專利名稱：擴增重復核酸序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術領域。特別地，本發明涉及用于擴增靶核酸，特別是直接擴增重復核酸序列的組合物和方法。
背景技術：
在醫學診斷、法醫學、遺傳分析和公共衛生的眾多應用中，檢測靶核酸的存在是非常重要的。例如，對于診斷遺傳疾病、確定對疾病的易感性和鑒定傳染病的病原體(causal agents)來說，鑒定特定的DNA序列是關鍵的。聚合酶鏈式反應(PCR)選擇性地擴增靶核酸，提供一種高度靈敏的檢測靶核酸存在的方法。該方法取決于雜交到靶核酸片段的相反端的寡核苷酸引物，擴增子的使用和由聚合酶引發核酸片段的復制。DNA合成、變性和重退火的反復循環可以指數性地擴增特定的靶核酸。
擴增反應成功與否，引物選擇是主要的決定因素。關鍵的因素包括引物長度、解鏈溫度(Tm)、序列特異性、互補引物序列、G/C含量，和3’末端區域的序列。總之，引物必須特異地與靶核酸雜交，但是不雜交和擴增非靶核酸序列。
當引物的3’末端與另一引物互補時，擴增非靶核酸帶來了麻煩。這些引物將會相互雜交，然后被聚合酶延伸以形成“引物-二聚體”產物。引物-二聚體接著擴增導致引物損耗，使得靈敏度下降或甚至不能擴增預定的靶核酸。在限制引物-引物雜交的溫度下進行引物延伸或預擴增退火(如，“熱啟動”PCR，D’Aquila，R.T.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)193749(1991)；“降落(touchdown)”PCR，Don，.H.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)194008(1991))或調整緩沖液的成分來提高雜交嚴緊性可能會最小化引物-二聚體的干擾。但是，在PCR反應中存在過量的引物使得既便是3’末端區域微弱互補性也生成這些干擾副產物。
雖然選擇靶核酸的不同區域來篩選引物給限制非靶核酸的被動擴增提供了基礎，但是對篩選用于產生引物的序列的限定限制了對可替代的引物設計的選擇。例如，直接擴增短串聯重復序列如端粒重復是困難的，這是由于這些序列的引物總是具有一定程度的互補性。這些重復序列一般不具有限制引物-二聚體產物形成的引物序列。因此，當前用于評估端粒長度的方法依賴限制性內切酶消化基因組DNA，接著與重復序列雜交(末端限制性片段分析；見Harley，C.B.等自然(Nature)345458-460(1990))，用位于重復區外的特定序列間接地擴增重復序列(見Kozlowski，M.R.等，美國專利第5,741,677)，熒光原位雜交(見Henderson，S.細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)1341-12(1996))，或流速細胞計數方法(見Hultdin，M.核酸研究(Nucleic AcidsRes.)263651-3656(1998))。總之，這些操作耗時或者需要相當多的DNA。由于端粒重復的拷貝數和細胞中的其它串聯重復序列與細胞的生理或疾病狀態相關，需要用于快速擴增和量化這些序列并且在擴增中通常能避免競爭性的引物-二聚體副反應的組合物和方法。
發明概述按照上述目的，本發明提供用于擴增靶核酸而限制非靶核酸被動擴增的方法。在優選的實施方案中，該方法包括將包含基本上互補的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中第一引物雜交到靶核酸的第一條鏈而第二引物雜交到靶核酸的第二條鏈，和其中當雜交到各自的鏈時被雜交的引物能夠引物延伸。第一引物的至少一個核苷酸被改變以使當第一引物和第二引物相互雜交時在被改變的殘基與第二引物的3’末端核苷酸之間產生錯配。靶核酸主要是通過聚合酶鏈式反應被擴增。
