免疫分析是"酶聯免疫吸附測定(ELISA)"。ELISA是利用標記(例如酶聯接的)形式的抗體險測和測量抗原濃度的技術。具有不同形式的ELISA,這是本領域技術人員熟知的。本領域中公知的ELISA標準技術描述于"MethodsinImmunodiagnosis"第二版，RoseandBigazzi,eds.JohnWiley&Sons,1980、Campbelletal""MethodsandImmunology",W.A.Benjamin,Inc.,1964、以及Oellerich,M.1984，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,22:895-904中。在"三明治ELISA"中，抗體(例如抗ADAM12，例如抗MMP9)與固相(即微滴定板)連接，并暴露于含有抗原(例如ADAM12，例如MMP9)的生物樣品中。然后清洗固相除去未結合的抗原。然后，如果存在的話，(例如酶連接的)標記抗體與結合抗原相結合，從而形成抗體-抗原-抗體三明治夾心。可與抗體連接的酶的實例是堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光素酶、脲酶以及β-半乳糖苷酶。酶聯抗體與底物反應產生可被測量的有色反應產物。在"竟爭性ELISA，，中，用含有抗原(例如ADAM12，例如MMP9)的樣品孵育抗體。然后將抗原-抗體混合物與包被有抗原(例如ADAM12,例如MMP9)的固相例如微滴定;M目接觸。樣品中存在的抗原越多，可與固相結合的游離抗體將越少。然后將標記的(例如酶聯的)笫二抗體添加到固相中，以測定與固相結合的第一抗體的量。在"免疫組化分析"中，將組織暴露于特異性針對待分析蛋白質的抗體，以檢測組織切片的特異性蛋白質。然后利用M多種方法觀察抗體測定所存在的蛋白質及其量。用于觀察抗體的方法實例是例如通過酶聯的抗體，例如熒光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、或P-半乳糖苷酶或化學法例如DAB/底物顯色。基于目前的公開內容，根據操作者的愛好，可使用其它技術檢測本發明的蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)。一種這樣的技術是Western印跡(Towbinetat.，Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))，其中在轉移到固體支持物比如硝化纖維素濾膜上之前經SDS-PAGE凝膠電泳適當處理的樣品。然后，當存在與蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)之量相對應的可檢測標記的信號強度時，可檢測標記的抗體(例如抗ADAM12，例如MMP9)的水平。水平可被定量:例如通過密度計量學質鐠此外，可利用質鐠比如MALDI/TOF(飛行時間)、SELDI/TOF、液相色譜-質譜(LC-MS)、氣相色鐠-質譜(GC-MS)、高效液相色鐠-質譜(HPLC-MS)、毛細管電泳-質鐠、核磁共振質鐠、或串聯質鐠(例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等)來檢測蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)。見例如美國專利申請Nos:2003019卯01、20030134304、20030077616，其通過引用并入本文。質譜法是本領域熟知的并且已經用于定量和/或鑒定生物分子比如蛋白質(見例如Lietal.(2000)Tibtech18:151-160、Rowleyetal.(2000)Methods20:383-397、以及KusterandMann(1998)Curr.Opin.StructuralBiol.8:393-400)。而且，質鐠技術已經發展為允許至少部分對分離蛋白質進行從頭測序。Chaitetal.，Science262:89-92(1993);Keoughetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:7131-6(1999);reviewedinBergman,EXS88:133-44(2000)。在某些實施方案中，使用氣相離子分光光度計。在另一些實施方案中，使用激光解pA/電離質鐠分析樣品。現代的激光解pA/電離質譜("LDI-MS)可以兩種主要變化形式進行基質輔助激光解吸l/電離("MALDI")質鐠和表面增強激光解吸/電離("SELDI")。在MALDI中，分析物與含有基質的溶液混合，并將一滴液體放置于襯底的表面上。然后將基質溶液與生物分子共結晶。將所述襯底插入到質譜儀中。激光能量直接傳到底物表面，并在那里吸收和電離生物分子而不使生物分子顯著地片段化。然而，作為分析工具，MALDI具有局限性。它不能提供分級分離樣品的手段，并且基質物質可干擾檢測，尤其是低分子量分析物的檢測。見例如美國專利No.5，118，937(Hillenkampetal.)和美國專利No.5,045,694(Beavis&Chait)。在SELDI中，底物表面被修飾使得其在解吸附過程中是主動參與者。在一個變化方案中，表面被吸附劑和/或與目標蛋白質選擇性結合的捕獲試劑衍生化。在另一個變化方案中，利用當被激光沖擊時不解吸的能量吸收分子將表面衍生化。在另一個變化方案中，利用與目標蛋白質結合并含有施用激光時斷裂的光解鍵的分子將表面衍生化。在每個這樣的方法中，衍生化劑通常位于施加樣品的襯底表面的特殊位置上。見例如美國專利No.5,719,060和WO98/59361。例如可利用SELDI親和表面捕獲分析物以及將含有基質的液體添加到被捕獲分析物中以提供能量吸收物質而將這兩種方法相組合。對于有關質鐠的更多信息,見例如PrinciplesofInstrumentalAnalysis,3rdedition.,Skoog,SaundersCollegePublishing,Philadelphia,1985和Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology,4.sup.thed.Vol.15(JohnWiley&Sons,NewYork1995)，pp.1071-1094。檢測標志物或其它物質的存在一般包括檢測信號強度。這依進而反映與底物結合的多肽的量和性質。例如，在某些實施方案中，可比較第一樣品和第二樣品的鐠中的峰值信號強度(例如通過觀察、計算機分析等)以測定特定生物分子的相對量。軟件程序比如BiomarkerWizard程序(CiphergenBiosystems，Inc.,Fremont,Calif.)可用于幫助分析質鐠。所質譜儀及其技術是本領域技術人員熟知的。本領域任何技術人員了解質普儀的任何組件例如解吸附源、質量分析器、檢測等，并且不同的樣品制備物可與在此所述的或本領域公知的其它適當組件或制備物相組合。例如，在一些實施方案中，對照樣品可含有重原子例如13C,從而允許試驗樣品與已知的對照樣品在同一個質鐠操作中相混合。在一個實施方案中，使用激光解吸飛行時間(TOF)質鐠儀。在激光解吸鐠儀中，帶有結合標志物的底物被引入進口系統中。所述標志物被解吸附并被電離源的激光電離為氣相。利用離子光學系統收集產生的離子，然后在飛行時間質量分析器中，離子被短時間高電壓場加速并漂移到高真空室中。在所述高真空室的遠端，被加速的離子在不同時間撞擊敏感探測器表面。因為飛行時間是離子質量的函數，所以可應用離子形成和離子檢測器轟擊之間的流逝時間來確定是否存在特定質荷比的分子。在一些實施方案中，利用可編程數字計算機執行數學算法來部分地測定第一或第二樣品中存在的一種或多種生物分子的相對量。所述算法鑒定第一個質鐠和第二個質鐠中的至少一個峰值。