評估發育異常或食道腺癌可能性的方法
【專利摘要】本發明涉及一種輔助評估受試者中存在發育異常或食道腺癌的可能性的方法，所述方法包括：(a)提供來自所述受試者的食管樣品，(b)測定所述樣品中(ⅰ)SLC22A18、(ⅱ)PIGR、(ⅲ)GJA12和(ⅳ)RIN2的甲基化狀態，其中，如果所述基因中的2個或更多個是甲基化的，則測定存在發育異常或食道腺癌的可能性增加。本發明還涉及一種用于同樣目的的裝置。
【專利說明】評估發育異常或食道腺癌可能性的方法

【背景技術】
[0001] 患有巴雷特食管（Barrett'sesohphagus) (BE)的患者與普通人群相比有實質上 增加的進展至食管腺癌（EAC)的風險（RR:11. 3,95%Cl:8. 8-14. 4) 1。在過去的30年間， EAC的發病率增加了 7倍（每百萬3. 6至25. 6例）2,并且由于后期表現，其預后差，具有約 11個月的生存中值3。由于當疾病局限于粘膜或子粘膜層中時已診斷患者的增加的生存 率；患有BE的患者被推薦接受內鏡監測以早期檢測癌癥4、5。內鏡檢查法患者的成本效益 和風險：效益比屢次受到了質疑，這是因為年度（每年）的進展風險相對較低1、6、7 ;根據 最近的估計約〇. 3% 8。BE和EAC之間的中間發育異常階段是進展的最可靠的標志；然而， 發育異常的病理學存在是主觀的，這是由于內鏡檢查期間的已知的抽樣偏差以及高的觀察 者間和觀察者內的差異性9、10。最近的兩項研究強調了歸類為患有低度發育異常的患者的 發展率的巨大差異。在荷蘭的研究中，患有確診的低度發育異常的個體中的高度發育異常 (HGD)或EAC的發生率為每年每患者13. 4% (95%CI3. 5-23. 2);然而在美國的研究的患 者中，此群體的進展率與非發育異常的患者相似，其是16倍的差異12。在患有高度發育異 常的患者中，隨機射頻消融（randomizedradiofrequencyablation) (RFA)干預試驗的數 據表明非治療組（arm)中19%的進展率13。因此，迫切需要一些生物標記，其可以準確地 檢測扁平巴雷特粘膜中的常見的發育異常并預測那些最可能進展至癌癥的患者。
[0002] 異常的DNA甲基化被證明是癌癥的特征，并已知這些變化發生于轉化的早期14。 大量研究已經證明在BE至EAC的進展中發生了DNA甲基化的變化，并且這些變化具有用 作生物標記的潛力15-20。這些研究大多采用基于其它癌癥中已知的甲基化靶點的候選分 析。然而，現在可利用基于高通量陣列的平臺來鑒定DNA甲基化變化，并且發明人已采用這 種方法找到了巴雷特癌變的候選生物標記。印記基因和X染色體均被DNA甲基化表觀遺傳 地控制21，但從未在EAC的生物標記方面進行具體的檢測。
[0003]Jin等人（2009CancerResearchv. 69,4112 至 4115 頁）公開了一種甲基化生物 標記的多中心、雙盲的效度研究（validationstudy)，其用于巴雷特食管的發展預測。作者 研究了 8種BE發展預測甲基化生物標記。作者研究了 145例無進展者和從巴雷特食管發 展至腫瘤的50例進展者中的甲基化。這項研究是一項回顧性研究--研究采用候選基因并 由因推果地評估其甲基化狀態。所評估的8種候選基因是P16、RUNX3、HPP1、NELL1、TAC1、 SST、AKAP12和⑶H13。作者認為，這8種標記組更客觀且可量化，并且與臨床特征如年齡的 評估相比，具有較高的預測敏感性和特異性。作者認為，他們的8種標記組以高特異性水平 準確地預測了約一半的HGD和EAC。
[0004]Kaz等人（2011Epigeneticsv. 6,1403至1412頁）公開了巴雷特食管和食管腺 癌中的DNA甲基化譜揭示了獨特的甲基化標簽（methylationsignature)和分子亞類。作 者報道了不同的總體的甲基化標簽以及特定基因的甲基化差異的發現。作者聲稱，它們的 標簽在鱗狀、BE、H⑶和EAC細胞中會有區別。作者沒有公開任何生物標記。實際上，當他 們指出"將BE從BE+H⑶和EAC中區分出來的那些CpG位點的追加的驗證可能導致發現在 BE和EAC的診斷和預后判斷中具有潛在臨床應用的有用的有用生物標記"時，作者甚至承 認了這一點。因此，此報告關注于對CpG甲基化譜的描述。特別地，研究了分散在807個基 因中的1505個CpG位點的甲基化狀態。在這一文獻中未提供生物標記或預后的具體教導。
