專利名稱：：用lna修飾寡核苷酸改進的靶向核苷酸交換方法
技術領域：
：本發明涉及一種通過向靶細胞導入寡核苷酸引起在靶細胞內DNA特異位點的核苷酸序列的特異性和選擇性改變的方法。結果是一個或多個核苷酸的靶向交換導致了靶DNA的序列中與上述寡核苷酸的序列不同的地方變成與該寡核苷酸相同的序列。具體地說，本發明涉及使用了修飾寡核苷酸的靶向核苷酸交換。本發明進一步涉及寡核苷酸和試劑盒。本發明也涉及所述方法的應用。
背景技術：
：遺傳修飾是為了達到修改活細胞的，或者由該細胞作為組成部分的生物體的或者該細胞再生的產生的生物體的一個或者多個基因編碼的生物學性質的目的，在活細胞的遺傳物質中有意產生變化的過程。這些變化可以是下述形式，刪除部分遺傳物質、加入外源性遺傳物質或者改變遺傳物質中現有的核苷酸序列。20多年來，真核生物遺傳修飾的方法已為人們所熟知，并且在植物、人類和動物細胞以及微生物中廣泛應用以達到農業領域、人類健康、食品質量和環境保護的改善。遺傳修飾的一般方法包括將外源DNA片段加入到細胞的基因組，這將給予該細胞或其生物體超過現有基因編碼性質的新性質(包括現有基因的表達將因此被抑制的應用)。雖然許多這樣的例子在獲得所需性質上是有效的，然而這些方法并不是十分精確的，因為在外源DNA插入的基因組位置是沒有控制的(因而對最終表達水平也沒有控制)，同時因為所需效應必須要在原來良好平衡的基因組編碼的天然性質的基礎上顯示。相反的，導致在預先確定的基因組位點的核苷酸的添加、刪除或者轉換的基因修飾的方法將會提供對現有基因的精確修飾。寡核苷酸指導的靶向核苷酸交換(Oligonucleotide-directedTargetedNucleotideExchange,TNE，有時稱ODTNE)是一種基于將合成寡核苷酸傳入真核生物細胞核的方法(含有核苷酸類似部分的短范圍的分子，這與DNA在它們的Watson-Crick堿基配對性質方面相似，但是與DNA在化學性質上是不同的)(Alexeev和Yoon，NatureBiotechnol.1343，1998;Rice，NatureBiotechnol.12:321，2001;Kmiec，J.Clin.Invest.112:632，2003)。通過有意地在寡核苷酸同源性序列中的設計錯配核苷酸，該錯配核苷酸可以被包含到基因組DNA序列中。這種方法提供了在現有基因座中單個或者至多一些核苷酸的轉換，但是可以用來在現有基因中產生終止密碼子，這導致它們功能的破壞，或者用來產生密碼子變化，產生編碼氨基酸組成發生改變的蛋白質的基因(蛋白質工程)。靶向核苷酸交換(TNE)已經在植物、動物和酵母細胞中描述。最先的TNE報道利用了由設計的嵌入到染色體耙位的自我互補的寡核苷酸組成的所謂嵌合體。該嵌合體含有錯配核苷酸形成在耙染色體引入突變的模板。為了對TNE事件進行選擇，大多數研究試圖在導致除草劑抗性的內源性基因中引入一個單個核苷酸變化。最初使用嵌合體的例子來自人類細胞(參見綜述Rice等，Nat.Biotech.J^:321-326)。嵌合體的使用同樣在植物種煙草、稻米、和玉米中已經是成功的。(Beetham等，1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA巡8774-8778;Kochevenko等，2003PlantPhys.巡174-184;Okuzaki等，2004PlantCellRep.509-512)。然而，嵌合體的活性被發現是很難復制的，因此單鏈(ss)寡核苷酸的TNE活性已經被測定。已發現在小麥、酵母以及人類細胞中結果更具有可重復性(Liu等，2002Nuc.AcidsRes.1^:2742-2750;綜述，Parekh-Olmedo等，2005GeneTherapy12:639-646;Dong等.2006PlantCellRep.21:457-65)。一些研究組已經證明TNE也可以通過使用總細胞蛋白提取物檢領U。該TNE活性分析被稱為無細胞分析(Cole-Strauss等，1999NucleicAcidsRes.27:1323-1330;Gamper等，2000NucleicAcidsRes.28，4332-4339;Kmiec等，2001PlantJ.;22:267-274;Rice等，2001處857-868)。該分析組織如下。使含有兩個細菌抗菌素抗性基因(卡那霉素和羧芐青霉素)的質粒突變，以便由于單個核苷酸的變化(例如，從TAT到TAG)使其中一個抗菌素抗性基因(例如卡那霉素)含有一個框架內終止密碼子。這個突變的質粒然后與總細胞蛋白以及設計用來校正抗生素抗性基因中的終止密碼子的單鏈寡核苷酸進行培養。TNE必需的蛋白質存在于細胞提取物中，并且使用上述寡核苷酸來改變抗菌素抗性基因中的終止密碼子，恢復了抗性表型。質粒DNA然后從反應混合物中提取同時轉入大腸桿菌。該細菌隨后在含有卡那霉素的培養基上進行培養，同時細菌菌落的數量代表TNE修復事件的數量。電穿孔效率通過生長在含有羧芐青霉素的培養基上的菌落數的計數來計算。TNE效率可以通過計算修復質粒相對轉入質粒的總數的比例來定量。在所述的實驗中，該寡核苷酸產生置換，將TAG改變為TAC。此外，無細胞系統也可以用來研究使用寡核苷酸產生單核苷酸插入的可能性。可以制備含有從抗生素基因刪除單核苷酸、產生移碼突變的質粒。在無細胞分析中，刪除部分通過由該寡核苷酸介導的單核苷酸的添加而被修復。TNE在如植物這樣高等生物的細胞中的的應用所面臨的最大問題，到目前為止已有報道的是其效率低的問題。