一組評估乳腺癌風險的突變基因群及其檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一組可用于乳腺癌風險評估的突變基因群及其檢測試劑盒，所述突變基因群是包含以下七條基因的突變基因的集合，所述七條基因是：BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因和CDH1基因，所述七條基因的突變基因中總攜帶25個突變位點，該突變位點如表3所示。本發明還公開了一種評估乳腺癌風險的突變基因群的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括：檢測本發明所述的突變基因群中的突變基因的探針或引物。本發明提供的評估乳腺癌風險的突變基因群的檢測試劑盒具有檢測效率高，檢測速度快，檢出率高等優點。
【專利說明】一組評估乳腺癌風險的突變基因群及其檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一組評估乳腺癌風險的突變基因群及其檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]遺傳性乳腺癌最常見病因是BRCAl和BRCA2基因的突變，目前已證實對突變攜帶者的早期診斷和預防性干預能提高乳腺癌的生存率。但BRCA1/2基因突變只能解釋一小部分遺傳性乳腺癌的病因，其它在乳腺癌的遺傳病因中扮演重要角色的高顯性基因還包括TP53、PTEN和⑶Hl等，另外還有很多中顯性和低顯性基因也能導致遺傳性乳腺癌。
[0003]在臨床上，很多以乳腺癌為先證者的腫瘤家系中，往往合并各種不同的惡性腫瘤，而不僅僅是乳腺癌和卵巢癌。同時乳腺癌與很多其它遺傳性腫瘤綜合癥的相關性仍不明確，在很多不以乳腺癌為主要表型的遺傳性腫瘤綜合癥中也經常會出現乳腺癌患者(例如:MMR基因)。因此在傳統的腫瘤遺傳咨詢中，在基因檢測前先根據先證者以及家族史中腫瘤的不同類型和特征來劃分不同的遺傳性腫瘤綜合癥，然后進行相關基因的突變檢測以明確病因。這種方法便于確定高危人群，明確易感基因，提高了檢測效率，但同樣有可能出現遺漏。目前在中國尚沒有成熟的腫瘤遺傳咨詢系統，同時也缺少相關的系統性研究。
[0004]近年來高通量測序技術的飛速發展使同時對多個特定的基因進行序列測定和突變檢測成為可能，同時其成本與傳統測序技術中單個基因的序列測定相當。然而，如何應用高通量測序技術進行胚系突變的檢測對不同家族史中惡性腫瘤類型做出限定，特別是針對亞洲人群和中國人群中家 族型乳腺癌易感基因方面的研究非常有限。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是針對目前評估乳腺癌患病風險的方法較為局限，特別是針對亞洲人群和中國人群中家族型乳腺癌易感基因突變體與乳腺癌患病風險之間關系的研究非常有限的問題，提供了一組評估乳腺癌風險的突變基因群及其檢測試劑盒。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一為:一組評估乳腺癌風險的突變基因群，所述突變基因群是包含以下七條基因的突變基因的集合，所述七條基因是:BRCAl基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因和CDHl基因。
[0007]本發明所述突變基因群是由攜帶突變位點的基因組成。其中所述突變位點為本領域常規的突變位點，較佳地包括indel突變位點(插入或缺失引起的序列改變insertionor deletion, indel)、無義突變位點、拼接區突變位點或錯義突變位點,更佳地本發明所述七條基因的突變基因中總攜帶25個突變位點，該突變位點如表3所示。上述突變位點可以用本領域常規的測序方法檢測，所述測序方法較佳地為一代測序方法或二代測序方法，優選地為二代測序方法。
[0008]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二為:一組評估乳腺癌風險的突變基因群，所述突變基因群是包含以下二十二條基因的突變基因的集合，所述二十二條基因是:BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因、CDHl基因、PALB2 基因、FANCD2 基因、FANCI 基因、SLX4 基因、RAD51C 基因、RAD50 基因、CDKN2A 基因、CYP17AI 基因、RGSLI 基因、FGFR3 基因、WRN 基因、UGTIA4 基因、TNFRSF13B 基因、MUTYH 基因和SPINKl基因。
