專利名稱：乳腺癌風險診斷的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測癌癥的存在或者患癌癥的風險，特別是乳腺癌。
背景技術：
全球每年有超過100萬乳腺癌病例，其中美國約有50萬例，英國有4萬例，愛爾蘭有近2,000例。它是婦女患癌癥死亡的主要原因。盡管在西方世界，該病的發病率不斷增加，但是更廣泛的檢查和改善的治療手段使該病致死率逐漸下降，自1991年以來每年下降1％左右。診斷為早期乳腺癌的患者具有90％以上的5年相對生存率，而被診斷為遠處轉移的乳腺癌患者中，該比例只有20％。但是，對于乳腺癌來說還沒有權威的早期篩選測試，當前所進行的診斷是依據乳房X線照相術(mammography)和細針活檢(fine needle biopsy)的結果。乳房X線照相術有其局限性，超過80％的疑似結果為假陽性，而10～15％患有乳腺癌的婦女提供假陰性結果。常常腫瘤發展到晚期才檢測出來，減少了患者生存的機會，增加了醫療系統的治療和管理成本。更靈敏的方法需要檢查微小的(直徑＜2cm)早期乳房原位癌瘤，以減少患者的死亡率。除了早期檢查外，在疾病的惡性或良性的分類、已知癌癥的時期判斷和腫瘤類型的區分方面也都有嚴重的問題。最后，還需要監測正在進行治療的效果，以及識別對特定療法產生抗性的患者。由于乳腺是少數幾個在成年生活中(特別是在妊娠、哺乳和萎縮(involution)期間)會有顯著形態和功能變化的器官之一，常會導致同一乳腺在不同時間的分子特征發生變化，這進一步使檢測過程復雜化。
疾病診斷常常通過仔細檢測少數生物標記的相對水平來進行。盡管近來技術不斷進步，目前生物標記對患者護理和臨床結果的貢獻仍然有限。這是由已有標記的診斷靈敏度和疾病特異性低所致。然而有一些分子生物標記正常規地用于疾病診斷中，例如前列腺特異性抗原用于前列腺癌的篩選，以及新的候選標記正在以不斷增長的速度被發現(Pritzker，2002)。人們逐漸相信，使用一組非常有效的生物標記可提高試驗的陽性預測值，使假陽性或假陰性達到最小(Srinivas et al.，2002)。另外，現在對神經網絡的研究逐漸增多，它為我們顯示了這樣的前景將來自各生物標記的微弱但獨立的信息結合起來，生成預后/預測指數，該指數比各單獨的生物標記更具有情報價值(Yousef et al.，2002)。
由于有更多的分子信息可以對照，諸如乳腺癌之類的疾病正在根據與患者結果相關的遺傳特征進一步細分，這為醫師提供了有價值的信息。分子醫學中出現的新技術已經在區別常規病理標準無法識別的疾病亞類方面(Sorlie et al.，2001)，以及識別與癌演進相關的特定遺傳事件方面(Srinivas et al.，2002)顯示了威力。更多的組織需要被平行處理，這涉及到不同性別和種族之間生物標記的有效性，因而極有必要對各種人群進行大規模篩選。
通過使用新標記，可使對乳腺癌的治療水平進一步提高，該標記正常情況下只在乳房中表達，但在患病時可在身體其他部位發現。對該疾病有活性的預測物也對治療該疾病具有應用價值，特別是那些可以預測原位導管癌是否可以發展成浸潤性導管癌的預測物。

發明內容
根據本發明的第一方面，一種檢測患者存在癌癥或者有患癌癥風險的方法，包括如下步驟(i)分離患者基因組樣本；(ii)檢測是否存在或表達本發明中的SEQ ID NO.1序列或其互補序列中所包含的基因，其中存在或表達所述基因表明存在癌癥或者有患癌癥的風險。
根據本發明的第二方面，一種分離的多核苷酸，包括本發明中的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的核苷酸序列，或其互補序列，或者至少15個連續核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸可在嚴格雜交條件下與所述序列(或其互補序列)雜交。