在玉米中，Zhu等(2000NatureBiotech.il:555-558)報道的轉換率為1x10—4。后來在煙草(Kochevenko等2003PlantPhys.174-184)和稻米(Okuzaki等2004PlantCellRep.^2:509-512)上的研究分別報道了1><10-6和lxl(^的轉換率。這些轉換率對于TNE的實際應用仍然是太低的。可靠的DNA復制是傳遞基因組組穩定性維持以及保證DNA含有的遺傳信息免于突變從一代傳到下一代的關鍵標準之一。許多錯誤起于親代DNA鏈中的損害或由與DNA堿基起反應的試劑引發(UV光，環境毒素)。每個生物體必須含有一個防御機制以防止或者校正這些突變。錯配修復系統(MMR)被認為是在DNA損害監視和防止非全同序列之間的重組中識別以及校正錯配或在DNA復制中引起的不配對堿基(Fedier和Fink，2004Int.JOncol.2004;24(4):1039-47)，并且促成活細胞中DNA復制的精確度。TNE已經在許多Kmiec專利申請中有描述，其中如WO0173002、WO03/027265、WOO1/87914、WO99/58702、W097/48714、WO02A0364。在WO01A73002中注意到使用未修飾DNA寡核苷酸得到的基因變化的低效率被認為主要是由于反應混合物或者靶細胞中的核酸酶引起的供體寡核苷酸降解的結果。為了補救這個問題，提出結合修飾核苷酸以使得所得寡核苷酸對核酸酶有抗性。典型的例子包括帶有磷硫酰鍵、2'-氧-甲基-類似物或者鎖核酸(LNA)的核苷酸。這些修飾優選地位于寡核苷酸的末端，留下環繞靶堿基的中心DNA區域。此外，該出版物規定在轉化寡核苷酸和參與轉化過程的蛋白質之間有特異的化學相互作用。因為參與改變過程的蛋白質及其與寡核苷酸取代基的化學相互作用是未知的，通過在寡核苷酸內使用除LNA、磷硫酰連接或者2'-氧-甲基類似物以外的修飾以產生抗核酸酶末端的上述化學相互作用的作用是不可預測的，并且根據WO0173002,發明者認為是不能預測的。因為ODTNE現有方法的效率是相對低的(如前所述，在10—6和10—4之間，盡管報道有90%的寡核苷酸傳遞率)，在本領域中需要更有效率的TNE方法。相應地，本發明者已經開始改進現有TNE技術。
發明內容本發明者現在己經發現通過將與象A、C、T或G未修飾核苷酸相比與受體DNA結合能力更強的相應核苷酸結合到TNE供體寡核苷酸中，TNE比率可以顯著提高。拋開理論的束縛，本發明者相信通過將修飾核苷酸結合到供體寡核苷酸，該供體寡核苷酸更強的結合到受體DNA，因此提高了TNE比率。本發明者已經發現在接近但是不(直接)毗鄰錯配的位置，即和錯配位至少有一個核苷酸的距離，含有一個或者更多LNA的寡核苷酸可以顯著提高TNE的效率。為此，在無細胞系統中按TNE轉換率使用在寡核苷酸內不同位置結合了一個或更多LNA的寡核苷酸的效果已經被研究。該寡核苷酸的TNE活性與由普通DNA構成的寡核苷酸的TNE活性進行比較。我們發現在錯配位移除至少一個核苷酸的位置上含有一個或者多個LNA的寡核苷酸可以使無細胞分析中的置換和插入TNE效率都提高到迄今未觀察到的水平。含有LNA的寡核苷酸與由普通DNA構成的寡核苷酸相比在無細胞分析中達到多IO倍的效率。我們發現TNE效率可以在寡核苷酸中LNA數量的增加時而改善，多個LNA被分別安置在至少相隔2個核苷酸，優選至少3個，更優選至少4個的位置。此外，我們發現所觀察到的改善不依賴于基因座，這表明與錯配相比帶有特定位置LNA的本發明的寡核苷酸能夠以不依賴于物種的方式提供提高的TNE轉換率，例如在植物和動物細胞中。因此，本發明是基于合乎需要的耙向核苷酸交換可以通過使用部分(即至多為75%，優選至多為50%)LNA修飾的核苷酸而完成的創造性設想。寡核苷酸修飾的位置、類型和數量可以在如下公開的限定內不同。因此，本發明的一個方面提供了LNA修飾寡核苷酸。LNA修飾的，ss-寡核苷酸可以用來在植物和動物或者人類細胞引入特定的基因變化。本發明適用于生物醫學研究、農業領域，并且適用于構建特定的突變植物和動物，包括人類。本發明也適用于藥物和基因治療領域。本發明的寡核苷酸序列除了含有錯配堿基的部分以外與靶鏈是一致的，其中的錯配堿基在靶鏈中引入了堿基變化。錯配堿基被引入到靶序列中。通過處理核苷酸的修飾(與常規的A、C、T或G相比)，更特別地，通過處理引入錯配的寡核苷酸的LNA修飾的位置和數量，效率(或者在DNA雙鏈中的所需位置上引入所需核苷酸的成功程度)可以得到改善。本發明的另一個方面是一種通過使親本DNA雙鏈接觸含有至少一個與親本鏈相比錯配的核苷酸的寡核苷酸以實現親本DNA鏈(第一條鏈，第二條鏈)靶向改變的方法，其中供體寡核苷酸包含在能夠實現靶向核苷酸交換的蛋白質存在時，在特定位置用LNA修飾以獲得比親本(受體)鏈具有更高結合力的區段。因此，本發明的要點在于相對于未修飾的插入寡核苷酸，帶有LNA核苷酸的插入寡核苷酸(有時稱為供體)的結合力的改善，LNA修飾位于不毗鄰所述錯配的一個或者多個位置。具體實施例方式本發明的一個方面涉及用于雙鏈DNA序列靶向改變的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補的第二DNA序列，該寡核苷酸包含能夠雜交到第一DNA序列的結構域，該結構域包含至少一個與第一DNA序列有關的錯配，其中該寡核苷酸包含至少一個區段，所述的區段含有至少一個與天然存在的A、C、T或G相比具有更高的結合親和力的修飾核苷酸，其中，優選地，所述的至少一個修飾核苷酸與天然存在的第一DNA序列中相對位置上的核苷酸的互補核苷酸相比，對第一DNA序列中相對位置上的該核苷酸的結合更強，其中所述的至少一個修飾核苷酸是一個置于距離所述的至少一個錯配至少一個核苷酸的LNA，并且優選的，其中該寡核苷酸含有至多約75%的修飾核苷酸。