在另一個方面，用于擴增靶核酸的方法還包括改變第二引物的至少一個核苷酸殘基來使得引物相互雜交時第二引物上被改變的殘基與第一引物的3’末端核苷酸之間產生錯配。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供擴增靶核酸的重復區域中的重復單位的方法。在一個實施方案中，該方法包括將包含基本上互補的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中第一引物雜交到靶核酸的第一條鏈的至少一個重復單位上而第二引物雜交到靶核酸的第二條鏈的至少一個重復單位上，和其中雜交到各自的鏈時被雜交的引物能夠引物延伸(primer extention)。第一引物的至少一個核苷酸被改變以在被改變的殘基與第一條鏈的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時被改變的殘基還與第二引物的3’末端核苷酸產生錯配。靶核酸隨后通過聚合酶鏈式反應被擴增。
在另一個方面，用于擴增重復序列的方法還包括改變第二引物的至少一個核苷酸殘基來使得在被改變的殘基和第二條鏈的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當引物相互雜交時第二引物上的被改變的殘基還與第一引物的3’末端核苷酸之間產生錯配。
在另一個用于擴增重復區域中的重復單位的優選實施方案中，該方法包含將基本上互補的第一條鏈和第二條鏈與第一引物和第二引物接觸，其中第一引物雜交到靶核酸的第一條鏈的一個以上重復單位上而第二引物雜交到靶核酸的第二條鏈的一個以上重復單位上，和其中雜交到各自鏈時被雜交的引物能夠引物延伸。第一引物的核苷酸殘基被改變以使在被改變的殘基與第一條鏈的各個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時被改變的殘基還與第二引物的3’末端核苷酸產生錯配。然后靶核酸被擴增。
在另一個方面，用于擴增重復序列的方法還包含改變第二引物的核苷酸殘基來在被改變的殘基與第二條鏈的各個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸之間產生錯配，其中當引物相互雜交時第二引物上被改變的殘基還與第一引物的3’末端核苷酸殘基產生錯配。
在一個優選實施方案中，本發明提供通過測定被擴增的靶核酸的數量來確定靶核酸如端粒的重復區中重復單位的數量的方法。這些方法可應用于癌癥診斷和細胞衰老的檢測。
按照所述的方法，本發明還提供用于擴增受體(subject)靶核酸，包括端粒重復區域的組合物。
附圖描述附

圖1描述寡核苷酸引物對tel1和tel2的序列，被用于擴增人端粒重復單位。所示的是引物與端粒重復序列的雜交方案和引物之間的雜交。tel-1引物能與沿著端粒DNA鏈朝向著絲粒的從5’到3’的任何可得到互補的31個堿基對序列雜交。tel-2引物能與沿著該鏈朝向染色體末端的從5’到3’的任何可得到互補的31個堿基對序列雜交。對于每條引物，核苷酸殘基被改變來在被改變的殘基與引物所雜交的各個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配。因此，對于tel1和tel2來說，每第6個堿基(everysixth base)被錯配。為了限制引物-二聚體產物，當引物相互雜交時每條引物上被改變的殘基還與其它引物3’末端的核苷酸殘基產生錯配，從而阻斷通過聚合酶的延伸。此外，引物的5’末端區被設計使得不與端粒重復發生堿基對。這些非互補性的5’末端區序列防止PCR產物的3’末端在端粒擴增生產中起始DNA合成。通過設計具有相似GC含量和類似Tms的端粒特異性引物(見實施例1)，進一步減少不期望的擴增。
附圖2顯示用于測定相對T/S比的標準曲線，其中T/S比是端粒(T)與單拷貝基因(S)相比(見實施例2)。通過系列稀釋(稀釋因子～1.68)和等分到微量滴定板(Microtiter plate)的孔中得到超過8倍范圍的5種DNA濃度；每孔的最終含量在12.64ng到100ng的范圍內，與被分析的樣本具有中度量近似匹配。DNA樣本的Ct是樣本必須進行的PCR循環分數(fractional number)，來積累足夠產物的以超過設定的熒光信號大小的閾值。只要每個被分析的樣本的Ct落入標準曲線的Ct范圍內，任何個別的或匯集的人DNA樣本被用于構建標準曲線(O＝單拷貝基因36B4；Δ＝端粒)。
附圖3顯示采用本文描述的引物通過實時(real time)定量PCR測定的相對T/S比的相關性和通過傳統的Southern雜交分析測定的平均端粒限制性片段(TRF)長度。用于分析的DNA樣本是采自21個個體的血液。由于采用標準曲線確定的起始T/S比都被歸一化到在樣本中觀察到的最小T/S比(0.69)，被繪制的所有相對T/S比具有＝1.0的值。給出了與數據最佳擬合的線性回歸曲線的方程。