根據本發明的第三方面，一種分離的肽，包括本發明中的SEQ IDNO.3的序列，或者它的至少10個連續氨基酸殘基的片段。
根據本發明的第四方面，一種抗體對上述肽具有至少10-6M的親和力。
根據本發明的第五方面，一種可與SEQ ID NO.1的序列中所包含的內源基因雜交，或者以其他方式抑制所述基因表達的多核苷酸，用于制備治療癌癥，特別是乳腺癌的藥物。


本發明參照附圖進行敘述，其中圖1顯示測定在不同組織中是否存在所研究基因的篩選實驗結果，T代表腫瘤組織cDNA，M代表來自相同供體的同時切下的乳房組織cDNA；圖2顯示為了測定在不同組織樣本中所研究基因的表達而進行的表達分析結果。
具體實施例方式
本發明依靠識別癌癥患者，特別是乳腺癌、子宮癌或睪丸癌患者中所表達的基因。在取自患者的樣本中識別出該基因(或其表達產物)說明患者存在癌癥或者有患癌癥的風險。
本發明進一步涉及可用于癌癥的檢測、診斷、監測、預測、預防、成像、治療或確定癌癥誘因的試劑，如多肽序列。
本發明特別適于檢測子宮癌、睪丸癌或乳腺癌，尤其是ERα-陽性腫瘤。
進行診斷的方法可包括從試樣中的mRNA合成cDNA，擴增cDNA上的相應于該基因或其片段的適當的部分，并檢測擴增產物作為該組織中存在該疾病的標志，或者檢測包含基因序列的mRNA的翻譯產物作為存在該疾病的標志。
可用試劑包括多肽或其片段，所述多肽或其片段可用于診斷方法(如RT-PCR、PCR或雜交檢測)中，所述檢測對象可為從活檢組織、血液或其他試樣中提取的mRNA；或者作為該mRNA翻譯產物的蛋白質；或者針對這些蛋白質的抗體。這些試驗還包括根據體內可能的翻譯后修飾檢測基因產物(蛋白)的方法，所述翻譯后修飾包括與諸如輔因子、抑制劑、激活劑和形成亞基復合體的其他蛋白質等分子相互作用。
癌癥相關基因包含于如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列中。推測的編碼區如SEQ ID NO.2所示。該基因的表達產物被SEQ ID NO.3識別。識別該基因或其表達產物可利用已知的用于檢測或鑒定多核苷酸或多肽的技術進行。例如，從患者中分離的遺傳物質可使用可與靶基因特異性雜交的短寡核苷酸探測。寡核苷酸探針可被可檢測地標記，例如使用熒光團，以便探針一旦與靶基因雜交即可被檢測。或者，該基因或其部分，可使用聚合酶鏈反應擴增，仍使用標記的寡核苷酸識別擴增產物。
結合該基因，或相關蛋白或抗體的診斷方法包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR)反轉錄PCR(RT-PCR)實時PCR原位雜交DNA斑點印跡免疫組織化學核糖核酸酶保護測定cDNA陣列技術ELISA排布于固體支持物如玻璃或陶瓷上、可用于結合研究的蛋白、抗原或抗體陣列。
小干擾RNA功能測定。
以上所有技術均為本領域技術人員所公知。
另一檢測方法是使用本領域中被稱為“分子信標(Molecularbeacon)”的技術。分子信標是被設計成用來檢測和定量靶核酸的寡核苷酸。該寡核苷酸通常包括自雜交部分，在缺少靶核酸時可形成莖環結構。熒光部分和猝滅劑部分附著于寡核苷酸的每一端，當寡核苷酸處于莖環取向時兩者的位置相鄰。在這種取向時熒光被猝滅劑有效阻止。寡核苷酸的環部分與特異性靶核酸互補，如果靶標存在，與靶標的雜交可破壞莖環取向，使熒光素與猝滅劑分開，導致可檢測熒光的增加。使用分子信標法檢測基因序列公開于美國專利6548254。