在一個方面，本發明涉及用于雙鏈DNA序列耙向改變的LNA修飾寡核苷酸。該雙鏈DNA序列包含第一DNA序列和第二DNA序列。該第二DNA序列與第一DNA序列互補，并且與第一DNA序列配對形成雙鏈。該寡核苷酸包含含有至少一個與將被改變的雙鏈DNA序列有關的錯配的結構域。優選地，該結構域是與第一鏈的互補的，包括至少一個錯配的寡核苷酸的一部分。優選地，該結構域內的錯配與第一DNA序列有關。該寡核苷酸包含由至少一個LNA修飾的區段以具有比第二DNA序列(的相應部分)更高的結合親合力。優選地，所述的至少一個修飾核苷酸是一個置于距離所述的至少一個錯配至少一個核苷酸的LNA，更優選的，該寡核苷酸含有至多約75%的LNA修飾核苷酸。含有錯配的結構域和含有修飾核苷酸的區段可以是重疊的。因此，在某些實施方案中，含有錯配的結構域在寡核苷酸上位于與修飾區段不同的位置。在某些實施方案中，該結構域包括所述的區段。在某些實施方案中，該區段包括所述的結構域。在某些實施方案中，該結構域和該區段位于寡核苷酸上相同位置并且具有相同的長度，即它們的長度和位置重疊。在某些實施方案中，在該結構域中可以有多于一個的所述的區段。對于本發明，這意味著含有結合到DNA雙鏈中的錯配的寡核苷酸的部分可以位于與寡核苷酸被修飾部分不同或者移位的位置。特別地，在某些實施方案中，其中細胞修復系統(或者至少是與該系統有關的蛋白質，或者至少是涉及TNE的蛋白質)決定了哪條鏈含有所述的錯配以及哪條鏈用作錯配校正的模板。在某些實施方案中，寡核苷酸包含含有至少一個，優選為至少2個，更優選為至少3個LNA修飾核苷酸的區段。在某些實施方案中，在寡核苷酸上的所述的區段可以包含多于4、5、6、7、8、9或者10個LNA修飾核苷酸。在某些實施方案中，所述的至少一個LNA被置于距錯配至多10個核苷酸，優選為至多8個核苷酸，更優選為至多6個核苷酸，甚至更優選為至多4、3或者2個核苷酸的距離。在一個更優選的實施方案中，所述的至少一個LNA被置于距錯配1個核苷酸的距離，即一個核苷酸被置于錯配和LNA之間。在某些涉及含有多于一個LNA寡核苷酸的實施方案中，每個LNA位于距錯配至少一個核苷酸的距離。在一個優選的實施方案中，LNA不是彼此毗鄰的而是至少由一個核苷酸分開，優選地兩個或者三個核苷酸。在某些實施方案中，在有兩個或者更多(偶數)個寡核苷酸的LNA修飾時，修飾從錯配以(大約)相等的距離被間隔。換句話說，優選地，LNA修飾被對稱地置于錯配的周圍。例如，在一個優選的實施方案中，兩個LNA以距錯配1個核苷酸的距離對稱地置于錯配的周圍(同時彼此之間是3個核苷酸)。在某些實施方案中，至多50%的寡核苷酸的修飾核苷酸是LNA衍生物，例如，常規的A、C或G被它的LNA相應物代替，優選為至多40%,更優選為至多30%，甚至更優選為至多20%，最優選為至多10%。在某些實施方案中，多于一個的錯配可以同時或者接連被引入。寡核苷酸可以接納多于一個的寡核苷酸上毗鄰或者間隔位置上的錯配。為此，寡核苷酸可以適合接納一個第二套遵守這里描述的原則的LNA，只要它們不會由于在寡核苷酸中LNA的特殊構象而干擾彼此的改善的結合能力，即優選地距錯配1個核苷酸的距離相互間隔地圍繞在錯配周圍。在某些實施方案中，寡核苷酸可以包含2、3、4或者更多個錯配核苷酸，它們可以是毗鄰的或者遠離的(即非毗鄰的)。寡核苷酸含可以包含結構域和區段以接納上述內容，特別地可以包含若干區段。在某些實施方案中，該寡核苷酸可以包括一個潛在的插入，該插入將被插入到受體鏈中。所述的插入在長度上可以是不同的，從多于5個核苷酸直至達到100個核苷酸。同理，在某些實施方案中，類似的不同長度的核苷酸片段可以被刪除(1-100個核苷酸)。本發明的還有一個方面，寡核苷酸的設計可以通過以下步驟完成——確定所要交換的受體鏈序列，或至少是圍繞將要發生交換的核苷酸的序列區段。典型地，這可以是至少10個，優選為15、20、25或30個核苷酸毗鄰錯配，優選在錯配的兩側(例如GGGGGGXGGGGGG，其中X是錯配)；——設計一個供體寡核苷酸，該寡核苷酸與毗鄰錯配的一個或者兩個區段互補，并且包含所需的將被交換的核苷酸(例如CCCCCCYCCCCCC);——提供(例如，通過合成)在所需的位置帶有LNA修飾得供體寡核苷酸。修飾可以是很大程度上不同的，這依賴于環境。例如，CCCmCCmCYCCmCCCmC、CCCmCCCYCCCmCCC、CCCCCCYCCCmCmCmCm、CmCmCmCmCmCYCCCCCC、CCCCCmCYCCCmCCCCC等等，其中C"M戈表一個LNA修飾核苷酸殘基。對于不同的受體序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT,可以設計相應的供體寡核苷酸，例如，TACGCALGYCLGGTACTA(L=LNA)，其修飾可以進行如前所述的變化。——在能夠靶向核苷酸交換的蛋白質存在時，用供體寡核苷酸對DNA進行修飾，例如，特別地，所述蛋白質在細胞錯配修復機制中發揮功能的蛋白質。拋開理論的束縛，改善的結合親合力被認為是提高寡核苷酸的發現并且保持結合到它的靶標的可能性，從而改善TNE效率。