[0009] 較佳地，所述二十二條基因的突變基因中總攜帶41個突變位點，該突變位點如表4所示。
[0010]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三為:一種乳腺癌突變基因，所述乳腺癌突變基因的核苷酸序列是表5所示的22個攜帶突變位點的基因中的任意一個。
[0011]本發明所述乳腺癌突變基因是指攜帶有突變位點的基因，所述攜帶突變位點的突變基因如表5所示。
[0012]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之四為:一種評估乳腺癌風險的突變基因群的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括:檢測如本發明所述的突變基因群中的突變基因的探針以及用于二代測序的試劑。
[0013]本發明提供一組檢測本發明所述突變基因群的探針，所述探針是包含能夠與本發明所述突變基因群中的全部突變基因發生雜交反應的探針的集合。利用本發明提供的探針，結合二代測序技術，能夠檢測本發明所述突變基因群中的全部突變基因。
[0014]本發明所述的探針為本領域常規的探針,所述探針較佳地為帶有示蹤物(或標記物)的寡聚核苷酸片段，只要該探針能與本發明所述的突變基因群中的突變基因雜交即可。本發明所述探針的制備方法為本領域常規制備方法，所述探針的制備方法較佳地包括:采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)或其他適宜方法純化即得。本發明所述探針的設計方法優選地為:選取待測基因的外顯子編碼區以及側翼的部分內含子區域，利用 Agilent Sureselect XT Custom Kit (700Kb_34Mb)設計探針。
[0015]其中所述用于二代測序的試劑為本領域常規使用的試劑，只要能夠滿足對所得序列進行二代測序的要求即可。所述試劑制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為市售可得。
[0016]本發明所述的檢測試劑盒更佳地還包括將從檢測對象中提取的基因組DNA制成可供測序使用的文庫的試劑。
[0017]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之五為:一種評估乳腺癌風險的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括:擴增本發明所述的突變基因群中突變基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID N0:96所示。
[0018]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之六為:一種評估乳腺癌風險的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括:擴增本發明所述的突變基因群中突變基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 152所示。
[0019]本發明提供一組檢測本發明所述突變基因群的引物，所述引物是能夠擴增出本發明所述突變基因群中的全部突變基因的引物的集合。利用本發明提供的引物，結合一代測序技術，能夠檢測本發明所述的突變基因群中的全部基因突變。
[0020]本發明所述引物只要能與本發明所述突變基因群中的突變基因部分序列互補，并擴增出本發明所述突變基因群中的突變基因即可，本發明所述引物的序列較佳地為:如序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO: 152 所示。[0021]本發明所述引物的制備方法為本領域常規的制備方法，較佳地為人工合成全序列。
[0022]本發明所述檢測試劑盒較佳地還包括:dNTP溶液，DNA聚合酶，用于核酸分離或純化的試劑，陽性對照或陰性對照。
[0023]本發明所述的用于核酸分離或純化的試劑更佳地為抽提所述檢測對象中的基因組DNA的試劑，所述試劑較佳地包括:蛋白酶、飽和酚、氯仿:異戊醇(24:1)、醋酸鈉、無水乙醇、70%乙醇、TE溶液等，優選地利用Qiagen公司生產的DNA抽提試劑盒來提取血漿中的DNA以及其它任何可以用于進行DNA提取的試劑或容器。
[0024]本發明所述的陽性對照為本領域常規的陽性對照，較佳地為包含本發明所述突變基因群中突變基因序列的基因組DNA儲備液或包含相應突變基因群中突變基因序列的質粒作為陽性對照。