本發明還涉及一種分離的多核苷酸，包括SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2的序列，或其互補序列，或者它們的包括至少15個連續核苷酸，優選30個核苷酸，更優選至少50個核苷酸的片段。與以上限定的多核苷酸雜交的多核苷酸，也在本發明的范圍之中。雜交通常在嚴格條件下進行。嚴格的雜交條件為技術人員所熟知，選擇此條件是為了減少非互補雜交的可能性。適當條件的實例公開于Nucleic AcidHybridisation，A Practical Approach(B.D.Hames and S.J.Higgins，editors IRL Press，1985)。更具體地說，嚴格的雜交條件包括在42℃下，在包括下列成分的溶液中過夜培育50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(ph7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μl/ml變性的、剪切過的蛙魚精子DNA，隨后在65℃下用0.1×SSC洗滌。
識別該基因使得可以開發新療法，其中該基因作為治療分子的靶標。例如，現在有很多已知的分子已經用于開發基因療法，以靶向和阻止特定基因的表達。一種特殊分子是小干擾RNA(siRNA)，它通過刺激靶mRNA的降解來抑制特定靶蛋白的表達。還知道另一種合成寡核苷酸，它可結合所研究的基因(或其調控元件)以改變表達。與DNA相連的肽核酸(PNA)(PNA-DNA嵌合體)也顯示了強誘餌(decoy)活性，可改變所研究基因的表達。這些分子可用于結合基因或其上游調控元件，阻止表達。
本發明還涉及所研究基因的分離的多肽產物。本發明的分離多肽包括SEQ ID NO.3的序列，或者它的至少10個連續氨基酸，優選至少15個連續氨基酸，更優選至少20個氨基酸的片段。這些多肽可用于制備抗體，或者開發可在體內與蛋白結合以抑制其活性的蛋白結合分子。
本發明還包括針對本發明多肽的抗體。抗體對于多肽通常具有至少10-6M，更優選10-9M，最優選至少10-11M的親和力。抗體可為任何適當類型，包括單克隆抗體或多克隆抗體。還包括可測定試樣中存在多肽抗原的檢測試劑盒。在一個實施方案中，檢測試劑盒包括裝有抗體的容器，所述抗體與抗原特異性結合，其中抗原包括由本發明的基因編碼的至少一個表位。這些試劑盒可進一步包括帶有用于收集試樣如血液、唾液、尿液和糞便等的工具的容器。這些工具包括用于收集和穩定血液的刺血針、吸收紙或布，收集和穩定唾液的拭子，收集和穩定尿液和糞便樣本的杯子。抗體可附著于固相上，例如玻璃或陶瓷表面。
還可以檢測可與抗原特異性結合的抗體是否存在于懷疑含有這些抗體的試樣中。該檢測方法包括將試樣與含有至少一個該基因表位的多核苷酸接觸。接觸進行的時間和條件應足以使抗原/抗體復合物形成。該方法需要進一步檢測復合物，該復合物中包含所述多肽。該多肽復合物可通過重組或合成制備，或者從天然來源純化。
在本發明一個單獨的實施方案中，針對抗原的抗體或其片段可用于檢測患者中抗原的成像定位，以用于檢測或診斷疾病或病情的目的。這些抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體，或者通過分子生物學技術制備，并且可使用多種可檢測試劑標記，包括但不限于放射性同位素。
在進一步的實施方案中，抗體或其片段，不管是單克隆抗體或是多克隆抗體或者通過分子生物學技術制備的抗體，可用作治療通過本發明基因的表達所鑒定的疾病的治療劑。抗體可以非衍生形式使用，或者它可使用細胞毒素劑如放射性同位素、酶、毒素、藥物、前藥等衍生。