許多不同的糖主鏈或者堿基的化學修飾提供了改善的結合親合力。然而，本發明人致力于研究LNA修飾寡核苷酸，發現它們在TNE中的活性取決于在寡核苷酸中的位置。封閉核苷酸(LNA)是一種具有非常有趣性質的用于反義基因療法的DNA類似物。LNA是二環核苷酸和三環核苷酸和核苷酸類似物和含有這樣核苷酸類似物的寡核苷酸。LNA和相關類似物的堿基結構和功能特性在許多公開物和專利中公開了，包括WO99/14226、WO00/56748、WO00/66604、WO98/39352，美國專利No.6,043,060，以及美國專利No.6,268,490，所有的這些通過引用完整的合并于此。特別地，它結合了辨別正確和不正確的靶標(高專一性)，非常高的生物穩定性(低周轉，lowturnover)和空前的親和力(對耙非常高的結合力)的多種能力。事實上，LNA帶來的親和力的增加使得先前報道的類似物的親和力處于低到中度的范圍。LNA是一種RNA類似物，其中的核酸糖在結構上受到2，-氧原子和4，-碳原子之間的亞甲基橋的抑制。該橋接限制了呋喃核糖的適應性并且將結構封閉到剛性二環結構中。這樣所謂的N型(或3，-內)構象導致含有雙鏈LNA的Tm的增加，以及因此獲得的更高的結合親合力和更高的特異性。NMR光譜研究現在已經實際上證實了LNA糖封閉的N型構象，但是也顯示LNA單體可以扭曲它們的未修飾的相鄰核苷酸成為一個N型構象。重要地，所述的LNA的有利特性并不像其它核苷酸類似物經常觀察到的那樣以犧牲其他重要性質為代價。LNA可以與所有其它構成DNA類似物集合的化學化學物自由混合。LNA堿基可以作為短全LNA序列或作為較長的LNA/DNA嵌合體結合到寡核苷酸中。LNA可以被置于內部，3'或5'-位置。然而，由于它們的剛性二環構象，LNA殘基有時會擾亂核苷酸鏈的螺旋狀扭曲。因此通常很少設計帶有兩個或者更多毗鄰LNA殘基的寡核苷酸。優選地，LNA殘基被至少一個不干擾螺旋狀扭曲的(修飾)核苷酸如常規的核苷酸(A、C、T或G)分開。最初發展的以及優選的LNA單體(β-D-氧-LNA單體)已經被修飾成新的LNA單體。新的a-L-氧-LNA顯示出對于3'核酸外切酶活性的高穩定性，并且比3-D-氧-LNA在設計有效反義寡核苷酸方面更有效率且具有更多用途。同時，可以使用xylo-LNA和L-riboLNA，如W09914226、WO00/56748、WO00/66604所公開的。在本發明中，任何上述類型的LNA在達到本發明的目的(即改善TNE效率)上都是有效的，優選為3-D-LNA類似物。在TNE領域，LNA修飾已經被列舉在用于作為TNE的嵌合分子的可選擇的可能寡核苷酸的列表中。然而，該領域迄今沒有給出LNA修飾單鏈DNA寡核苷酸將TNE效率顯著提高到現在已經發現的當LNA置于距錯配至少一個核苷酸和/或寡核苷酸不含有超過約75%(大概是核苷酸的最接近整數)LNA時的水平。寡核苷酸的遞送可以經電穿孔法或者其它能夠遞送到細胞核或者細胞質的常規技術來完成。在活體外，本發明的方法的試驗可以通過使用例如WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WO01/92512中所述的無細胞系統來完成。如這里所用的，供體寡核苷酸影響TNE的能力依賴于合并到供體核苷酸中的修飾核苷酸的類型、位置和數量或相對量。這種能力可以通過例如將常規核苷酸之間的結合親合力(或結合能(吉布斯自由能))以1為標準進行標準化的方法定量，即對于AT和GC的結合，該親合力被標準化為l。對于本發明的寡核苷酸，各修飾核苷酸的相對結合親和力(RelativeBindingAffnity，RBA)是大于1。這體現在下面的公式中<formula>seeoriginaldocumentpage15</formula>其中，RBA是總相對結合親和力，RBA(修飾的)是具有n個核苷酸長度的修飾寡核苷酸的相對結合親和力的和，RBA(非修飾的)是具有m個核苷酸長度的修飾寡核苷酸的相對結合親和力的和。例如，一個100bp的寡核苷酸含有10個修飾，每個修飾具有1.1的相對結合親和力。那么總RBA等于RBA=[(10*1.1)+(90*1.0)]-(100*1.0)=1。要注意的是，RBA的定義原則上不依賴于與之相比的核苷酸鏈的長度。然而，當不同鏈的RBA相比較時，優選地是鏈具有大約相同的長度或者長度相當的區段被采用。要注意的是，RBA在修飾可被集合在一條鏈上未予考慮。因此，相比鏈B，某鏈A更高的修飾度表示RBA(A)>RBA(B)。對于上游和下游區段，相應的(局部的)RBA值是可以被確定和使用的。為了調節修飾核苷酸的位置的作用，加權因子被引入RBA值。例如，在毗鄰錯配的供體核苷酸上的修飾核苷酸的作用可以比位于錯配5個核苷酸距離的修飾核苷酸的作用更大。在本發明的上下文中，RBA(供體)>RBA(受體)。在某些實施方案中，供體的RBA值至少比受體的RBA值大0.1。在某些實施方案中，供體的RBA值至少比受體的RBA值大0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5。RBA值可以通過核苷酸修飾結合親合力的常規分析獲得，例如通過分子模型、熱力學測量等等。可選擇地，它們可以通過修飾和未修飾鏈之間的Tm差值的測定來決定。可選擇地，RBA可以表達為未修飾和修飾鏈之間在Tm的差值，該差值或者通過測量或者通過用于計算一套核苷酸的Tm的常規公式計算，或者結合計算和測量來獲得。