然后該算法比M譜中第一個質譜的峰值信號強度與第二個質譜的峰值信號強度。相對信號強度指示第一個樣品和第二個樣品中存在的生物分子的量。含有已知量生物分子的標準可作為第二個樣品進行分析以提供更好地定量第一個樣品中存在的生物分子的量。在某些實施方案中，還可測定第一個樣品和第二個樣品中生物分子的身份。在一個實施方案中，通過MALDI-TOF質譜檢測本發明的蛋白質例如ADAM12，、如MMP9。其它測定還可利用其它生物學測定例如測量活性來測量蛋白質(例如ADAM12,例如MMP9)的水平，這包括但不限于酶鐠法。酶鐠法是本領域技術人員熟知的并被描述于Heusenetal.，Anal.Biochem.，(1980)102:196-202、Wilsonetal.,JournalofUrology,(1993)149:653-658、Hernonetal"J.Biol.Chem.(1986)261:2814-2828，Braunhutetal"J.Biol.Chem.(1994)269:13472-13479、Mosesetal.,CancerResearch58，1395-1399，April1，1998;U.S.Pat.Appl.SerialNo.08/639,373以及美國專利No.6，037，138and6,811,995中，;此以其整體通過引用并入本文。檢測生物樣品中ADAM12和MMP9的方法還包括使用表面等離子體共振(SPR)。在該分析中，結合ADAM12或MMP9的抗體不必被可檢測地標記并且可不需要結合特定多肽的第二抗體而進行使用。例如，ADAM12或MMP9的特異抗體可與適當的固體襯底結合然后暴露于樣品。可利用表面等離子體共振現f^r測ADAM12或MMP9與抗體在固體襯底上的結合,這可在通itil:當儀器例如Biacorei殳備(BiacoreInternationalAB,Rapsgatan，瑞典)定性或定量地檢測結合時導致表面等離子體共振強度的變化。還可設想將光學生物傳感器用于本發明的實施方案中.所述SPR生物傳感技術已經與MALDI-TOF質鐠相組合用于生物分子的解吸附和鑒定。在基于芯片的BIA-MS方法中，配體(例如ADAM12或MMP9抗體)被共價固定在芯片的表面上。樣品中的蛋白質通過芯片，并且相關物質被配體結合。清洗步驟之后，通過MALDI-TOF質鐠分析被洗脫的蛋白質。所述系統可以是全自動的過程并且適用于檢測和表征復雜的生物流體中存在的蛋白質以及低至亞飛摩爾水平的細胞提取物。抗體本發明中所用的抗體可從商業來源得到。抗-MMP抗體可從OncogeneSciences,Cambridge,Mass購得。或者，可制備抗全長多狀或抗部分多肽(例如ADAM12，例如MMP9)的抗體。制備ADAM12抗體的方法公開于PCT申請WO97/40072或美國專利申請No.2002/0182702中，其通過引用并入本文。可利用制備抗體的標準方法制備本發明中所用的抗體，例如通過單克隆抗體制備技術(Campbell,A.M.,MonoclonalAntibodiesTechnology:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,theNetherlands(1984)、St.Grothetal"J.Immunology,(19卯)35:1-21以及Kozboretal"ImmunologyToday(1983)4:72)。還可通過本領域中熟知的方法利用蛋白質的抗原部分篩選抗體庫比如噬菌體展示庫而容易地得到抗體。例如，美國專利5,702,892(U.S.A.Health&HumanServices)和WO01/18058(NovopharmBiotechInc.)公開了噬菌體展示庫以及制備抗體結合結構域片段的選擇方法。個人歷史參數可使用測量對象發生乳癌風險的另外因素。具體而言，可檢查多種因素包括年齡、種族特性、生育史、月經史、口月腿孕藥的使用、體重指數、飲酒史、吸煙史、運動史、飲食以提高本方法的預測準確度。親屬癌癥史以及所述親屬被診斷患有癌癥的年齡也是重要的個人歷史M。分析中納入個人歷史^lt以及是否存在MMP9和ADAM12的標志物數據預測乳癌是以下述理解作為基礎幾乎所有癌癥來自于個體基因與基因作用環境之間的動態相互作用。在一個實施方案中，對象的年齡包括在乳癌風險的評估中。監測乳癌風險的方法
技術領域：
：本發明的實施方案還提供了指導對象醫療保健的方法。在一個實施方案中，所述方法包括從對象得到生物樣品并檢測生物樣品中是否存在ADAM12以及是否存在MMP9，生物樣品中同時存在ADAM12和MMP9的檢測用于指導包括第二次檢測方法的醫療保健。在一個實施方案中，分別通過檢測MMP9水平變化與ADAM12水平變化來測量MMP9的存在狀態與ADAM12的存在狀態。在一個實施方案中，來自對象的生物樣品中ADAM12的存在狀態與MMP9的存在狀態各自獨立地用于評估對象中乳癌風險。在另一個實施方案中，所述指導醫療保健的方法包括通過檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中ADAM12水平來評估對象的乳癌風險，并將該水平與標準的ADAM12水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的ADAM12水平表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估用于指導包括第二次檢測方法的醫療保健。作為替代，當升高的水平表明乳癌風險增加時，可測量MMP9水平或同時測量MMP9和ADAM12。在一個實施方案中，在乳癌風險的評估之上進行第二次檢測步驟。第二次檢測步驟包括但不限于檢測或診斷乳癌的方法以及檢測對象中病變例如非典型增生例如LCIS的方法。可使用任何多種其它檢測或診斷步驟，比如乳房X射線攝影、超聲、MRI、乳房電阻抗(T-掃描)分析、熱成像或任何其它成像技術、活組織檢查、臨泉險查、ductogram、導管灌洗、核醫學分析比如乳房閃爍掃描、乳房熱成l象或其它方法。在一個實施方案中，使用國際申請WO05/071387"Methodsfordiagnosisandprognosisofcancersofepithelialorigin"中的方法。在一個實施方案中，在評估乳癌風險增加時將檢測方案用于指導對象，例如常規的乳房X射線攝影方案，例如每年一次，或每六個月、四個月、三個月或兩個月一次；早期乳房X射線攝影方案，例如在25、30、35歲開始進行的乳房X射線攝影測試；一次或多次活組織檢查程序，例如在40歲開始的常規活組織檢查方案。許多遺傳標志物與乳癌相關。這些標志物的實例包括癌胚抗原(CEA)(Mughaletal"249JAMA1881(1983))、MUC-1(Frische和Liu，22J.Clin.Ligand320(2000))、HER國2/neu(Harisetal"15ProcAmSocClinOncology-.A96(1996))、uPA、PAI國1、LPA、LPC、RAK以及BRCA(EstevaandFritsche,SerumandTissueMarkersforBreastCancer,inBREASTCANCER,286-308(2001))。在一個實施方案中，BRCA1、BRCA2或其它乳癌遺傳標志物或乳癌標志物的任何組合的基因型分析可用于進一步監測對象中乳癌風險。此外，可4艮據個體對象中ADAM12和MMP9狀態來監測乳癌風險。例如，對于ADAM12狀態是陰性而MMP9狀態是陽性的對象，可監測對象ADAM12狀態和MMP9狀態隨時間的變化。預防乳癌的方法