[0025]本發明所述的陰性對照為本領域常規的陰性對照，較佳地為源于健康人經確認不包含突變基因序列的野生型基因組DNA序列儲存液。
[0026]本發明所述的檢測試劑盒，更佳地還包括從檢測對象或腫瘤患者體內提取組織或血液的器械，所述器械較佳地包括:任何能用于取血的釆血針、注射器等。
[0027]本發明所述的檢測樣本較佳地為來自檢測對象的組織,只要能從檢測樣本中抽提檢測對象的基因組DNA即可。所述檢測樣本較佳地為血液、血漿、組織樣本和體液中的一種或幾種，更佳地為血液或組織樣本，優選地為血液。
[0028]一種本發明所述 檢測試劑盒的使用方法，其包括以下步驟:
[0029](I)利用本發明所述檢測試劑盒抽取檢測對象外周血提取基因組DNA ；
[0030](2)將所得基因組DNA制成可供雙端短序列測序、單端長序列測序或單端短序列測序的文庫；
[0031](3)對步驟⑵所得DNA測序文庫進行測序即得。
[0032]其中步驟(1)所述的抽取檢測對象外周的方法為本領域常規方法，較佳地為利用檢測試劑盒中的采血針抽取檢測對象5ml外周血提取基因組DNA。
[0033]其中所述提取基因組DNA的方法為本領域常規提取基因組DNA的方法，較佳地為利用Qiagen公司生產的DNA抽提試劑盒來提取血漿中的DNA(產品號為57704)。
[0034]其中步驟(2)所述文庫的構建方法為本領域常規的文庫構建方法，所述文庫的構建方法較佳地包括以下步驟:
[0035]將提取的基因組DNA末端補平并進行5’端磷酸化，將30 μ 1DNA、45 μ I純水、
10μ I 具有 IOmM ATP 的 T4DNA 連接酶緩沖液、4 μ I 包含 IOmM dNTP Mix、5 μ 1T4DNA 聚合酶、I μ IKlenow酶、5 μ I Τ4連接酶混合后，在20°C溫浴30分鐘(試劑來自Illumina樣本準備試劑盒PE-102-1001)，溫浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR純化試劑盒(part#28104)純化DNA。末端懸A:將上步的產物溶解在32 μ I緩沖液中，加入Klenow緩沖液5 μ 1，ImMdATPlOy K KlenowE χ ο-3 μ 1，在37°C保持30分鐘(試劑來自Illumina樣本準備試劑盒)，產物由QIAGEN MinElute PCR純化試劑盒(part#28004)連接:DNA溶解在10 μ I緩沖液中，加入DNA連接酶緩沖液2 χ 25 μ 1、PE Adapter Oligo MixlO μ 1，DNA連接酶5 μ 1，在20°C保持15分鐘(試劑為Illumina樣本準備試劑盒PE-102-1001)，溫浴后釆用QIAGENQIAquick PCR純化試劑盒(part#28104)純化DNA即得文庫。[0036]其中步驟(3)所述測序的方法為本領域常規的測序方法，較佳地為利用IlluminaHiSeq2000測序儀進行二代測序。利用試劑盒中的探針對表1所示基因捕獲目標區域的目標基因進行擴增，根據步驟(2)所制備的文庫的不同，可以對所得目標基因序列分別進行雙端短序列測序、單端長序列測序或單端短序列測序。用Illumina HiSeq2000測序儀進行雙端測序。此過程均由儀器本身自動完成。
[0037]本發明所述檢測試劑盒的使用方法較佳地還包括步驟(4)，將所得測序結果進行統計分析，利用軟件Chromas Vl.45對將所得測序結果DNA片段進行分析即得。
[0038]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0039]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0040]本發明的積極進步效果在于:利用本發明提供的可用于乳腺癌風險評估的突變基因群，結合高通量測序技術，可以實現在全基因組范圍內對與遺傳性乳腺癌相關基因進行比較研究，特別是對于評估乳腺癌的發生的風險、以及該疾病在發展過程中涉及復雜生物學過程的多基因異常改變現象具有特殊的優勢。本發明提供的用于評估乳腺癌風險的突變基因群的檢測試劑盒具有檢測效率高，檢測速度快，檢出率高等優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為第49號家系 遺傳分析圖譜。
[0042]圖2為第22號家系遺傳分析圖譜。
【具體實施方式】
[0043]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0044]實施例1中國人群遺傳性乳腺癌易感基因的篩選
[0045]材料和方法:
[0046]從2011年6月到2012年7月，在復旦大學附屬腫瘤醫院就診的乳腺癌患者中，根據以下入選標準，我們進行連續性入組。
[0047]入選標準為:乳腺癌患者發病年齡< 35歲，同時至少有一名具有血緣關系的親屬也為惡性腫瘤患者；乳腺癌發病年齡> 35歲，但< 50歲，同時至少有2名同一側(父系或母系)的具有血緣關系的親屬也為惡性腫瘤；乳腺癌發病年齡> 50歲，同時至少有3名同一側(父系或母系)的具有血緣關系的親屬也為惡性腫瘤。
[0048]通過問卷的方法收集患者的病史和家族史，并收集5ml外周血提取基因組DNA待測，該檢測經過復旦大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準。
[0049]樣本處理:樣本中基因組利用STAR DNA Blood7k Kit (購買自Hamilton,Germany)進行抽提，具體操作方法請參見該試劑盒的使用說明書。
[0050]將基因組DNA切成片段后進行建庫。選取待測基因的外顯子編碼區以及側翼的部分內含子區域，利用Agilent Sureselect XT Custom Kit (700Kb_34Mb)(該試劑盒購買自Agilent Technologies公司)設計探針對基因組DNA進行捕獲,探針的設計方法請參考該試劑盒的使用說明書。基因捕獲目標區域如表1所示:
[0051]表1基因捕獲目標區域
[0052]
【權利要求】
1.一組評估乳腺癌風險的突變基因群，其特征在于，所述突變基因群是包含以下七條基因的突變基因的集合，所述七條基因是=BRCAl基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因和⑶Hl基因。
2.如權利要求1所述的突變基因群，其特征在于，所述七條基因的突變基因中總攜帶25個突變位點，該突變位點如表3所示。
3.一組評估乳腺癌風險的突變基因群，其特征在于，所述突變基因群是包含以下二十二條基因的突變基因的集合，所述二十二條基因是=BRCAl基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因、CDHl基因、PALB2基因、FANCD2基因、FANCI基因、SLX4基因、RAD51C 基因、RAD50 基因、CDKN2A 基因、CYP17A1 基因、RGSLl 基因、FGFR3 基因、WRN基因、UGT1A4基因、TNFRSF13B基因、MUTYH基因和SPINKl基因。
4.如權利要求3所述的突變基因群，其特征在于，所述二十二條基因的突變基因中總攜帶41個突變位點,該突變位點如表4所示。
5.一種乳腺癌突變基因，其特征在于，所述乳腺癌突變基因的核苷酸序列是表5所示的22個攜帶突變位點的基因中的任意一個。
6.一種評估乳腺癌風險的突變基因群的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括:檢測如權利要求1~4中任一項所述的突變基因群中的突變基因的探針以及用于二代測序的試劑。
7.如權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括將檢測對象中抽提出的基因組DNA制成可供測序的文庫的試劑。
8.一種評估乳腺癌風險的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括:擴增權利要求I或權利要求2所述的突變基因群中突變基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO:96 所示。
9.一種評估乳腺癌風險的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括:擴增權利要求3或權利要求4所述的突變基因群中突變基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO: 152 所示。
10.如權利要求8或9所述的檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒還包括:dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分離或純化核酸的試劑，陽性對照或陰性對照。
【文檔編號】C12N15/11GK103981273SQ201410239196
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】胡震, 楊曉晨, 吳炅, 邵志敏 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院