根據本發明的供體寡核苷酸可以包含進一步的修飾以改善雜交性質，使得供體顯示出對靶DNA鏈提高的親和力，以便供體的插入更容易。供體寡核苷酸可以進一步被修飾以對核酸酶更具抗性、以穩定三倍體或四倍結構。本發明的LNA修飾供體寡核苷酸的修飾可以包含磷硫酰修飾、2-OMe置換、在寡核苷酸的3'和/或5'末端的進一步使用LNA、PNA(肽核苷酸)、核糖核苷酸和其他修飾，優選增強寡核苷酸和受體鏈之間的雜交穩定性的堿基。這些修飾中特別有用的是PNA，它們是寡核苷酸類似物，其中的脫氧核糖主鏈被肽主鏈替代。一種所述的肽主鏈由酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)(N-(2-aminoethy1))甘氨酸的重復單位構成。每個肽主鏈的亞單位附加到一個核堿基(nucleobase，也命名為"堿基")，該核堿基可以是天然存在的、非天然存在的或修飾的堿基。PNA寡聚物特異性結合到比DNA或RNA具有更高親和力的互補DNA或RNA序列。相應地，所得的PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈具有更高的解鏈溫度(Tm)。另外，PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈的Tm比DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈對于鹽濃度較不敏感。PNA的聚酰胺主鏈也對酶解作用更具抵抗力。PNA的合成在例如WO92/20702和WO92/20703中有描述，它們的內容通過引用完整的合并于此。其它的PNA在例如W093/12129和1996年7月23日頒發的美國專利No.5,539,082中有說明，它們的內容全部引入以作為參考。另外，許多科學出版物敘述了PNA的合成以及它們的性質和用途。參見，例如Patel，Nature,1993，365，490;Nielsen等，Science,1991，254，1497;Egholm，J.Am.Chem.Soc，1992，114，1895;Knudson等，NucleicAcidsResearch,1996，24，494;Nielsen等，J.Am.Chem.Soc，1996，118，2287;Egholm等，Science,1991，254，1497;Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895;以及Egholm等，JAm.Chem.Soc.，1992，114，9677。更多有用的本發明的LNA寡核苷酸以SuperA和SuperT被熟知，這從EpochBiosciencesGermany可獲得。這些修飾核苷酸含有插入到DNA大溝中的附加取代基，被認為可以改善DNA雙鏈中堿基堆積。在進一步的實施方案中，有利結果可以在根據本發明的LNA修飾寡核苷酸之外，進一步修飾引入到寡核苷酸提高受體鏈寡核苷酸的親和力時獲得。因此，我們已經發現根據本發明的LNA修飾寡核苷酸進一步含有C5-丙炔修飾嘧啶和/或C7丙炔基修飾嘌呤顯著改善了TNE的效率。本發明的供體寡核苷酸也可以用來制備嵌合體，即含有DNA、RNA、LNA、PNA或其結合的區段。因此，在某些實施方案中，本發明的寡核苷酸還包含其它可選的非甲基化的修飾核苷酸。在某些實施方案中，寡核苷酸對核酸酶是抗性的。這有利于防止寡核苷酸被核酸酶降解以及增加供體找到它的耙標(受體分子)的可能性。在某些實施方案中，位于錯配位置上的寡核苷酸中的核苷酸是可以被修飾的。錯配是否可以修飾很大程度上依賴于使用供體和受體鏈之間親和力上的差異的靶向核苷酸交換的精確機制或者細胞DNA修復機制。對于錯配的臨近或者接近位置上的其它修飾的位置的精確定位來講也是一樣的。然而，基于此處的公開，所述的寡核苷酸是容易設計和試驗的，參考本說明書中其它地方所描述的對合適的寡核苷酸的試驗操作。在某些實施方案中，在錯配位上的核苷酸是不被修飾的。在某些實施方案中，修飾位于距錯配l個核苷酸距離的位置，優選為距錯配2、3、4、5、6或7個核苷酸的位置。在某些實施方案中，修飾位于距錯配下游區的位置。在某些實施方案中，修飾位于距錯配上游區的位置。在某些實施方案中，修飾位于距錯配10bp到10kB的位置，優選為距錯配50到5000bp，更優選為距錯配100-500。用作供體的寡核苷酸在長度上可以是不同的，但一般的長度上的變化在10到500個核苷酸之間，優選為11到100個核苷酸，優選為15到90個核苷酸，更優選為20到70個核苷酸，最優選為30到60個核苷酸。在一個方面，本發明涉及雙鏈受體DNA序列靶向改變的方法，包括使該雙鏈受體DNA序列結合一條供體寡核苷酸，其中該雙鏈受體DNA序列含有一條第一DNA序列和一條與第一DNA序列互補的第二DNA序列，以及其中該供體寡核苷酸含有包含至少一個與將被改變的雙鏈受體DNA序列有關的錯配的結構域，優選地與第一DNA序列有關，以及在有靶向核苷酸交換能力的蛋白質存在時，其中供體寡核苷酸的區段被LNA修飾以表現出與寡核苷酸中位于該位置上的未修飾核苷酸相比，對于第一DNA序列更高的親和力，其中LNA位于距離至少相對該錯配一個核苷酸的位置。廣義地來講，本發明一般適用于所有種類的生物體，例如人類、動物、植物、魚類、爬行類動物、昆蟲、真菌、細菌等等。本發明適用于任何類型DNA的修飾，例如得自基因組DNA、線性DNA、人工染色體、核染色體DNA、細胞器染色體DNA、BAC、YAC的DNA。