術語“抗體”廣義上指任何免疫結合試劑，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗體還指具有抗原結合區的任何抗體樣分子，包括但不限于抗體片段如單區抗體(single domain antibody，DABS)、Fv、scFv等。制備和利用各種基于抗體的構建體和片段的技術已為本領域所公知。
如果需要，本發明的癌癥篩選方法可與其他方法容易地結合，以提供更加準確的診斷或預后標志，因而可提供多標記測試。
以下實施例參照附圖用來說明本發明的內容。
實施例利用非同位素差異顯示(DDRT-PCR)，從來自乳腺癌患者匹配臨床樣本的cDNA群中分離到許多差異表達基因片段。這些片段之一(本文稱為DD11)顯示出在來自許多供體的乳房腫瘤組織樣本中顯著上調。本文將詳細敘述這個新分子標記的表達曲線，其全長以及相應推定的蛋白序列。
材料和方法在來自相同供體的正常乳房組織和腫瘤組織配對之間進行差異基因表達。在完全滿足道德要求和征得患者同意的前提下，從英國彼得伯勒Pathlore獲得組織樣本。在手術摘除腫瘤之后，收集一個腫瘤組織樣本，同時收集與之相鄰的、一起切下的正常組織。分別利用DynaldT18標記的Dynabeads和SuperscriptII反轉錄法提取信使RNA并隨后合成cDNA。采用差異顯示反轉錄PCR(DDRT-PCR)觀察這些匹配樣本基因表達曲線的差異，將顯示上調或下調的單基因轉錄物分離出來并進一步研究。
差異顯示反轉錄PCR(DDRT-PCR)首先由Liang和Pardee(1992)記載，它使用來自兩個或更多生物樣本的mRNA作為模板，通過反轉錄使用3個可能的錨定引物之一進行代表性cDNA合成。3個亞群使用相應的錨定引物與80個隨機13體引物之一一起分別進行PCR擴增。這個引物組合的數量據估計可代表mRNA群中96％的表達基因(Sturtevant，2000)。對每一套引物，這種對群的細分導致在真核細胞中表達的估計達12,000～15,000種mRNA，通過第二鏈cDNA合成的末端減少到100～150種轉錄物。這有助于在聚丙烯酰胺凝膠上進行平行電泳分離和匹配成套引物的準確顯影，導致可以識別在一種組織樣本中表達而不在另一種組織樣本中表達的基因片段。
切除并重新擴增所研究的片段之后通過反向DNA斑點印跡除去假陽性。這需要將每一重新擴增的片段點樣至兩張尼龍膜上(HybondN+，Amersham Pharmacia Biotech)，并將其與所述片段的供體的腫瘤或正常組織cDNA群雜交。然后將確定為差異表達的片段直接測序，即不經克隆，隨后檢索網絡數據庫以確定每條基因是否為新發現的。無法匹配已知基因的片段被看作有可能代表它們的來源——乳腺癌的新標記。各轉錄物的進一步篩選利用來自多個乳房腫瘤供體的一套匹配cDNA群，通過半定量RT-PCR或實時PCR進行。在所有情況下，β-肌動蛋白用作組成型參照基因，以校準cDNA模板并在PCR過程中作為內部陽性對照。通過在校準的模板上使用基因特異性成套引物來表達每個假定的新標記基因。新基因片段的全長轉錄物，包括開放讀碼框(編碼該蛋白的那段基因)隨后使用被稱為5′RACE(cDNA末端快速擴增)的復合物法合成，該方法包含基因特異性延伸和擴增，可由測序驗證。