[0005] 本發明的目的是克服與現有技術相關的問題。


【發明內容】

[0006] 發明人解決了巴雷特食管（BE)的內鏡監測的關鍵問題，并且指出了DNA甲基化變 化如何可以提高在扁平的巴雷特黏膜和組織病理學中高度發育異常和早期癌癥的檢測。
[0007] 為此，我們進行了基于高通量陣列的甲基化掃描并利用嚴謹統計方法（信噪比和 雙面Wilcoxon檢驗）在IlluminaInfinium平臺上將差異化甲基化的基因進行分級。此 夕卜，我們特別地觀察了印記的和X染色體的基因在癌癥發展的過程中發生時甲基化中的任 何變化，這是因為這些基因可能是理想的生物標記，因為在女性中已經因印記和通過X-失 活而發生了一個等位基因拷貝的生理失活。一旦我們確定了作為生物標記的候選基因，我 們將再利用焦磷酸測序法對同一樣品以及大獨立組的回顧性收集樣本中進行穩健的驗證。 這導致鑒定了 4個基因甲基化組，其可以將非發育異常的患者與發育異常的巴雷特和早期 腫瘤的患者相區分。最后，我們進一步進行了前瞻性的多中心的研究，并證明了這個組確實 具有臨床價值。因此，我們的組已完成了從發現到前瞻性評估的全部過程。
[0008] 巴雷特食管（BE)的內鏡監測存在問題，這是因為發育異常和早期腫瘤常常是不 可見的且由于抽樣偏差而錯過。分子異常性可能比發育異常更分散。因此，目的是檢測DNA 甲基化（尤其是在印記的和X-染色體的基因上）是否能夠檢測發育異常/早期腫瘤。
[0009] 我們描述了令人驚訝的穩健的一組甲基化標記，其與有用的臨床適應癥關聯。本 發明的另一個關鍵優點是利用了場效應，借此，本發明有助于克服抽樣偏差，這是因為所教 導的信息性標記發生于巴雷特病變處而不僅僅在發育異常/EAC區域（如果存在的話）。本 發明基于這些令人驚訝的發現。
[0010] 因此，在一個方面中，本發明提供了用于輔助評估受試者存在發育異常或食道腺 癌的可能性的方法，此方法包括：
[0011] (a)提供來自所述受試者的食管（esophagal)樣品
[0012] (b)測定所述樣品中下述的甲基化狀態
[0013] (i)SLC22A18,
[0014] (ii)PIGR,
[0015] (iii)GJA12 和
[0016] (iv)RIN2
[0017] 其中，如果所述基因中的2個或更多個是甲基化的，則測定存在發育異常或食道 腺癌的增加的可能性。
[0018] 在一個實施方式中，適當地，步驟（a)包括從所述樣品中提取核酸如DNA。
[0019] 在一個實施方式中，適當地，步驟（b)包括將所述樣品與引物接觸并測定甲基化。 可以通過例如MSP或焦磷酸測序來測定甲基化。
[0020] 適當地，方法進一步包括測定（V)TCEAL7的甲基化狀態。
[0021] 適當地，如果所述受試者是男性，方法進一步包括測定（vi)RGN的甲基化狀態。
[0022] 適當地，發育異常是高度發育異常（HGD)。
[0023] 在另一個方面中，本發明涉及一種評估特定受試者的風險的方法，其包括實施如 上所述的方法，其中，如果所述基因中的〇個或1個是甲基化的，則測定具有低風險，如果所 述基因中的2個是甲基化的，則測定具有中度風險，如果所述基因中的3個或更多個是甲基 化的，則測定具有商風險。
[0024] 根據本發明的方法的結果，可以對受試者進行交替治療（alternatetreatment)。
[0025] 例如，當受試者根據本發明被鑒定為低風險時，可能規定在較長的時間間隔如3 至5年對受試者進行監測。
[0026] 當受試者根據本發明被分類為中度風險時，可能規定對受試者進行更頻繁的隨訪 (更頻繁的監測）。例如，可能規定在縮短的時間間隔如1至2年對受試者進行監測。
[0027] 當受試者根據本發明被分類為高風險時，可能規定對受試者進行干預。例如，可以 規定對受試者進行射頻消融。這一過程遠比食管切除更輕微且更少地侵入。因此，本發明 能夠將更輕微且更少侵入的治療分配給根據本發明的屬于高風險分類的患者。
[0028] 為了進行比較，目前英國的準則是，如果患者存在3cm或更長的巴雷特食管段，規 定在約2至3年的時間間隔下對其進行監測。因此，可以理解的是，本發明通過延長低風險 患者的監測時間間隔而節省了監測成本，并且還通過允許在高風險患者的早期階段進行干 預而改善了結果。