附圖4顯示通過瓊脂凝膠電泳分離和采用溴乙啶染色和UV照射可視化的擴增產物。經過25個PCR循環后，被擴增的人端粒DNA以成片條帶出現，該條帶具有起始于約76個堿基對的最大強度，而在約400個堿基對處逐漸減弱到背景(人基因組DNA)。當含有已知數量的人端粒重復單位的靶核酸模板(TTAGGG)20被用于擴增時，也得到了起始于約76個堿基對的產物的成片條帶。當人基因組DNA被去除(即緩沖液)或用大腸桿菌DNA替代時，直到25個PCR循環都沒有檢測到產物。給出了DNA長度標準(123bp序列梯)。
發明詳述本發明涉及用于擴增靶核酸而限制非靶核酸被動擴增反應的方法和組合物。特別地，本發明提供用于限制相互雜交的引物的擴增而可以擴增靶核酸的引物。總之，本發明的引物包含被改變或被突變的核苷酸殘基，使得當引物相互雜交時，一條引物的3’末端殘基與另一引物上被改變或突變的核苷酸殘基產生錯配，從而阻止引物延伸。本發明可用于降低PCR背景和用于擴增和量化重復序列特別是端粒重復序列。
在此所用的“引物”、“引物核酸”、“寡核苷酸引物”或語法等同物是指與靶核酸的某些部分雜交的核酸。本發明的引物被設計成基本上與靶序列互補以使靶序列與本發明的引物發生雜交，而且恰當的3’堿基配對可以發生引物延伸。這種互補性不必是最優的。因此，在此“互補的”或“基本上互補”是指在常規反應條件下探針與靶序列相當地互補以發生雜交。只要偏離最優互補不足以完全地阻礙雜交，該偏離是允許的。但是，如果改變或突變的數量足以至少在如下定義的嚴緊雜交條件下不發生雜交，該序列不是互補的靶序列。
本發明的引物包含核酸。此處的“核酸”或“寡核苷酸”或語法同等物是指共價連接在一起的至少兩核苷酸。本發明的核酸通常含有磷酸二酯鍵，雖然在有些情形下包括的核酸類似物可能具有其它主鏈，包含如磷酰胺(Beaucage，S.L.等，四面體(Tetrahdron)491925-1963(1993)及其參考文獻；Letsinger，R.L等，有機化學雜志(J.Org.Chem.)353800-3803(1970)；Sprinzl，M.等，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)81579-589(1977)；Letsinger，R.L.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)143487-3499(1986)；Sawai等，化學通訊(Chem.Lett.)805(1984)；Letsinger，R.L.等，美國化學協會雜志(J.Am.Chem.Soc.)1104470(1988)；和Pauwels等，Chemica.Scripta 26141-149(1986))、硫代磷酸酯(Mag，M.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)191437-1441(1991)；和美國專利5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等，美國化學協會雜志(J.Am.Chem.Soc.)1112321(1989))、O-甲基氨基磷酸鹽鍵(O-methylphosphoroamidite linkages)(見Eckstein，F.，寡核苷酸及類似物實用方法(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach)，牛津大學出版社，1991)，及肽核酸的主鏈和鍵(Egholm，M.美國化學協會(Am.Chem.Soc.)1141895-1897(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.311008(1992)；Egholm，M，自然(Nature)365566-568(1993)；Carlsson，C.等.自然(Nature)380207(1996)，全部被引入作為參考)。其它類似物核酸包括具有正電(positive)主鏈的那些(Dempcy，R.O.