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：本發明的實施方案還提供了指導對象醫療保健的方法，其中指導所述對象進行醫療保健以降低乳癌風險。例如，檢測來自對象的生物樣品中同時存在ADAM12和MMP9來指導醫療保健以降低乳癌風險。在一個實施方案中，來自對象的生物樣品中ADAM12的存在狀態與MMP9的存在狀態各自獨立地用于評估對象中乳癌風險。在一個實施方案中，使用來自對象的生物樣品中ADAM12的存在狀態與MMP9的存在狀態來評估對象中乳癌風險，其中當評估對象的乳癌風險增加時，指導用于降低乳癌風險的醫療保健。在一個實施方案中，通過檢測MMP9水平變4匕與ADAM127JC平變化來測量MMP9的存在狀態與ADAM12的存在狀態。在一個實施方案中，檢測來自根據Gail5年風險模型處于乳癌低風險之對象的生物樣品中ADAM12水平并將該水平與標準的ADAM12水平進行比較，其中與標準水平相比較，升高的ADAM12水平表示乳癌風險增加，并且其中風險增加的評估用于指導包括降低乳癌風險的醫療保健。作為替代，當升高的水平表明乳癌風險增加時，可測量MMP9水平或同時測量MMP9和ADAM12。乳癌風險降低包括防止性的預防性治療。例如，指示或施用防止性的預防性治療以降低乳癌相關病癥發生或逸艮的概率。這些治療有時是治療性的，有時則延遲、減輕或停止乳癌的逸艮。任何已知的用于減輕或預防乳癌發生的防止性或治療性處理均可被執行和/或施用，其包括選擇性激素受體調節劑，例如選擇性雌激素受體調節劑(SERM)比如他莫昔芬、雷洛昔芬和托瑞米芬；預防激素產生的組合物，例如預防腎上腺中產生雌激素的aramotase抑制劑，比如依西美坦、來曲唑、阿那曲哇、戈舍瑞林、以及曱地孕酮；其它的激素治療例如醋酸戈舍瑞林和氟維司群(fulvestrant);生物反應修飾物比如抗體例如曲妥珠單抗(herceptin/HER2);手術例如乳房腫瘤切除術和乳房切除術；延遲或停止轉移的藥物，例如帕米膦酸鈉；以及替^R/補充醫學例如針術、針壓法、灸術、氣功、靈氣、印度藥草學、維生素、礦物質、以及草藥例如黃芪根、牛蒡根、大蒜、綠茶、以及甘草根。A.他莫西芬他莫西芬(NOLVADEX)是非甾體類抗雌激素，以杼檬酸他莫西芬提供。可購得10mg或20mg片劑的杵檬酸他莫西芬片。每片10mg的片劑含有15.2mg檸檬酸他莫西芬，相當于10mg他莫西芬。無活性的成分包括羧甲基纖維素鈣、硬脂酸鎂、甘露醇和淀粉。檸檬酸他莫西芬是三苯乙烯衍生物的反式異構體。化學名是(Z)2-[4-(l，2-聯苯基-l-丁烯基)苯緣-N，N-二甲基乙胺2-羥基-l，2,3丙三羧酸鹽(l:l)。檸檬酸他莫西芬的分子量是563.62，pKa，是8.85，37℃時在水中的平衡溶解度0.5mg/mL，37℃時在0.02NHC1中的平衡溶解度0.2mg/mL。在動物試驗系統中，檸檬酸他莫西芬具有強效的抗雌激素性質。雖然確切的作用機制未知，抗雌激素作用可能與其能在靶組織比如乳房中與雌激素竟爭結合位點有關。他莫西芬抑制由二甲基苯并蒽(DMBA)誘導的大鼠乳房癌并在大鼠中引起DMBA誘導的腫瘤原位衰退。在該模型中，他莫西芬似乎通過結合雌激素受體發揮其抗腫瘤作用。口服后，他莫西芬被廣泛地代謝。接受20mg放射性標記(TIC)他莫西芬的女性研究中已經顯示約65。/。的施用劑量在2周內從身體排泄掉(主要通過糞便途徑)。N-去曱基他莫西芬是在患者血漿中發現的主要代謝物。N-去甲基他莫西芬的生物活性似乎與他莫西芬相似。4-羥基他莫西芬以及他莫西芬的側鏈伯醇衍生物已被確認為血漿中的次要代謝物。單次口服20mg劑量il后，月艮用后大約5小時出現40ng/mL(范圍35至45ng/mL)的平均峰值血漿濃度。他莫西芬的血漿濃度的下降是雙相的，終末消除半衰期是約5至7天。N-去曱基他莫西芬的平均峰值血漿濃度15ng/mL(范圍10至20ng/mL)。患者每日兩次長期施用10mg他莫西芬3個月導致他莫西芬的平均穩態血漿濃度為120ng/mL(范圍67至183ng/mL)以及N-去甲基他莫西芬的平均穩態血漿濃度為336ng/mL(范圍148至654ng/mL)。每日一次施用20mg他莫西芬3個月，他莫西芬和N-去甲基他莫西芬的平均穩態血漿濃度分別為122ng/mL(范圍71至183ng/mL)和353ng/mL(范圍152至706ng/mL)。開始治療后，他莫西芬在約4周內達到穩態濃度并且N-去甲基他莫西芬在約8周內達到穩態濃度，提示該代謝物的半衰期約14天。對于乳癌患者，推薦的日劑量為20至40ma。大于20mg/日的劑量應當以分開的劑量服用(早晨和晚上)。然而，預防性的劑量可以更低。B.雷洛昔芬鹽酸雷洛昔芬(EVISTAtm)是屬于苯并瘞吩類化合物的選擇性雌激素受體調節劑(SERM)。其化學名稱是甲酮，[6-羥基-2-(4-羥苯基)苯并[b噻吩-3-基-[4-[2-(l-哌啶基)乙氧基苯基-鹽酸鹽。鹽酸雷洛昔芬的經驗式是C28H27N04S.HCl，對應分子量510.05。鹽酸雷洛昔芬是在水中極微溶的近白色至淺黃色固體。鹽酸雷洛昔芬被提供為用于口服施用的片劑劑型。每片含有60mg鹽酸雷洛昔芬，其摩爾當量是55.71mg游離堿。無活性成分包括無水乳糖、棕櫚蠟、交聯聚維酮、ED&CBlueNo.2鋁色淀、羥丙基甲基纖維素、乳糖一水合物、硬脂酸鎂、I改性藥用釉、聚乙二醇、吐溫80、聚維酮、丙二醇以及二氧化鈦。雷洛昔芬的生物學作用與雌激素相似，是通過與雌激素受體結合進行調節的。臨床前數據證明雷洛昔芬在尿液和乳房組織中是雌激素拮抗劑。初步臨床數據(歷經30個月)提示EVISTA對子宮和乳房組織缺少雌激素##用。口服后雷洛昔芬迅速被吸收。約60%的口服劑量被吸收，但是全身分布前的葡糖苷酸綴合是廣泛的。雷洛昔芬的絕對生物利用Jbl:2.0%。達到平均最大血漿濃度和生物利用度的時間是全身相互轉化和進入肝循環雷洛昔芬及其葡糖苷酸代謝物的函數。口服施用單次劑量30至150mg鹽酸雷洛昔芬后，表現體積分布是2.348L/kg并且不是劑量依賴性的。口服施用14C標記的雷洛昔芬后，測定了其在人中的生物轉化和分布。雷洛昔芬經歷廣泛的首過代謝變成葡糖苷酸綴合物雷洛昔芬-4，-葡糖苷酸、雷洛昔芬-6-葡糖苷酸、以及雷洛昔芬-6，4，-二葡糖苷酸。尚未檢測到其它的代謝物，這提供了強有力的I證據表明雷洛昔芬不經過細胞色素P450途徑代謝。血漿中未綴合的雷洛昔芬少于總標記物質的1%。雷洛昔芬和葡糖苷酸的血漿濃度曲線的終末對數線性部分通常平行。這與雷洛昔芬和葡糖苷酸代謝物的相互轉化一致。靜脈內施用后，雷洛昔芬以近似肝血流的速度被清除。表觀血漿清除率是44.1L/kg/小時。雷洛昔芬及其葡糖苷酸綴合物通過可逆的全身代謝進入肝循環進行相互轉化，由此，口服施用后其血漿消除半衰期延長至27.7小時。單次口服劑量雷洛昔芬的結果預測多劑量藥物動力學。長期施用后，清除范圍是40至60L/kg/小時。增加鹽酸雷洛昔芬的刑量(30至150ma)導致血漿時間濃度曲線(AUC)下面積略小于按比例增加。雷洛昔芬主要被排泄到糞便中，并且小于0.2。/。的雷洛昔芬以原形由尿液中排泄。少于6%的雷洛昔芬劑量以葡糖苷酸綴合物由尿液中消除。推薦劑量是每日一片60mg的片劑，可不考慮進食情況在每天的任何時間施用。預防性治療還可包括施用血管生成抑制劑。血管生成抑制劑包括但不限于Aj6l管抑素(Angiostatin)、AVASTIN(bevacizumab)、美替克侖、癌抑素(Canstatin)、Combretastatin、內皮抑素、NM國3、凝血檢蛋白(Thrombospondin)、腫瘤抑素(Tumstatin)、2曙甲Il^雌二醇、Vitaxin、ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(TARCEVA⑧/埃羅替尼)、CI1033、PKI1666、IMC225(ERBITUX⑧/西妥昔單抗)、PTK787、SU6668、SU11248、HERCEPTIN(曲妥珠單抗)，以及IFN-a、CELEBREX(塞來昔布)、THALOMID(沙利度胺)、羅格列酮、硼替佐米(bortezomib)(VELCADETM)、zolendronate二膦酸鹽(ZOMETA)以及IFN國a。