[0029] 適當地，甲基化狀態通過焦磷酸測序來測定。
[0030] 適當地，通過使用選自補充表5中的一種或多種測序引物進行所述焦磷酸測序。
[0031] 適當地，通過測定每個所述基因的甲基化百分數并將數值與如下的甲基化取舍點 (cutoff)百分比相比較來對甲基化狀態進行評分：

【權利要求】
1. 一種用于輔助評估受試者存在發育異常或食道腺癌的可能性的方法，所述方法包 括： (a) 提供來自所述受試者的食管樣品 (b) 測定所述樣品中下述的甲基化狀態 (i)SLC22A18, (ii)PIGR, (iii)GJA12 和 (iv)RIN2 其中，如果所述基因中的2個或更多個是甲基化的，則測定存在發育異常或食道腺癌 的增加的可能性。
2. 如權利要求1所述的方法，其中方法進一步包括測定（V)TCEAL7的甲基化狀態。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中如果所述受試者是男性，則方法進一步包括測定 (vi)RGN的甲基化狀態。
4. 如權利要求1至3任一項所述的方法，其中發育異常是高度發育異常（HGD)。
5. -種評估特定受試者的風險的方法，其包括實施上述權利要求任一項所述的方法， 其中如果所述基因的〇個或1個是甲基化的，則測定為低風險，并且如果所述基因的2個 是甲基化的，則測定為中度風險，如果所述基因的3個或更多個是甲基化的，則測定為高風 險。
6. 如前述權利要求任一項所述的方法，其中通過焦磷酸測序測定甲基化狀態。
7. 如權利要求6所述的方法，其中使用選自補充表5中的一種或多種測序引物進行所 述焦磷酸測序。
8. 如前述權利要求任一項所述的方法，其中通過測定每個所述基因的甲基化百分數并 將數值與下列甲基化取舍點百分比相比較來對甲基化狀態進行評分：
其中基因的數值超過所述基因的甲基化取舍點百分比則評估為"甲基化的"。
9. 一種裝置或系統，其 (a) 被配置以分析來自受試者的食管樣品，其中所述分析包括 (b) 測定所述樣品中如下的甲基化狀態 (i)SLC22A18, (ii)PIGR, (iii)GJA12 和(iv)RIN2, 所述裝置或系統包括輸出模塊， 其中，如果所述基因中的2個或更多個是甲基化的，則測定存在發育異常或食道腺癌 的增加的可能性。
10. 如權利要求9所述的裝置，其中分析進一步包括測定（V)TCEAL7的甲基化狀態。
11. 如權利要求9或10所述的裝置，其中如果所述受試者是男性，則分析進一步包括測 定（vi)RGN的甲基化狀態。
12. 如前述權利要求任一項所述的方法、分析、裝置或系統，其中所述樣品包含冷凍生 檢材料。
13. -種用于輔助評估受試者存在發育異常或食道腺癌的可能性的方法，方法包括 (a) 提供來自所述受試者的食管樣品 (b) 測定所述樣品中如下的甲基化狀態 (i)SLC22A18, (ii)PIGR, (iii)GJA12 和(iv)RIN2 ； 將（b)的甲基化數值與參考標準相比較， 其中，如果所述基因中的2個或更多個的甲基化水平比參考標準更高，則測定存在發 育異常或食道腺癌的增加的可能性。
14. 如權利要求13所述的方法，其中所述參考標準來自患有巴雷特食管但沒有患有發 育異常或食道腺癌的受試者。
15. 如權利要求13或14所述的方法，其中所述參考標準包含柱狀上皮如巴雷特食管或 十二指腸。
16. 如權利要求13至15任一項所述的方法，其中方法進一步包括測定（V)TCEAL7的 甲基化狀態。
17. 如權利要求13至16任一項所述的方法，其中如果所述受試者是男性，則方法進一 步包括測定（vi)RGN的甲基化狀態。
18. -種可操作的計算機程序產品，當在計算機上執行時，其執行權利要求1至8或13 至17任一項所述的方法步驟。
19. 一種基本上如本文所述的方法、分析、裝置或系統。
【文檔編號】C12Q1/68GK104508147SQ201380038430
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年5月17日 優先權日:2012年5月18日
【發明者】麗貝卡·菲茨杰拉德, 穆罕默德·阿爾維, 新學·劉 申請人:醫藥研究委員會