等，美國國家科學院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)926097-6101(1995))；非離子主鏈(美國專利5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.(英文)30423(1991)；Letsinger，R.L.等，美國化學協會雜志(J.Am.Chem.Soc.)1104470(1988)；Letsinger，R.L.等，核苷與核苷酸(Nucleoside & Nucleotide)131597(1994)；Y.S.Sanghui和P.Dan Cook編輯的ASC討論叢書(ASC SymposiumSeries)580，“反義研究中的糖修飾”(Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch)，第2和3章；Mesmaeker等，生物有機化學和醫學化學通訊(Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.)4395(1 994)；Jeffs等，J.Biomolecular NMR3417(1994)；四面體通訊(Tetrahedron Lett.)37743(1996))和非核糖體主鏈，包括在美國專利5,235,033和5,034,506、和Y.S.Sanghui和P.Dan Cook編輯的ASC討論叢書(ASC Symposium Series)580，“反義研究中的糖修飾”(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)，第6和7章中描述的那些。含有一個或多個碳環糖的核酸也包括在核酸的定義中(見Jenkins等，化學協會研究(Chem.Soc.Rev.)169-176(1995))；所有引用的文獻在此特別地被引入作為參考。
在一個優選實施方案中，核酸是肽核酸(PNA)，其包括肽核酸類似物。與天然核酸的高電荷磷酸二酯主鏈相反，在中性條件下這些主鏈基本上是非離子的。這帶來許多優點。PNA主鏈具有增強的雜交動力學。在錯配的解鏈溫度下(Tm)的PNAs具有比最佳匹配的堿基對更多的電荷。內部錯配時DNA和RNA的Tm通常降低2-4℃，而具有非離子的PNA主鏈則降低約7-9℃。類似地，由于其非離子的特性，結合到這些主鏈的堿基的雜交對鹽濃度相對不敏感。特別優選的是能夠通過聚合酶延伸的PNA衍生物。這些引物包含具有結合的核苷酸的PNA低聚物，該低聚物可以被聚合酶識別和延伸(見Lutz，M.J.等，核苷與核苷酸(Nucleosides Nucleotides)18393-401(1999)和Misra，H.S.，生物化學(Biochemistry)371917-1925(1988)；出版物在此被引入作為參考)。具有核苷酸和二核苷酸3’末端的PNAs能夠被一些聚合酶識別和延伸，存在PNA片段將使PNA-修飾鏈抵抗核酸酶、特別是5’-3’外切核酸酶。
雖然引物通常是單鏈的，在此描述的核酸可以是單鏈或雙鏈的，特別地，或含有雙鏈或單鏈序列的部分。雖然一般天然的堿基是優選的，核酸可以是DNA、RNA或雜交體，其中核酸含有任何脫氧核糖核酸和核糖核酸的組合，和任何堿基的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶(isocytosine)、異鳥嘌呤(isoguanine)、次黃嘌呤核苷等。在此所用術語“核苷(nucleoside)”包括核苷酸以及核苷和核苷酸類似物，和被修飾的核苷如氨基修飾的核苷。此外，“核苷”包括非天然的類似物結構。因此，例如，含有堿基(a base)的肽核酸(PNA)的獨立單位在此稱作為核苷酸。
本領域技術人員可以預期，所有這些核酸類似物都可以用于本發明。此外，可以制備天然核酸及其類似物的混合物或者不同核酸類似物的混合物。
引物核酸的大小是變化的，這是本領域技術人員可以預期的，一般長度在5-500個核苷酸間變化，在10-100個核苷酸之間的引物是優選的，在12-75個核苷酸之間的引物更加優選，而在15-50個核苷酸之間的引物是極其優選的，這取決于具體的用途、所需特異性和擴增技術。