針對來自非乳房組織，包括腦、心臟、淋巴細胞、脾、腎、睪丸和肌肉(來自Origene)的cDNA群，使用來自各新標記的基因特異性引物來測定組織特異性。使用來自更廣泛的一組22種人類組織類型的cDNA群進一步測定DD11分子標記。它們如下所示腎上腺 由62供體匯集骨髓由7供體匯集腦，小腦由24供體匯集腦，全部由1供體匯集結腸*由1供體匯集胎兒腦 由59供體匯集胎兒肝臟由63供體匯集心臟由1供體匯集腎臟由1供體匯集肝臟由1供體匯集肺 由1供體匯集胎盤由7供體匯集前列腺 由47供體匯集唾液腺 由24供體匯集骨骼肌 由2供體匯集小腸*由1供體匯集脾 由14供體匯集睪丸由19供體匯集胸腺由9供體匯集甲狀腺 由65供體匯集氣管由1供體匯集子宮由10供體匯集特別說明的是這些樣本多數是人總RNA組II(Clontech)的一部分，但是標有星號的兩個樣本是以組織塊(tissue chunk)形式獲自Pathlore(Peterborough Hospital Tissue Bank)，并在RandoxLaboratories Ltd處理。
另外還在道德允許的人類腫瘤樣本范圍內進行實驗，實驗方法如獲自Pathlore的所述。代表來自卵巢、睪丸、胃、肝臟、肺、膀胱、結腸和胰腺的腫瘤的cDNA通過實時PCR針對β-肌動蛋白和DD11進行實驗。
與新標記表達分析一起，對每一乳房組織配對還進行分子特征分析。這需要針對每種組織cDNA在半定量RT-PCR中使用對多種已公開的乳腺癌分子標記具有特異性的成套引物。測定各分子標記之間的關系，對每一樣本列成表格用作參照，新標記可與之相比。這樣做的目標是對腫瘤類型進行細分，以使新型標記與這些亞類相聯系，大大提高診斷標記的效力。
結果和討論來自乳腺癌供體匹配組織cDNA的一個稱為DD11的基因片段，使用差異顯示觀察到在腫瘤cDNA群中與相應正常組織cDNA相比顯著上調。該產物通過反向DNA斑點印跡證實為差異表達。序列分析后檢索數據庫證實DD11分別與EMBL和SWISSPROT數據庫中的已知基因或蛋白均不同源，因此看作可能為新標記。然而它在除去poly-A尾巴之后，與來自人類基因組8號染色體的克隆(RP11-875011)(檢索號AC107959)100％同源。
該片段使用來自其他患者捐獻的多個匹配乳房腫瘤組織的cDNA群進一步篩選。在篩選的供體樣本中，9個中有6個顯示表達顯著增加，證實了DD11為存在乳房腫瘤的推定的分子標記(圖1)。該分析結果通過對所有當前可用的匹配乳房組織樣本進行分子特征分析可證實，如下腫瘤中增長 10 52.6％正常情況下增長 15.3％無可辨別差異736.8％無明顯表達 15.3％總計19 100％為了幫助進一步分析，采用5′-RACE將該片段延長至包括該基因的全部開放讀碼框(ORF)，加上任何5′非編碼序列。使用該技術，獲得了推測的513個核苷酸的全長產物(SEQ ID NO.1)，隨后進行數據庫檢索證明前述的與人類8號染色體的同源性為在全長序列(513/513)上的100％同源性。從該序列中，產生了所有6氨基酸的讀碼框并且在+2框中發現了推測的小ORF(SEQ ID NO.2)，包含47個氨基酸，包括終止密碼子(SEQ ID NO.3)。這個小蛋白與SWALL數據庫中的任何已知蛋白均不顯示高同源性，所以被認為是新的。
為了測定器官特異性，除了來自乳腺癌供體的成對cDNA外，還對來自8種非乳房人體組織的cDNA群針對DD11引物進行了測定。還利用來自組成型持家基因β-肌動蛋白的引物對相同的樣本進行測定，作為陽性對照并校準半定量PCR分析的模板。β-肌動蛋白產物在所研究的所有cDNA群中均強烈擴增，而DD11產物只在乳房腫瘤樣本中檢測到(圖2)。這為該基因可能是存在乳房腫瘤的極強分子標記提供了另一個證據。
該分子標記通過常規和實時PCR分析，利用來自一組22種人體組織類型的cDNA群進一步測試。在所有測試之中，使用Opticon II實時熱循環儀(MJ Research)，只在來自胎盤和睪丸的樣本檢測到DD11。另外，還對道德上允許的人體腫瘤樣本范圍進行實驗，方法如獲自Pathlore的所述，以確定該標記是乳房腫瘤特異性還是特異性較差的腫瘤標記。代表來自卵巢、睪丸、結腸、胃、肝臟、肺、膀胱和胰腺的腫瘤的cDNA針對β-肌動蛋白和DD11進行實驗。它們之中，DD11只在來自睪丸腫瘤的cDNA中檢測到有顯著水平。這些PCR擴增所得產物通過直接測序確定為DD11。