本發明可以在活體內(invivo)以及取自體內在活體外(exvivo)完成。廣義地來講，本發明適用于改變細胞、通過回復校正突變到野生型、誘導突變、通過破壞編碼區的滅活酶、通過改變編碼區對酶的生物活性進行修飾、通過破壞編碼區對蛋白質進行修飾。本發明實質上也涉及如上所述寡核苷酸的用途，用于改變細胞、通過回復校正突變到野生型、誘導突變、通過破壞編碼區的滅活酶、通過改變編碼區對酶的生物活性進行修飾、通過破壞編碼區對蛋白質進行修飾、錯配修復、靶向改變(植物)遺傳物質，包括基因突變、靶向基因修復和基因敲除。本發明進一步涉及試劑盒，其包含一個或者更多如本說明書在別處所定義的寡核苷酸，可選的聯合能誘導MRM、特別是有TNE能力的蛋白質。本發進一步涉及通過本發明的方法得到的修飾遺傳物質、涉及含有該修飾遺傳物質的細胞和生物體，以及涉及如此得到的植物或植物部分。本發明特別涉及使用本發明的LNA修飾寡核苷酸以提供植物中的抗除草劑的TNE方法的用途。特別地，本發明涉及被提供了抗除草劑的植物，尤其是草甘磷和/或磺酰脲類除草劑，例如氯磺隆。附圖1:靶向核苷酸交換圖示。含有將被交換核苷酸(X)的受體雙鏈DNA鏈被帶入與含有將被插入的核苷酸(Y)的LNA修飾供體寡核苷酸(以NWTNNNmYNNmNNm的圖式給出)接觸。三環構造受到或被帶入接觸有TNE能力的環境或者與有執行TNE能力的蛋白質接觸，例如所知的無細胞的酶混合物或者無細胞提取物(參見i.a.WO99/58702、WO01/73002)。附圖2:不同LNA的化學結構。附圖3:使用無細胞分析測量的含有LNA修飾核苷酸的寡核苷酸的TNE修復效率。每個使用普通DNA寡核苷酸的實驗的修復效率被確定，并且被定義為1的值。成倍的增加表明通過使用含有3-D-LNA的寡核苷酸與使用普通DNA寡核苷酸相比得到的修復效率的觀察到的修復的增加。實施例材料和方法含有LNA核苷酸的寡核苷酸從Eurogentec購買。所用的寡核苷酸的序列如下所示。實驗中所用的質粒是含有能給予卡那霉素和羧芐青霉素抗性的基因的pCR2.1(Invitrogen)的衍生物。在結構中，終止密碼子和缺失基因組被引入卡那霉素ORF和羧芐青霉素，如前人所述(Sawano等，2000NucleicAcidsRes.e78)。質粒KmY22stop在卡那霉素ORF中密碼子Y22處具有TAT到TAG的突變。在質粒KmY22中，Y22密碼子(TA工)的第三核苷酸被刪除給出一個移碼。有缺陷的卡那霉素基因和用在無細胞系統中的寡核苷酸<formula>seeoriginaldocumentpage20</formula><table><row><column>寡核苷酸</column><column>序列</column><column>LNA/DNA</column><column>SEQID</column></row><row><column>L1</column><column>tgtgcccagtCgTagccgaatagc</column><column>2/24(8-3%)</column><column>1</column></row><table><table><row><column>L2</column></row><row><column>tgtgcccagTcgtAgccgaatagc</column></row><row><column>2/24(8-3%)</column></row><row><column>2</column></row><row><column>13V</column></row><row><column>TgTgCcCaGtCg;TaGcCgAaTaGc</column></row><row><column>12/24(50%)</column></row><row><column>3</column></row><row><column>L4</column></row><row><column>GtGcCcAgTcGtAgCcGaAtAgC</column></row><row><column>12/24(50%)</column></row><row><column>4</column></row><row><column>L5</column></row><row><column>GtgcCcagTcgtAgccGeta/tAgc</column></row><row><column>6/24(25%)</column></row><row><column>5</column></row><row><column>L6</column></row><row><column>tgtgCccagTcgtaGccgaAtagc</column></row><row><column>4/24(16-6%)</column></row><row><column></column></row><table>相關的卡那霉素開放讀碼框和編碼的氨基酸的序列被展示。產生終止密碼子(TAG，勺的單個核苷酸突變如前所述被引入(Sawano等，2000NucleicAcidsRes.2§:e78)。實驗中使用的LNA寡核苷酸的序列以大寫字母顯示。寡核苷酸Ll-L6被用來使KmY22stop和KmY22A突變轉化為交變的酪氨酸編碼密碼子(TAC)。在每個寡核苷酸中的錯配核苷酸是用下劃線強調的。在卡那霉素ORF上的寡核苷酸結合區域是用下劃線強調的。