還提供了監測乳癌風險降低策ML治療效果的方法。例如，當來自對象的生物樣品中ADAM12的存在狀態與MMP9的存在狀態用于評估對象中乳癌風險時，ADAM12水平的降低和/或MMP9水平的降低指示乳癌風險降低策略是有效的。作為替代，根據Gail5年風險模型被認為處于乳癌低風險的對象中已升高ADAM12水平的降低指示乳癌風險降低策略是有效的。在一個實施方案中，根據Gail5年風險模型被認為處于乳癌低風險的對象中已升高MMP9水平的降低指示乳癌風險降低策略對對象是有效的。在一個實施方案中，根據Gail5年風險模型被認為處于乳癌低風險的對象中已升高ADAM12水平的降低和MMP9水平的降低指示乳癌風險降低策略對對象是有效的。檢測試劑盒本發明還涉及用于檢測MMP9和ADAM12的商品試劑盒。所述試劑盒可以是本領域一般技術人員熟知的任何構造，并用于進行一種或多種本文所述的檢測ADAM12和MMP9的方法。所述試劑盒是方便的，因為它們提供許多(如果不是全部)的必要試劑用于實施檢測生物樣品中ADAM12和MMP9的測定。此外，該測定優選地與試劑盒中包含的一個標準或多個標準同時進行，比如預定量的蛋白質或核酸(例如ADAM12，例如MMP9),標準水平使得試驗結果可被定量或驗證。所述試劑盒包含用于檢測蛋白質(例如ADAM12,例如MMP9)的裝置，比如選擇性結合所述蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)的抗體或抗體片段、或允許合成編碼該蛋白質之cDNA的一組DNA寡核苷酸引物、或例如檢測mRNA(例如ADAM12mRNA，例如MMP9mRNA)表達的DNA探針。所述檢測試劑盒優選地配制成標準的兩抗體結合形式，其中例如一種ADAM12特異性抗體捕獲對象樣品中的ADAM12以及另一種ADAM12特異性抗體用于檢測被捕獲的ADAM12。在另一個優選的試劑盒配方中，一種MMP9特異性抗體捕獲對象樣品中的MMP9以及另一種MMP9特異性抗體用于檢測被捕獲的MMP9。例如，捕獲抗體被固定在固相上，例如測定板、測定孔、硝化纖維素膜、微珠、蘸棒(dipstick)、或洗脫柱的成分。第二個抗體(即檢測抗體)通常用可檢測標記(比如量熱劑或放射性同位素)作為標簽。在一個實施方案中，所述試劑盒包括檢測尿樣中目標蛋白質(例如ADAM12,例如MMP9)的方法。在一個具體實施方案中，所述試劑盒包含其上固定有抗體或片段(例如ADAM12，例如抗MMP9)的"蘸棒"，所述抗體或片段特異性結合目標蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)。然后可利用例如被量熱劑或放射性同位素可檢測標記的第二個抗體檢測特異性結合的目標蛋白質(例如ADAM12，例如MMP9)。在另一些實施方案中，所述檢測試劑盒可使用但不限于下述技術竟爭性和非竟爭性分析、放射免疫分析(RIA)、生物發光和化學發光分析、熒光分析、三明治分析、免疫放射分析、斑點印跡、酶聯分析包括ELISA、微滴定板、表面等離子體共振、光學生物傳感器、以及免疫細胞化學。對于每一種試劑盒，通過本領域技術人員熟知的方法確定分析的范圍、靈敏度、精確度、可靠性、特異性和重現性。在一個實施方案中，所述檢測試劑盒可包括檢測其它生物標志物(例如乳癌標志物，例如乳癌風險標志物)的方法。上述檢測試劑盒還提供使用說明。本文中所引用的所有參考文獻以其整體通過引用并入本文。實施例1尿生物標志物提供一種新的非侵入式評估乳癌風險的方法方法研究群體邀請對象參加貝絲以色列迪克尼斯醫學中心(theBethIsraelDeaconessMedicalCenter)、奧博恩山醫院(theMountAuburnHospital)和達納法布爾癌癥研究所(theDanaFarberCancerInstitute)的外科臨床、放射腫瘤臨床和醫學腫瘤臨床的研究。年齡匹配的正常健康對照來自常規來BrighamandWomen'sHospital篩查乳房X射線攝影的女性，并且其被報告無慢性健康問題、無乳房疾病、具有正常的乳房X射線攝影照片并且未進行藥物治療。所有參加者在捐亂泉液時提供一伶洋細的病史表格。懷孕女性和哺乳期女性被排除在研究以外。利用改進Gail模型計算風險分數66，67尿樣收集與處理如前所述收集尿液4。將樣品收集在無菌容器中并立即在-201C冷凍。根據關于廢棄臨床材料的機構生物倫理指導原則收集尿液。分析之前，利用Multistix9尿分析試條(Bayer,Elkhart，IN)檢測尿液中血液和白細胞的存在，并排除含有血液或白細胞的樣品。根據廠商說明利用商品試劑盒(Sigma,St.Louis，MO)檢測尿液肌酸酐濃度。利用牛血清白蛋白作為標準通過Bradford法檢測尿液蛋白質濃度。從148名女性得到尿樣44名AH女性患者、24名LCIS女性患者、以及80名健康對照。酶鐠法利用我們實驗室建立的制備方法處理尿樣(美國專利序號08/639,373)并進行電泳和利用酶鐠分析。根據我們先前的報道用明膠作為底物通過底物^電泳(酶鐠)分析30微升的每個尿樣4。利用單特異性抗體通過免疫印跡aiiMMP身份。Western印跡分析還原條件下通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質(20照)。已分離蛋白質經電泳轉移到硝化纖維素膜上(Schleicher&Schuell，Keene，NH)并如前所述進行處理5。用增強化學發光顯現標記蛋白質(PierceChemicalCompany,Rockford，IL)。分別以1μ/ml和2μg/ml濃度使用抗人ADAM12的多克隆抗體rbl226、S畫18(sc-16526,SantaCruzBiotechnology,CA)。用增強化學發光顯現標記蛋白質(PierceChemicalCompany,Rockford,IL)。利用UN-SCAN-ITTM(SilkScientific,Orem，UT)軟舟數字化技術分析條帶強度。利用酶鐠進行MMP分析并利用單特異性抗體通過免疫印跡和隨后的密度計量學測量(DU)分析ADAM12。乳房X射線攝影為了改進乳房X射線攝影結果溝通和提供結局監測以改進對象護理質量，美國放射學會(ACR)創立了乳房影像報告與數據系統(BI-RADS)7。評估分類如下。5/W"5"7表示陰性的乳房影像照片。對此沒有評估。乳房對稱并且無腫塊，存在結構干擾或可疑鉤化。5/JL42^2表示良性現象。5/i^4Z)SJ表示可能是或許良性現象并且建議短間隔期隨訪。該類現象應當具有非常高的良性概率(298%)。預期其不隨隨訪間隔而變化，但是放射學者將傾向于確定其穩定性。5/iMD5W用于表示可疑的異常并應當考慮進行活組織檢查。近期以來，該分類已經被重新分成a、b和c來表示可疑水平增加(輕度至中度)。5/WZW5高度提示是惡性的并且應當采^it當措施。當需要其它成像評估時使用5/i^4ZXy0。乳房密度分類如下所述1.幾乎全部為脂肪的，2.離散的纖維腺體密度，3.密度不均勻，或4.極大密度。利用標準的美國放射學會(ACR)乳房影像報告與數據系統(BI-RADS)評估乳房影像學照片。統計分析利用卡方分析比較AH、LCIS和正常對照之間的尿MMP。使用方差分析(ANOVA)以及Bonferroni改進的比較用于評估3組之間ADAM12水平的差異68。利用向后選取法進行分步驟多元邏輯(logistic)回歸分析來測定預測因子，通過考慮4種MMP、ADAM12作為連續變量、年齡以及用于評估統計學顯著性的似然性比值^r驗(LRT)中的Gail評分，所述預測因子用于區分對照與AH和LCIS69。利用作為ADAM12水平之函數估計AH概率的精確方法和概率曲線來確定比值比和95%置信區間(CI)，并且利用最終多變量模型的回歸^(斜率和截距系數)推導出Gail5年風險評分7°。