一般地，本發明的組合物提供與靶核酸的第一條單鏈雜交的第一引物以及與靶核酸的第二條單鏈雜交的第二引物，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補的。引物與各自的鏈雜交時能夠通過聚合酶進行引物延伸。也就是說，與靶核酸雜交的引物具有與靶核酸的核苷酸殘基互補的3’末端核苷酸殘基，使得引物能夠引物延伸。
在一個優選實施方案中，至少引物之一還包含至少一個變化的或者突變的核苷酸殘基，在引物相互雜交時在變化的殘基與另一條引物的3’末端核苷酸之間產生錯配。此處的“變化的”、“改變的”或“突變的”核苷酸殘基是指產生所需錯配的引物核苷酸殘基的任何改變，如顛換和轉換。在3’末端核苷酸上出現錯配阻斷了通過聚合酶的延伸，從而限制了非靶核酸的被動延伸反應。
因此，在一個優選實施方案中，至少第一引物的一個核苷酸被改變來在第一引物和第二引物相互雜交時，在變化的殘基和第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
對于任何的引物對，引物相互雜交的能力可以通過將第一引物的序列與第二引物對比來檢測。確定雜交的穩定性、特別是熱解鏈溫度(Tm)可以采用下面描述的方法和通過本領域熟知的方法(見Breslauer，T.等，美國國家科學院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838893-8897(1986)；Wetmur，J.G.，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26227-259(1991)；Rychlik，W.等，J.NIH Res.678(1994))；Wallace Rule estimations(Suggs，S.V.等，“化學合成的寡脫氧核苷酸用于特異的克隆DNA序列的分離”(Use of Synthetic oligodeoxribonucleotidesfor the isolation of specific cloned DNA sequences)，利用純化基因的發育生物學(Developmental biology using purified genes)，D.B.Brown編輯，第683-693頁，學院出版社(Academic Press)，紐約，1981)，和基于Bolton和McCarthy的T檢驗(T estimations based on Bolton and McCarthy)(見Baldino，F.J.等，酶學方法(Methods Enzymol.)168761-777(1989)；Sambrook，J.等，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第10章，冷泉巷出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉巷(Cold Spring Harbor)，紐約，2001)。所有文獻在此特別地引入作為參考。當評價雜交穩定性時，各種參數的影響其中包括，離子強度、探針長度、G/C含量，和錯配都被考慮。對這些因素的考慮對于本領域技術人員來說是熟知的(Sambrook，J.，同上文)。
引物之間形成的雜合體是否能夠通過聚合酶無模板地被動延伸，可以通過雜合體的3’末端區域是否具有互補性來評定。能夠通過聚合酶延伸的那些雜合體的至少一條引物的3’末端核苷酸與其它引物的核苷酸序列互補(Watson，R.擴增(Amplifications)5-6(1989))。因此，包含與至少一條引物的至少3’末端核苷酸互補的雜合體被選擇，進行引物序列的變化或突變。由于接近3’末端的核苷酸錯配時通過聚合酶的引物延伸的效率較低，具有至少2個或多個核苷酸變化對于引物雜合體來說是優選的，在3’末端區域具有3個或更多個互補的核苷酸的雜合體是最優選的。還可以采用各種計算方法確定3’末端區域具有互補性的雜合體，例如，擴大(Amplify)1.2軟件(威斯康星州大學，遺傳系，麥迪遜，威斯康星州。
另外，通過在無靶核酸時進行擴增反應和如通過電泳檢測引物-二聚體種類的生成，很容易確定非靶核酸被動引物延伸的產物的存在。在此所用的“引物-二聚體”是指由引物與其它引物雜交引起的非靶核酸通過聚合酶的被動延伸。還可以在缺乏或存在靶核酸時進行擴增反應，并分析擴增產物的融合曲線，來確定引物-二聚體的存在(見Ririe，K.M.生物化學年評(Anal.Biochem.)245154-160(1997)；引入作為參考)。