使用相結合的一組22種正常人體組織cDNA和8種腫瘤cDNA群，在標準熱循環儀上進行常規PCR擴增，證實DD11對非常有限的組織類型具有特異性。在實時PCR測試中，睪丸cDNA群表達DD11，這和睪丸腫瘤一樣。顯示出顯著表達該標記的唯一一種其他群來自子宮樣本。胎盤樣本顯示出低水平表達，但這與睪丸和子宮樣本根本不在一個級別。還在其他一些樣本中發現了低水平產物，但這些可忽略不計。這說明在所有測試樣本中，DD11只在受生殖激素影響的組織中強烈表達。具體地說，這些組織來自乳房和相關腫瘤、睪丸和相關腫瘤以及子宮。胎盤組織也更小程度地表達這種標記。
DD11與最常用作“標準”乳腺癌標記的一些標記，如雌二醇受體(ERα)和人表皮生長因子受體(c-ErbB-2)相比，是極為有利的。這在以下兩方面都是顯而易見的一是對所有匹配乳腺癌組織樣本進行分子特征分析，其中在許多情況下來自相同患者的兩個樣本有相似的表達；二是使用針對一組來自人體正常和腫瘤組織的內部30個cDNA群的靶特異性引物。
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1.一種檢測患者存在癌癥或者有患癌癥風險的方法，包括如下步驟(i)分離患者基因組樣本；(ii)檢測是否存在或表達本發明中的SEQ ID NO.1序列所包含的基因，其中存在或表達所述基因表明存在癌癥或者有患癌癥的風險。
2.根據權利要求1的方法，其中所述基因是SEQ ID NO.2的基因。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述基因組樣本取自乳房組織、子宮或睪丸。
4.根據以上任一權利要求的方法，其中所述癌癥為乳腺癌。
5.根據以上任一權利要求的方法，其中所述檢測通過使用聚合酶擴增所述基因進行。
6.一種分離的多核苷酸，包括本發明中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列，或其互補序列，或者至少15個連續核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸可在嚴格雜交條件下與所述序列(或其互補序列)雜交。
7.根據權利要求6的分離的多核苷酸，其中所述序列是SEQ IDNO.2的序列。
8.根據權利要求6或7的多核苷酸在體外診斷分析患者患癌癥的風險中的應用。
9.根據權利要求8的應用，其中所述癌癥為乳腺癌。
10.一種肽，包括本發明中的SEQ ID NO.3的序列，或者它的至少10個連續氨基酸殘基的片段。
11.一種抗體，對權利要求10的肽具有至少10-6M的親和力。
12.一種可與包含權利要求6或7的多核苷酸的內源基因雜交，或者抑制所述基因表達的第二多核苷酸在制備治療癌癥，特別是乳腺癌的藥物中的應用。
13.根據權利要求12的應用，其中所述基因包括權利要求7的多核苷酸。
全文摘要
本發明公開了一種用于預測癌癥風險，特別是乳腺癌風險的診斷方法。該方法包括(i)分離患者基因組樣本；(ii)檢測是否存在或表達本發明中的SEQ ID NO.1的序列所包含的基因，其中存在或表達所述基因表明存在癌癥或者有患癌癥的風險。
文檔編號C12Q1/68GK1846001SQ200480025367
公開日2006年10月11日 申請日期2004年9月2日 優先權日2003年9月3日
發明者M·A·克羅克德, J·R·貝利, J·V·拉蒙特, S·P·菲茨杰拉德 申請人:蘭多克斯實驗室有限公司