接受者操作特征(ROC)曲線分析用于評估ADAM12診斷的準確性、Gail分數以及區分正常和AH的組合71。利用SPSS軟件包(version14.0，SPSSInc.,Chicago,IL)進行統計學分析。P<0.05的雙尾值被認為是統計學顯著性的。預先進行冪分析，其表示AH和LCIS各組中最小樣本大小是24名對象以及80名對照將提供卯％次勒a=0.05，b=0，20)以在對象和對照之間每個MMP的陽性表達中檢測20%差異，其中使用對于獨立比例的二項式Z-檢驗72，利用ANOVA檢驗在各研究組之間平均ADAM12水平有30%差異(version6.0,nQueryAdvisor,StatisticalSolutions,Saugus，MA)。結果我們研究了148名女性尿液中MMP-9和ADAM12的表達44名ALH/ADH女性患者、24名LCIS女性患者與80名健康對照比較。連續檢測多數研究對象尿液中的MMP-9、MMP-2、、MMP-9/NGAL復合物和ADAM12。MMP-9的4戈表性Sl鐠和ADAM12的4&表性Western印示在圖1中。大多數對象的年齡超過40歲并且是高加索人(表1)。組與組之間的吸煙或飲酒習慣沒有顯著差異(表1)。大多數研究女性從未吸過煙或已經停止吸煙。類似地，有極少數女性是酗酒者。在96%的正常對照、63%LCIS女性患者以及38%非典型增生女性患者中其乳房X射線攝影照片的BIRADS分數為1或2，被讀作正常。正常對照的乳房X射線攝影照片中沒有讀值為BIRADS4或5的，這是懷疑惡性或高度提示惡性的分數，有52%非典型增生女性患者和37%LCIS女性患者的乳房X射線攝影照片的讀值為BIRADS4或5(表1)。Gail分數計算在正常對照中與平均乳癌風險相一致，其5年風險中值是1.0;在患有非典型增生的對象中則升高，其風險中值為3.8(表l)。表l.研究組的特征<table>complextableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>我們的結果顯示MMP-9和ADAM12是LCIS(均為p<0.001)和ADH/ALH(MMP-9，p=0.004;ADAM12,p<0.001)的獨立預測因子。ROC曲線分析基于ADAM12的強度單位(DU)，ROC曲線下面積是0.94,示ADAM12是從正常中區分乳癌的極好標志物。利用存在/不存在數據，靈敏度是0.949(95%CI:0.827至0.994)，特異性是0.792(95%CI:0.580至0.929)。以靈敏>1/[1-特異性測定的陽性測試(LR+)的似然比是4.6，表示如果女性;j^驗為陽性，她患有非典型增生或LCIS比不患這些病的可能性高4倍以上。Logistic回歸進行Logistic回歸測定ADAM12和MMP的組合是否提高診斷準確度并且Logistic回歸顯示MMP9和ADAM12是LCIS(均為p<0.001)ADH-ALH(MMP畫9，p=0.004;ADAM12,p<0.001)的獨立預測因子。最大似然性估計應用最大似然性估計來得出各種可能檢測結果的LCIS或ADH-ALH概率尿液中MMP9和ADAM12陽性與100%LCIS概率相關，MMP9陰性和ADAM12陽性與50。/。LCIS概率相關，MMP9陽性和ADAM12陰性與40%LCIS概率相關，以及MMP9和ADAM12陰性與0%LCIS概率相關。相似地，如果女性尿液中MMP9和ADAM12都是陽性，ADH-ALH的概率是100%;MMP9陰性和ADAM12陽性，ADH-ALH的概率是67%;MMP9陽性和ADAM12陰性，ADH-ALH的概率是25%;以及MMP9和ADAM12都是陰性，ADH-ALH的估計概率是0%(表2)。表2.最大似然性估計檢驗結果LCIS或非典型增生的似然性+MMP-9和+ADAM12100%的LCIS或非典型增生概率-MMP-9和+ADAM12-50-67%的LCIS或非典型增生概率+MMP-9和-ADAM12-25"40%的LCIS或非典型增生概率:MMP-9和-ADAM12-0%的LCIS或非典型增生概率統計學分析對于ADAM12，單變量分析表明AH女性患者和LCIS女性患者的平均水平分別是20.7±16.8和14.7±6.9DU，通過Bonferroni調整(adjustment)以及ANOVA確定，這顯著高于正常對照(2.1±2.8DU)(均為p<0.001)。正常對照的ADAM12水平中值是0。AH和LCIS組彼此之間的平均ADAM12水平或ADAM12水平中值沒有顯著差異(P>0.20)(表3A)。正常對照和AH女性患者或LCIS女性患者之間的MMP9陽性個體百分率之間也具有顯著性差異(2自由度上的Pearson卡方=6.17，P<0.05)。多元逐步logistic回歸分析顯示持續的ADAM12水平(p<0.001)、MMP9陽性(P=0.02)以及年齡(P=0.04)在區分對照和診斷為AH女性患者時是獨立預測的(表3B)。區分對照和AH中ADAM12的經調整的比值比是1.4，提示每10個單位的增加與增加28倍比值(1.4")相關，所述28倍比值指個體更可能患有AH而不是正常健康對照。這相當于97%的概率增加，其中概率＝比值/(l+比值)=28/29。對于二元MMP9分析，與檢測為MMP-9陰性相比，陽性個體患者有AH的風險估計高5倍(比值比=5.1，95%置信區間=1.4至17.9)。襝二驗的其它變量(包括MMP-2、MMP-9/NGAL，并且MMP>150kDa)不能預測AH(均為P>0.05)。表3A正常對照和對象研究組尿中ADAM12水平的單變量分析正常非典型非典型對照增生LCIS增生/LCIS(N＝80)(N＝44)(N=24)(N＝68)ADAM122.1±2.920.7士16,814.7±6.918.5士14.7(DU)0(0-3)3(9-27)15(12-18)13(11-24)中值(IQR)0-110-800-270-80全范圍加-減值是平均值±SD，Dl^密度計量單位，IQR=四分間距ADAM12，解聯蛋白金屬蛋白Sl,LCIS=原位小葉癌利用ANOVA及針對平均值的Bonferroni校正和針對中值的Mann-Whitney.U-檢驗來比較ADAM12水平<formula>seeoriginaldocumentpage40</formula>與正常對照比較加-減值是平均值表3B.預測非典型增生和原位小葉癌的變量的多變量Logistic回歸分4t非典型增生的預測因子ComplextableseetheoriginaldocumentpagexCI=置信區間.其它變量包括MMP-2，MMP-9/NGAL,并且MMP>150無統計學顯著性(P>0.05).當評估LCIS的預測因子時，Logistic回歸表明顯著的多變量預測因子與針對AH的相同，包括ADAM12(p<0.0001)、MMP9(P=0.014)以及年齡(P=0.05)(表3B)。這些變量在區分LCIS女性患者和正常對照中提供獨立的信息，當ADAM12的經調整的比值比是1.6時，提示每10個單位的增加與110倍比值增加(l.61G)相關，所述110倍比值指個體更可能患有LCIS而不是正常健康對照。這相當于超過99％的概率增加。與檢測為MMP9陰性的個體相比，MMP9陽性的女性患有LCIS的風險高13倍(比值比=13.8，95%置信區間=1.7至110.7)。枱r驗的其它變量(包括MMP-2、MMP-9/NGAL，并且MMP>150kDa)不是LCIS的顯著性預測因子(全部P>0.05)。利用Logistic回歸分析，推出非線性方程用于基于不同ADAM12區間來評估AH和LCIS概率，并且所述非線性方程對于AH(LRT=58.4，p<0.0001)和LCIS(LRT=53.3，p<0.0001)是高顯著性的。