在一個優選實施方案中，變化的或突變的核苷酸殘基離引物的3’末端足夠遠，使得當引物與各自的靶核酸鏈雜交時可以通過聚合酶進行有效擴增。由于已知3’末端核苷酸或接近3’末端核苷酸的錯配會影響引物延伸，變化的核苷酸殘基至少是被1個或多個來自改變的引物的3’末端核苷酸的殘基。更優選地，變化的殘基至少是2個或更多個殘基，而在最優選的實施方案中，變化的殘基3個或更多個來自3’末端核苷酸。
在本發明的另一個優選實施方案中，在擴增反應中所用的兩條引物包含至少一個變化的核苷酸殘基，使得引物相互雜交在兩條引物的3’末端殘基上產生錯配以阻止通過聚合酶的延伸。當每條引物具有與另一條引物的3’末端區域互補時出現這種情況。因此，在一個優選的實施方案中，除了在第一引物上的至少一個變化的核苷酸殘基外，第二引物上至少一個核苷酸殘基被改變，使得當第一引物與第二引物相互雜交時在第二引物上被改變的殘基與第一引物的3末端核苷酸之間產生錯配。如上討論，被改變的殘基優選為至少一個核苷酸殘基，更優選為至少2個核苷酸殘基，和最優選為第二引物3’末端核苷酸的至少3個核苷酸殘基。由于第一引物和第二引物的3’末端核苷酸殘基未被改變，當引物與各自的靶核酸鏈雜交時，它們仍然能夠通過聚合酶延伸。因此，當非靶核酸未被擴增時，靶核酸容易被擴增。
雖然上述的實施方案涉及兩種能夠相互雜交的不同引物，還存在引物與自身互補的情況，產生單引物的引物-二聚體產物。因此，本發明不限于不同的引物，還適用于在擴增反應中產生引物-二聚體的自身互補的引物。
考慮到用于限制非靶核酸被動擴增的引物的總體設計，本發明還提供用于擴增靶核酸的重復區域中的大量重復單位的組合物。在此所用的“重復單位”(repetitive unit)、“重復單位”(repeat unit)、“重復元件”或者語法上的等同物是指在重復區域中反復或重復的最小核苷酸序列。擴增的重復單位可能包含任何重復序列，具有1個或多個核苷酸的重復單位是優選的，更加優選的重復單位在3-100個核苷酸之間，和最優選的重復單位在4-30個核苷酸之間。總之，雖然在重復單位之間存在非重復的核苷酸，這些重復單位以串聯方式排列。在此“大量”的重復元件是指重復區域中的至少2個和多個重復單位。這些重復區域包含天然存在的重復區域，如著絲粒和端粒包含的重復區域，或者可能包含例如通過轉染、重組或位點特異性整合(如逆轉錄病毒呈遞)被導入細胞或生物中的重復區域。每套引物擴增的重復單位的數量依賴于引物長度和重復單位的核苷酸長度。這對于本領域技術人員來說是可預期的，引物序列和引物長度可以依據引物對該重復單位的穩定性和特異性來選擇。
在一個優選實施方案中，用于擴增重復區域的重復單位的組合物包含雜交到靶核酸的第一條鏈上的至少一個重復單位上的第一引物和雜交到靶核酸的第二條鏈上的至少一個重復單位上的第二引物，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補的。當引物雜交到其各自的靶核酸鏈時能夠引物延伸。也就是說，雜交到靶核酸的引物，其3’末端核苷酸殘基與靶核酸上的核苷酸殘基互補，使得這些引物能夠起始延伸(primer extension)。一個方面，至少一條引物的至少一個核苷酸殘基被改變來與引物所雜交的至少一個重復單位的核苷酸殘基產生錯配，其中在引物相互雜交時被改變的核苷酸殘基還與另一條引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配，從而限制起始引物-引物二聚體雜合體的延伸。
因此，在一個優選實施方案中，第一引物的至少一個核苷酸殘基被改變，以在被改變的殘基與引物所雜交的第一條鏈上的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中在第一引物和第二引物相互雜交時被改變的核苷酸殘基還與第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
被改變的殘基優選為至少1個核苷酸殘基，更優選地至少2個核苷酸殘基，和最優選地3’末端核苷酸的3個核苷酸殘基，使得當被改變的引物雜交到靶核酸時可以通過聚合酶的有效延伸。