寡核苷酸Ll-L6是卡那霉素編碼序列的互補。無細胞分析按照如下完成擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Col-0生態型)的花芽被收集并且在氮下粉碎。200^tl蛋白質分離緩沖液(20mMHEPESpH7.5、5mMKC1、1.5mMMgCl2、10mMDTT、10%(v/v)甘油、1%(w/v)PVP)被加入。植物碎屑通過離心分離在14kRPM下30分出沉淀，并且上清液在-80。C儲藏。蛋白質濃縮物通過使用NanoOrange試劑盒(MolecularProbes,Inc)被測量。一種典型的分離物導致約3-4pg4il的蛋白質濃度。無細胞反應包括以下組分，lpg質粒DNA(KmY22stop或KmY22△)，100ng寡核苷酸，30ng總植物蛋白，4^1切斷的鮭精DNAG(ig/W)，2^蛋白酶抑制劑混合物(50x濃度完全無EDTA蛋白酶抑制劑雞尾酒片劑，RocheDiagnostics),50(xl2x無細胞反應緩沖液(400mMTrispH7.5、200mMMgC12、2mMDTT、0.4mM精脒、50mMATP、2mM每種CTP、GTP、UTP，O.lmM每種dNTP和10mMNAD)，加水至總體積lOO(il。混合物在37°C下培養1小時。然后質粒DNA按以下方法分離。100U1H2021加入到每個反應中以增加體積隨后加入20(V1的堿性緩沖苯酚(pH8-10)。簡要地旋轉然后在13krpm下離心3分鐘。上層的水相被轉到一個新的試管中同時然后加入200pl氯仿，簡要地旋轉，然后在13krpm旋轉3分鐘，上層水相轉移到一個新的試管中。DNA通過加入0.7體積的2-丙醇沉淀出來，同時片狀沉淀物在TE中再懸浮。為了清除任何共純化寡核苷酸，DNA通過QiagenPCR純化柱，同時質粒DNA在30pl的終體積中洗脫。2jil的質粒DNA電穿孔到18(ilDH10B(Invitrogen)電穿孔感受態細胞。在電穿孔后，細胞在37°C下在SOC培養基中恢復1小時。這段時間以后，卡那霉素加入到100昭/ml的濃縮物中，同時細胞進一步培養3小時。固體培養基含有100i!g/ml卡那霉素或者羧節青霉素。對于KmY22stop禾nKmY22實驗，TNE事件的數量在卡那霉素培養基上被檢測，同時電穿孔術的效率通過計數得自羧芐青霉素培養基析出的電穿孔的10—4和10—5稀釋的菌落的數量而計算。TNE效率通過按轉化細胞的總數除以TNE事件的數量而計算。結果寡核苷酸被設計在引入到卡那霉素ORF中的終止密碼子(TAG)產生單個核苷酸置換(KmY22stop)或插入(KmY22A)，因此密碼子再次編碼正確的氨基酸。在每個實驗中，未修飾DNA寡核苷酸和LNA修飾寡核苷酸是平行進行的。在每個實驗中，使用普通DNA寡核苷酸得到的TNE效率被設定為1，同時LNA寡核苷酸的TNE效率隨后以與普通DNA寡核苷酸相比成倍增長的形式表達。我們發現修復效率的增加依賴于LNA在寡核苷酸中的位置。寡核苷酸Ll含有在錯配核苷酸兩側的LNA核苷酸，同時這表明與DNA寡核苷酸相比沒有改善。然而，帶有與錯配間隔一個核苷酸的LNA核苷酸的寡核苷酸L2表現出5倍的平均增加。額外的LNA核苷酸(L3&L4)的加入減少修復效率低于普通DNA寡核苷酸的修復效率到背景水平，這些寡核苷酸是無生物學活性的。這被使用L5和L6的數據所證實。在L5中，除了如L2中的LNA側鄰錯配核苷酸，它還包含附加的LNA核苷酸。在這個例子中，使用L2得到的在修復中的增加是觀察不到的，推測這可能是附加LNA核苷酸的抑制作用。L6也表明當使用KmY22stop時修復中的改善。同樣的趨勢當實驗使用KmY22A完成時也被觀察到。已知經由單個核苷酸插入的修復比經由置換的修復的效率低，這與此處觀察到的相同。L2表明在修復率的增加，這表明圍繞錯配的LNA核苷酸位置的插入是增加修復率的一個重要特征。在本發明中，實驗表明使用無細胞系統活體外TNE分析，含有LNA核苷酸的寡核苷酸表現出相比使用普通DNA寡核苷酸得到的TNE效率更高水平的TNE。所述的增加可以是高達5倍。該作用很大程度上依賴于相對錯配核苷酸LNA核苷酸的位置。此外，修復過程對寡核苷酸上LNA核苷酸的數量非常敏感，當該數量達到50%時，寡核苷酸表現出在分析中減少的生物學活性。LNA核苷酸的另一種形式，2'-氨基-LNA類似物(Rosenbohm等，(2003)OrgBiomolChem.丄，655-663)可以通過在核苷酸中附加其他化學基團而進一步功能化。除增加的結合親合力以外，所述的具有附加化學基團的LNA核苷酸可以在許多方面與DNA相互作用，進一歩增強結合親合力(Sorensen等，(2003)ChemCommun(Camb)i2，2130-2131)。該2'-氨基隱LNA可超過已顯示的5倍增加而進一步增加修復。權利要求1、一種用于雙鏈DNA序列靶向改變的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補的第二DNA序列，該寡核苷酸包含能夠雜交到第一DNA序列的結構域，該結構域包含至少一個與第一DNA序列有關的錯配，其中該寡核苷酸包含至少一個區段，所述的區段含有至少一個與天然存在的A、C、T或G相比具有更高的結合親和力的修飾核苷酸，其中所述的至少一個修飾核苷酸是一個置于距離所述的至少一個錯配至少一個核苷酸的LNA，其中，可選的是，該寡核苷酸含有至多約75％的LNA修飾核苷酸。