對照和診斷患有AH(圖2A)或LCIS(圖2B)的對象的經驗數值通過每組的柱線表示，反映每個ADAM12水平區間中的女性百分率。理論曲線舉例說明與正常相比較的AH或LCIS概率，根據每圖中ADAM12區間顯示所述理論曲線并且所述理論曲線清楚地顯示對象和對照之間的分離。如圖2A所示，57%對照和僅僅7%患AH對象的ADAM12水平是0個密度計量單位，而75%的患AH對象和僅僅4％對照的水平大于10DU。ADAM12水平為0的個體的AH預測概率是7%，而ADAM12水平在5至10DU的那些個體的AH預測概率是40。/。，ADAM12水平為10至20DU的女性的AH預測概率是85%，ADAM12水平超過20DU的女性的AH預測概率是95%。相比而言，如圖2B所示，57%對照和僅僅4%的LCIS對象的ADAM12水平是0，而約80%的患LCIS對象和僅僅4%對照的水平大于10DU。陽性ADAM12水平<2DU的個體的LCIS預測概率<5%，而ADAM12水平在5至10DU的那些個體的LCIS預測概率是52%,并且ADAM12水平10至20DU的女性的LCIS預測概率是85%，ADAM12水平超過20DU的女性的LCIS預測概率是97%。然后將尿液中ADAM12水平與反映臨床信息的Gail5年風險分數結合67。Gail分數小于1.67。/。認為是低風險，而分數等于或大于1.67%表示發生乳癌的風險高。多元Logistic回歸分析表明ADAM12水平(LRT=19.92,PO.0001)可作為區分AH和對照的顯著性預測因子。該模型方法的結果可以看作分別根據Gail5年風險的高或低，隨ADAM12水平增加而AH概率也增加(圖3)。例如，對于Gail分fel.67。/o的女性，ADAM12水平為2DU的AH概率是90%,對于低風險Gail分數<1.67%的女性，ADAM12水平為2DU的AH概率基本上是0。/。。另一方面，低風險Gail分數<1.67%的女性的AH概率開始隨中等高的ADAM12水平(例如12DU或更高水平)而增加(底部曲線)。例如，在低風險Gail5年分數女性的亞組中，ADAM12水平為14和15DU分別與50%和75%的概率相關。在Gail5年風險<1.67%和ADAM12水平為16DU或更高的個體中AH概率估計是90%或更高。相似地，單獨連續ADAM12水平的ROC分析被證明可以極好地區分正常對照和AH女性患者，ROC曲線下面積是0.914。尿液中ADAM12水平還提供了出色的區分正常對照和LCIS女性患者的能力，曲線下面積(AUC)是0.950。由于對于任何檢驗最大AUC是1.0，這些分數證明尿液中ADAM12水平的強大預測能力。當尿液中ADAM12水平與Gail5年風險分數提供的臨床信息結合時，進一步ROC分析表明最佳組合是Gail+0.15xADAM12(AUC=0.996)。因此，當ADAM12和Gail風險分數同時一起使用時得到最佳的成績。該組合指數的最好截斷值是2.8。利用2.8的截斷值，該組合的靈敏度是0.976(42個AH病例之中41名被正確分類)并且特異性是0.977(44名對照中43名被正確分類)。因此，在我們的群體中使用該ADAM12水平-Gail組合指數僅僅得到1個假陽性(1名對照的組合指lbl2.95，分數大于2.8)和1個假陰性(1名AH女性患者的組合指l!bi2.3,分數低于2.8截斷值)。開發替代和改進方法以確定處于高乳癌風險的女性集中了大量研究8。我們選擇集中在MMP作為生物標志物，因為它們在乳癌進程的最早階段起作用。在該研究中，我們著眼于通過活組織檢查證明患有非典型增生和原位小葉癌(LCIS)的對象的尿液中MMP以及ADAM12的表達。非典型增生和原位小葉癌都被認為是風險增加的病理指標。隨著對乳癌風險降低期待的增加，準確辨別發生乳癌風險增加的女性變得日益重要。我們的結果表明尿液中生物標志物ADAM12和MMP-9是AH和LCIS的高度顯著的預測因子。MMP是在肺瘤生長、轉移、以及重建腫瘤微環境中起重要作用的基質降解酶。免疫組化研究表明乳房腫瘤中MMP表達水平升高9-"和乳房腫瘤提取物已顯示含有活性MMP4。已經報道患有乳癌的對象血漿中MMP9水平升高12。我們首次發現利用酶鐠(底物皿電泳)可檢測皮下^Lewis肺癌腫瘤細胞的小鼠尿液中功能性尿液MMP。酶鐠利用電泳分離顯示酶活性并允許單個基質降解成分顯現在皿上。重要的是，這些原始數據表明不管其大小，MMP可通過荷瘤宿主中的尿液收集系統過濾并可以生物活性形式儲存在膀胱中。該4^人驚訝的結果表明MMP可能存在于荷瘤個體膀胱遠端部位的尿液中。與血管和淋巴系統相連通的腫瘤過量產生MMP可能導致其它體液比如血液或尿液中MMP活性水平升高。這種可能性與之前的證據相一致。所述之前的證據是已經在癌癥對象體液中測量到由腫瘤過量產生的其它調節分子比如血管生成肽bFGF并已證明其是疾病狀態的獨立預測因子13，14。我們隨后進一步在人對象中檢驗了該假設。我們繼續報道了可在乳癌對象尿液中檢測到完整MMP并且這些尿液中的MMP是疾病狀態的預測因子4。自從我們的原始報道以來，現在許多其它的獨立公開的研究支持我們的發現(即尿液中MMP預測肺瘤疾病狀態)5，15一22。隨后，我們證明了MMP是轉變成血管生成表型所必需的，所述血管生成表型是癌癥生長和進程中的早期和關鍵事件23。而且，最近我們鑒定了一種新的高分子量的尿液MMP是MMP9/NGAL(NeutrophilGelatinaseAssociatedLipocalin)的復合物5。我們已經在大量對象中研究了尿液中MMP表達并且證明隨疾病進展對象尿液中MMP顯著增加。我們還發現似乎主要頻繁存在于乳癌對象尿液中的MMP類型是92kDa類型(MMP9)。需要注意的是，這些乳癌對象尿液中檢測的MMP的特性分析顯示與其中我們檢測到高頻率MMP2(72kDa明膠酶)的膀胱癌對象和前列腺癌對象的獨立研究結果相比，乳癌對象中明顯缺少MMP2。這提示可能具有基于這些對象尿液中出現不同MMP類型的特異性腫瘤"指紋"。由于這些發現以及我們對尿液中疾病標記物的興趣，我們建立了確定癌癥對象尿液中存在的蛋白質以及確定其存在是否可能與疾病狀態相關的生物標志物鑒定。最近，我們分離并鑒定了乳癌對象尿液中ADAM12(解聯蛋白金屬蛋白酶)24。ADAM12是與MMP相關的糖蛋白家族成員。之前已經報道了乳癌、結腸癌以及肺癌組織中ADAM12的表達增加25。我們建立了ADAM12的底物特異性并顯示該酶可降解明膠、IV型膠原蛋白和纖維連接蛋白而不降解I型膠原蛋白或酪蛋白，這提示該酶在ECM重建(這是腫瘤疾病的標志)中起作用。我們還證明尿液中ADAM12還隨乳癌對象中疾病進程而顯著增加并與疾病階段相關。ADAM12在正常對照中是不可檢測的或以非常低水平存在，而在非典型增生和LCIS以及浸潤性癌癥對象中增加。在轉移性疾病中發現最高水平的ADAM1224。在此，我們報道了這兩種有力的乳癌疾病進程的尿指示物組合MMP9和ADAM12。當尿液中MMP9和ADAM12結果相組合并且都是陽性時，觀察到其與已被證明發生乳癌、非典型增生和LCIS的風險因子高顯著相關。非典型增生已被證明是進一步發生乳癌的主要風險因子，其使得女性之親屬的風險是一^A群的5.3倍。如果對象的一級親屬(first-degreerelative)患有乳癌，該風險進一步增加(10倍風險)26-28。不管如何命名，LCIS也被認為AX險增加的標志物而不是前病變(precursorlesion)29,30。然而，現在認為LCIS可能包括一系列病癥并且這些病癥的小亞類(比如多形性變體)實際上可代表前病變31，32。9個參與監測、流行病學和最終結果(SEER)項目的基于人群的癌癥登記上表明從1978年至1998年絕經后女性中LCIS診斷率增加4倍29。看來非典型增生(AH)的診斷也可能在增加。非典型增生比率難于追蹤因為該診斷的報告不是肺瘤登記中所必需的，并且該診斷不被SEER數據所記錄。