在另一個方面，用于擴增重復單位的兩條引物都包含至少一個被改變的核苷酸殘基，使得引物相互雜交在被改變的殘基與兩條引物的3’末端殘基之間產生錯配。因此，在一個優選實施方案中，除了上述的第一引物上的被改變的殘基之外，第二引物的至少一個核苷酸殘基被改變來在被改變的殘基與第二引物所雜交的第二條鏈的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中在引物相互雜交時第二引物上被改變的殘基還與第一引物的3’末端殘基產生錯配。
在還有一個用于擴增重復區域的重復單位的優選實施方案中，本發明包含雜交到靶核酸的第一條單鏈上的一個以上重復單位的第一引物和雜交到靶核酸的第二條單鏈上的一個以上重復單位的第二引物，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補的。如上所述，在雜交到各自的靶核酸鏈上時引物能夠引物延伸。在一個方面，至少一條引物的核苷酸殘基被改變來在被改變的殘基與引物所雜交的靶核酸的一條鏈上的每個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸產生錯配。在引物相互雜交時，這些被改變的核苷酸殘基還與另一條引物的3’末端核苷酸殘基產生錯配，從而進一步限制引物-引物二聚體雜合體的起始-延伸。
因此，在一個優選的實施方案中，第一引物的核苷酸殘基被改變，來在被改變的殘基與引物所雜交的靶核酸的第一條鏈的每個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配。在第一引物和第二引物相互雜交時，這些被改變的核苷酸還與第二引物的3’末端核苷酸殘基產生錯配。
被改變的核苷酸殘基優選至少1個核苷酸殘基，更優選地至少2個核苷酸殘基，和最優選地3’末端核苷酸的3個核苷酸殘基，使得當被改變的引物與靶核酸雜交時可以通過聚合酶有效延伸。
在另一個方面，兩條引物都含有被改變的殘基，使得引物相互雜交產生兩條引物的3’末端核苷酸的錯配。因此，在一個優選實施方案中，除了第一引物的被改變的核苷酸殘基外，第二引物上的核苷酸殘基也被改變來在第二條引物的被改變殘基與引物所雜交的第二條鏈的每個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配。當引物相互雜交時，第二引物上的這些被改變的核苷酸還與第一引物的3’末端核苷酸殘基產生錯配。
由于雜交到靶核酸的引物必須能夠起始延伸，第一引物和第二引物的改變必須位于重復單位的非互補核苷酸上。因此，在一個方面，當第一引物和第二引物都包含被改變的殘基時，該變化在重復單位的鄰近核苷酸位置上。在另一個方面，該變化位于重復單位的不毗連的核苷酸位置上。總之，位于鄰近核苷酸位置上的錯配在改變的核苷酸和3’末端核苷酸之間產生最多配對的堿基或互補殘基，這對于有效擴增短重復序列(即3-6個堿基對)是重要的。
在另一個優選實施方案中，第一引物和第二引物還包含不與靶核酸雜交(即堿基配對)的5’末端區域。該不配對的區域包含一個或多個核苷酸，優選范圍是3-60個核苷酸，最優選范圍是4-30個核苷酸。當引物被用于擴增重復區域的重復單位時，5’端不配對區域阻斷被復制的引物延伸產物的3’末端在隨后的擴增循環中從擴增產物的內部重復單位起始核酸合成。
雖然5’端不配對區域可以是不與靶核酸雜交的任何序列，在優選實施方案中，不配對的區域包含限制性位點、用于測序或起始延伸反應(即擴增)的特定序列(unique sequence)、或者用于檢測和測量擴增產物的標記序列。
在一個優選實施方案中，本發明的引物被設計成具有類似Tms。在此所用具有類似Tms的引物具有約10℃或更小的Tm差值，優選5℃或更小，和更加優選2℃或更小。采用具有相同或相似Tms的引物組(如引物對)，使得可以采用在特定的擴增條件下對兩條引物來說是最佳的并且產生類似擴增效率的退火/延伸溫度。優點在于可以使用相似濃度的引物，特別是低濃度，其限制不期望的擴增產物的產生。比較而言，當引物的Tms不同時，一條引物采用較高濃度來彌補擴增效率的差異。較高的引物濃度在較少的PCR循環中產生不期望的擴增產物。