2、根據權利要求1的寡核苷酸，其中至少2個，優選為至少3個，更優選為至少4個，甚至更優選為至少5個以及最優選至少6個核苷酸是LNA。3、根據權利要求1或2的寡核苷酸，其中所述的LNA不受限制地分布在距離所述的錯配兩側至多10個核苷酸上，優選為至多8個核苷酸，更優選為至多6個核苷酸，甚至更優選為至多4、3或2個核苷酸的。4、根據權利要求1-3的寡核苷酸，其中2個，優選為3個，更優選為4個，甚至更優選為5個以及最優選為6個核苷酸是LNA。5、根據前述任一權利要求的寡核苷酸，其中至多50%的該寡核苷酸的所述的修飾核苷酸是LNA衍生物，優選為至多40%，更優選為至多30%，甚至更優選為至多20%，以及最優選為至多10%。6、根據前述任一權利要求的寡核苷酸，其中所述的至少一個修飾核苷酸不受限制地置于該錯配的5'側和/或3'側。7、根據前述任一權利要求的寡核苷酸，其中位于所述的錯配的5'側或3'側同一側的兩個LNA修飾核苷酸彼此間隔至少一個，優選為兩個堿基對。8、根據前述任一權利要求的寡核苷酸，其中在該錯配位置的核苷酸是未修飾的。9、根據前述任一權利要求的寡核苷酸，其中所述的至少一個修飾核苷酸不位于該錯配毗鄰的位置，同時優選地位于該錯配2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸以內。10、根據前述任一權利要求的寡核苷酸，其具有10至500個核苷酸的長度。11、根據前述任一權利要求的寡核苷酸，其中所述的(修飾)區段即是所述的結構域。12、雙鏈受體DNA序列耙向改變的方法，包括使該雙鏈受體DNA序列結合一條供體寡核苷酸，其中該雙鏈受體DNA序列含有一條第一DNA序列和一條與第一DNA序列互補的第二DNA序列，以及其中該供體寡核苷酸含有包含至少一個與將被改變的雙鏈受體DNA序列有關的錯配的結構域，優選地與第一DNA序列有關，以及其中該寡核苷酸含有包含至少一個與天然存在的A、C、T或G相比具有更高親合力的修飾核苷酸的區段，以及在存在能夠耙向核苷酸交換的蛋白質時，該修飾核苷酸與天然存在的第一DNA序列中相對位置上的核苷酸的互補核苷酸相比，對第一DNA序列中相對位置上的該核苷酸的結合更強，以及其中該修飾寡核苷酸是如權利要求1-11所述的寡核苷酸。13、根據權利要求12的方法，其中所述的改變是在細胞中的，該細胞優選自由植物細胞、真菌細胞、嚙齒動物細胞、靈長類動物細胞、人類細胞或酵母細胞組成的群組。14、根據權利要求12的方法，其中該蛋白質得自細胞提取物。15、根據權利要求14的方法，其中該細胞提取物選自由植物細胞提取物、真菌細胞提取物、嚙齒動物細胞提取物、靈長類動物細胞提取物、人類細胞提取物或酵母細胞提取物的組成的群組。16、根據權利要求12的方法，其中該改變是至少一個核苷酸的刪除、置換或插入。17、根據前述任一權利要求的方法，其中該細胞是真核細胞、植物細胞、非人類哺乳動物細胞或人類細胞。18、根據前述任一權利要求的方法，其中靶標DNA來自于真菌、細菌、植物、哺乳動物或人類。19、根據前述任一權利要求的方法，其中雙鏈DNA來自于基因組DNA、線性DNA、哺乳動物人工基因組、細菌人工基因組、酵母人工基因組、植物人工基因組、核基因組DNA、細胞器基因組DNA、附加體DNA。20、根據前述任一權利要求的方法，用于改變細胞、通過回復校正突變到野生型、誘導突變、通過破壞編碼區的滅活酶、通過改變編碼區對酶的生物活性進行修飾、通過破壞編碼區對蛋白質進行修飾。21、如權利要求1-12所述的寡核苷酸的用途，用于改變細胞、通過回復校正突變到野生型、誘導突變、通過破壞編碼區的滅活酶、通過改變編碼區對酶的生物活性進行修飾、通過破壞編碼區對蛋白質進行修飾、錯配修復、靶向改變(植物)遺傳物質，包括基因突變、靶向基因修復和基因敲除。22、如權利要求1-12所述的寡核苷酸的用途，用于增強的雙鏈DNA序列的耙向改變，該雙鏈DNA序列含有一條第一DNA序列和一條與第一DNA序列互補的第二DNA序列，該寡核苷酸包含能夠雜交到第一DNA序列的結構域，該結構域包含至少一個與第一DNA序列有關的錯配，同時其中該寡核苷酸包含一個含有修飾核苷酸的區段，其中所述的修飾核苷酸與天然存在的A、C、T或G相比具有更高的結合親和力，以及其中所述的修飾核苷酸與天然存在的第一DNA序列中相對位置上的核苷酸的互補核苷酸相比，對第一DNA序列中相對位置上的該核苷酸的結合更強，其中所述的修飾核苷酸是LNA。23、如權利要求1-11所述的寡核苷酸在提供植物抗除草劑的方法中的用途。24、含有如權利要求1-11所述寡核苷酸的試劑盒。25、通過如權利要求12-20所述的方法產生的修飾遺傳物質。26、包含如權利要求25所述的修飾遺傳物質的細胞。27、如權利要求11-20的所述的方法制備的或者包含如權利要求25所述的修飾遺傳物質的植物或植物部分。全文摘要本發明涉及一種用于雙鏈DNA序列的靶向核苷酸交換的方法和寡核苷酸，其中供體寡核苷酸含有至少一個修飾核苷酸，該修飾核苷酸是與天然存在的A、C、T或G相比具有更高結合親合力的LNA，和/或是與天然存在的第一DNA序列中相對位置上的核苷酸的互補核苷酸相比，對第一DNA序列中相對位置上的該核苷酸的結合更強的修飾核苷酸。文檔編號C12N15/10GK101346466SQ200680048992公開日2009年1月14日申請日期2006年12月21日優先權日2005年12月22日發明者L·K·瓦霍夫斯基,M·T·J·德博特,P·本多克,R·C·J·霍格斯申請人:凱津公司