在19世紀80年代和90年代，幾個大的研究證明AH在所有良性乳腺活組織檢查中比例小于5%33，34。近來大的歷史事件中，非典型增生代表所有良性乳腺活組織檢查中的4%35。新近的非典型增生比率報告達到所有良性乳腺活組織檢查的7%36。在奧博恩山醫院跟蹤活組織檢查結果顯示從1997年至2004年ADH增加1倍并且LCIS增加3倍(表8)。這最可能至少部分地歸因于乳房X射線攝影篩查增加，因為ADH最經常地被鑒定為具有異常的乳房X射線攝影37。應當注意，在經歷預防性乳房切除術、處于極高乳癌遺傳風險的女性乳房樣本的最近前瞻性研究中，57%的所述女性中發現這些高風險的病變38。這些當中，37%是非典型小葉增生(ALH)，39%是非典型導管增生(ADH)、以及25%是LCIS38。表8.活組織檢查結果的變化趨勢ADH/ALHLCISDCIS浸潤性總活組織檢查1997l月至6月7(3.3%)2(0.9%)16(7.6%)40(18.9%)2112004l月至6月20(5.7%)12(3.4%)20(5.7%)55(15.6%)352非典型增生通常在為異常乳房x射線攝影或物理發現所做的乳腺活組織檢查中被診斷出來，而且還可以被乳頭吸取、隨機乳暈旁細針抽取和導管灌洗記錄到8。更可靠地，需要侵入更少和費用更低的方法用于評估乳癌風險。乳房x射線攝影是目前篩查女性乳癌最靈敏、廣泛應用的方法。目前，盡管乳房x射線攝影是我們檢測乳癌的"金標準"，但是其不是完全可靠的39。當然，最近的進展比如數字乳房x射線攝影已經提高了診斷準確度，并且在降低乳癌死亡率中具有顯著差異40，41。然而，按照總體診斷準確度，乳房x射線攝影得出1o至3or。的假陰性率并且其靈敏度隨乳房密度而被消弱42，"。假陽性也是一個實際問題。應當注意的是，最近研究中，美國乳房x射線攝影人員將所有篩查中的10%判斷為異常-并且幾乎所有這些都是假陽性44，45。此外，盡管大多數女性有機會使用這些設備，但是許多真正需要它們的人(包括老年人和經濟困難的女性)未能利用這些設備46，47。最近研究顯示，用于檢測浸潤性乳癌，乳房MRI優于乳房X射線攝影，靈敏度是乳房X射線攝影和超聲的兩倍48。然而，MRI較昂貴，不是總能由健康保險公司支付并且對于所用技術以及結果解釋在各機構之間具有相當大的差異。有機會使用乳房X射線攝影對于少數民族女性、低收入女性和老年女性來說是一個嚴肅的問題46，47，49。費用、害怕疼痛以及缺少對推薦篩查指導的教育也是限制乳房x射線攝影廣泛應用的因素5°，51。乳房X射線攝影檢查需要高技術的專業人員并購買及放置大且昂貴的設備、以及維護工作和質量保證成本。所有這些因素都可限制其可用性，尤其是對于處于不利地位的女性。目前，他莫西芬是FDA批準的用于降低乳癌風險的唯一藥劑。對于具有LCIS病史的女性，降低56%，對于具有非典型導管增生病史的女性，他莫西芬甚至更顯著地降低風險-降低86%52。雖然通常可被良好地耐受，他莫西芬確實具有相關的毒性，包括子宮內膜癌、中風、肺栓塞、以及深度靜脈血栓的風險增加，尤其對于50歲或更大年齡的女性52。因此，其它試驗，最受關注的STAR試驗(他莫西芬和雷洛昔芬研究)正在進行中以為高風險女性確定更好的醫療選擇53，54。在評估降低浸潤性乳癌風險的試驗中，所述STAR試驗(他莫西芬和雷洛昔芬研究)是直接比較兩種藥物55，56。雷洛昔芬是第二代選擇性雌激素調節劑(SERM)并且是當前指定為預防骨質疏松癥的藥物，已經證明其具有抗雌激素特性，并且最小限度地刺激子宮內膜上皮細胞。該5年研究由NSABP實施，并設計成19,000名Gail相對風險至少1.67%的絕經后女性參加。該STAR試驗將檢測哪種治療最顯著地降低浸潤性乳癌，并將為每種藥物建立風險效益曲線以及終點(包括子宮內膜癌、心臟病、骨折和生活質量)。已經停止了該STAR試驗的增長并且結果將在2006年可以得到。此外，現在正在評估有前景的新藥劑比如雌激素合成酶抑制劑作為可能的乳癌風險降低藥劑57-6°。當前，沒有足夠的臨床標志物可用于可靠地檢測是否存在原發性乳房病變(篩查)、用于監測臨床進程、以及用于測定哪些亞類的對象可受益于更侵入式治療。雖然數學模型比如Gail模型61、Claus模型62以及BRACAPRO模型63是有用的，但是可靠的生物標志物顯然將是用于確定風險和追蹤乳癌進程的最理想方法。最近，對MMP作為癌癥診斷和監測的生物標志物的興趣日益增加64，65。目前利用非侵入式尿液檢驗評估乳癌風險的方法是非常受歡迎的。評估尿液中蛋白質比乳房X射線攝影術的侵入更少、更易使用、以及更低費用，其應當是大多數女性更容易耐受的，并且其可以鼓勵對篩查工作的更高依從性。這能夠用于在乳房X射線攝影變化或者甚至乳房腫塊出現之前開始降低風險的工作。我們的數據清楚地顯示尿液中ADAM12和MMP-9是乳癌風險標志AH和LCIS的高度顯著的預測因子。發現ADAM12水平能夠極好地區分正常對照和AH或LCIS女性患者。當ADAM12水平與Gail風險分數相組合時，所得指數甚至更準確地區分正常對照和單獨通過Gail模型被歸類為低風險的AH女性(靈敏度0.976，特異性0.977)。該尿液中的生物標志物法可用于在乳房X射線攝影變化或甚至乳房腫塊出現之前將受益于降低早期風險工作的對象。以下以及整個說明書所引用的參考文獻以其n并入本文。參考文獻1,ParkinDM，BrayF,FerlayJ，PisaniP,Globalcancerstatistics,2002.CACancerJClin2005;55:74-108,2，JeraalA，MuirayT，WardE，etal.Cancerstatistics,2005.CACancerJClin2005;55:10-30.3.StrategiesforManagingtheBreastCanowResearchProgram;AReporttotheU,S.ArmyMedicalResearchandDevelopmentCommand,:InstituteofMedicineNationalAcademyPress,1993，4，MosesMA，WiederschainD,LoughlinKR，ZurakowskiD,LambCC，FreemanMR,Increasedincidenceofmatrixmetalloproteinasesinurineofcancersubjects.CancerResl1998；58:1395-9,5.YanL，BorregaardKjeWsenL,MosesMA.Thehighmolecularweighturinarymatrixmetalloproteinase(MMP)activityisacomplexofgelatinaseB/MMP-9andneutrophilgdatinase-associatedlipocalin(NGAL).ModulationofMMP-9activitybyNGAL.JBiolChera2001;276:37258-65.i6.GilpinBJ，LoechelF，MatteiMG,EngvallE，AlbrechteenR，WewerUMAnovel,secretedformofhumanADAM12(mdtrinalpha)provokesmyogenesisinvivo.JBiolChem1998;273:157-66.7.LacquementMA，MitchellD，HollingsworthAB,PositivepredictivevalueoftheBreastImagingReportingandDataSystem,JAmCollSurg1999;189:34-40.8.HollingsworthAB，SingletarySE，MorrowM,etal.Currentcomprehensiveassessmentandmanagementofwomenatincreasedriskforbreastcancer.AmJSurg2004;187:349-62.9.PoulsomR,HanbyAM，PignatelliM，etal.ExpressionofgelatbaseAandTIMP-2mRNAsinde咖oplasticfibroblastsinbothmammarycarcinomasandbasalcellcarcinomasoftheskin,JClinPathol1993;46:429-36,10.BrownPD，BloxidgeRE，AndersonE，Hov/ellA-Expressionofactivatedgelatinaseinhumaninv貼ivebreastcarcinoma.ClinExpMetastasis1993;11:183-9.11.ZuckerS,LysikRM，DiMassimoBI，etal*PlasmaassayofgelatinaseB:tissueinhibitorofmetalloprotdnasecomplexesincancer.Cancer1995;76:700-8.12.CapperSJ，V議heijenJ,SmithL,SullyM，VisserH，HanemaaijerR,Determinationofgelatinase-A(MMP-2)activityusinganovelimmunocaptureassay,AnnNYAcadScil卿；878:487-90，13.NguyenM,WatanabeH,Buds加AE，RichieJP,FolkmanJ'Elevatedlevelsoftheangiogenicpeptidebasicfibroblastgrowthfactorinurineofbladdercancersubjects'JNatlCancerInst1993;85:241-2.14.NguyenM,WatanabeH，BudsonAE,RichieJP,HayesDF，Folfcm肌IElevatedlevelsofanangiogenicpeptide,basicfibroblastgrowthfactor,intheurineofsubjectswithawidespectrumofcancers.JNatlCancerInst1994;86:356-61.15.GerhardsS,JungK，KoenigF，etal，Excretionofmatrixmetalloproteinases2and9inurineisassociatedwithahighstageandgradeofbladdercarcinoma.Urology2001;57:675-9.16.SierCF，CasettaG,Verh^jenJH，改al-Enhancedurinarygelatinaseactivities(matrixmetalloproteinases2and9)areas幼ciatedw他early-stagebladdercarcinoma:acomparisonwithclinicallyusedtumormarkers.ClinCancerRes2000;6:233340.17.KaimyamaH，Matrixmetalloproteinasesandbladdercancer,JMedInvest2001;48:3143.18.Hanemaaij改R，SierCF，VisserH>etalMMP-9activityinurinefromsubjectswithvarioustumors,asmeasuredbyanovelMMPactivityassayusingmodifiedurokinaseasasubstrate,AnnNYAcadSci1999;878:141-9,19.MonierF,MollierS,GuilkrtM,RambeaudH，MorelF,ZaouiP,Urinaryreleaseof72and92kDagdatinases,TIMPs，N-GALandconventionalprognosticfactorsinurothelialcarcinomas,EurUrol2002;42:356-63,20，NuttJE，DurkanGC，MellonJK,LunecJ.MatrixMetalloproteinases(MMPs)inbladdercancer:theinductionofMMP9byepidermalgrowthfactoranditsdetectioninurine,BJUInt2003;91:99-104.21,SheriefMH，LowSH,MiuraM,KudoN，NovickAC,WeimbsT.Matrixmetalloproteinaseactivityinurineofsubjectswithrenalcellcarcinomaieadstodegradationofextracellularmatrixproteins:possibleuseasascreeningassay.JUro!2003;169:15304.22,DurkanGC，NuttJE，RajjayabunPH，MealDE，LunecJ,MellonJK,Prognosticsignificanceofmatrix:inetalloprotein朋e-landtissueinhibitorofmetalloprotdnase-invoidedurinesamplesfromsubjectswithtransitionalcellcarcinomaofthebladder.ClinCancerRes2001;7:3450-6.23，FangJ,SbingY,WiederschainD，etal.Matrixmetalloproteinase-2isrequiredfortheswitchtotheangiogenicphenotypeinatumormodel.ProcNattAcadSciUSA2000;97:3884-9,24,RoyR,WewerUM,ZurakowskiD，PoriesSE,MosesMA,ADAM12cleavesextracellularmatrixproteinsandcorrelateswithcancerstatusandstage.JBiolChem2004;279:51323-30.25.IbaK，AlbrechtsenGilpinBJ,LoechelF,WewerUM,Cysteine-richdomainofhumanADAM12(meltrinalpha)supportstumorcelladhesion.AmJfPatholl999；154:1489-501，26，MarshallLM,HunterDJ，ConnollyJL,etal，Riskofbreastcancerassociatedvrithatypicalhyperplasiaoflobularandductaltypes.CancerEpidemiolBiomarkersPrev1997;6:297-30〗，27，DupontWD，PageDL.Riskfactorsforbreastcancerinwomenwifeproliferativebreastdise朋e.NEnglJMed1985;312:146-51,28，DupontWD，PariFF，HartmannWH，etal，Breastcancerriskassociatedwithproliferativebreastdiseaseandatypicalhyperplasia.Cancer1993;71:1258-65.29，LiCI.Ander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