在一個方面，通過改變引物長度或通過選擇具有類似鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)含量的引物來制備具有相似Tms的引物。Tms通過上述方法來評價。在此所用“類似GC含量”是指一個引物組，其GC含量差別約10％或更低，更優選差別約5％或更低，和最優選差別約2％或更低，使得引物具有如上定義的相似Tms。在引物設計方法中，最先被評價與靶核酸雜交的區域的Tm和/或GC含量。對于具有上述非雜交5’末端區域的引物，對整條引物進行額外的Tm和GC含量分析。總之，引物被設計成3’末端區域的GC含量具有較高相似性，由于該區域是通過聚合酶延伸的區域。
本發明的引物可被用于擴增各種靶核酸。一個簡單的引物組，如引物對，被用于擴增單個靶核酸，或者多個引物組被用于擴增大量靶核酸。可以對每個特定的引物組分別地進行擴增，或者在單個反應容器采用引物組的組合，本領域通常知曉的多重聚合酶鏈式反應。當在一個反應中采用多種引物組，引物被設計來限制不期望的產物的形成和限制每個引物組中引物間的干擾。
由于本發明涉及用上述的引物來擴增靶核酸，本發明還提供用于擴增靶核酸序列的方法。在一個優選實施方案中，該方法包括將包含基本上互補的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與上述的第一引物和第二引物接觸，通過聚合酶鏈式反應擴增靶核酸。
此處“靶核酸”或“靶序列”或語法意義上的等同物是指雙鏈或單鏈核酸的核酸序列。靶序列可能是基因、調控序列、基因組DNA、cDNA、RNA包括mRNA和rRNA或者其它核酸的一部分。其可以是任意長度，應當理解，較長的序列更特異。在一些實施方案中，期望可以將樣本核酸切割或裂解成100-10,000堿基對的片段，在一些實施方案中，具有約500個堿基對的片段是優選的。切割或裂解可以通過任何本領域技術人員知曉的方法進行，包括機械的、化學的、和酶學的方法。因此，核酸可以進行超聲處理、弗氏細胞壓碎(French press)、剪切或者用核酸酶(如DNA酶、限制性酶、RNA酶等)或者化學裂解試劑(如酸/哌啶(piperidein)，肼/哌啶，鐵-EDTA復合物，1，10-鄰二氮雜菲-銅復合物等)處理。
本領域技術人員可以預期，靶序列可以是多種形式的。例如，其可以被含有在較大的核酸序列中，即全部或部分基因或mRNA，質粒或基因組DNA的限制性片段，等。包含靶序列的樣本可以得自任何生物的任何組織，包括血液、大腦、骨髓、淋巴、肝臟、脾臟、乳房、上皮(如皮膚、口腔等)、或者其它組織，包括從活體解剖中獲得的組織。樣本還包括機體排泄物或液體，如唾液、尿液、糞便、腦脊髓液、精液、乳汁等。靶核酸的其它來源包括細菌、酵母、植物、病毒或其它含有核酸的致病的或非致病生物。核酸也可以是通過化學的或酶學的方法如PCR反應人工制備的任何核酸。
靶序列可以采用熟知的技術制備。例如，樣本用去污劑、超聲波、電泳、變性劑等處理來破壞細胞、細菌或病毒。靶核酸如按需被純化。反應的成分被同時或按照下面指出以任何次序順序加入。此外，各種試劑被加到反應中來實現最佳雜交、擴增和檢測。這些試劑包括鹽、緩沖液、中性蛋白、去污劑等。根據樣本制備方法和靶核酸的純化，其它試劑被加入來提高反應效率，如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗菌劑等。當靶核酸為RNA時，這些核酸被轉化為DNA，例如通過用逆轉錄酶(如MoMuLV逆轉錄酶、Tth逆轉錄酶等)處理，這在本領域是熟知的。
當靶核酸是雙鏈核酸時，被變性來產生第一單鏈和第二單鏈以便引物的雜交。雖然根據雙鏈核酸的性質可以采用堿性pH、變性劑(如甲酰胺)和其它技術，可以采用任意多個變性步驟如調節溫度為約95℃。
引物與靶核苷酸接觸使得第一引物能夠與靶核酸的第一條鏈雜交和第二引物能夠與靶核酸的第二條鏈雜交。采用各種雜交條件來形成雜合體，包括高度、中度和低度嚴緊的條件(見如，Sambrook，J.，分子克隆實驗室手冊，第3版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，2001；Ausubel，F.M.等，分子生物學中的現有方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons，updates to 2001；所有這些在此被引入作為參考)。嚴緊條件是序列依賴的，在不同條件下是不同的，包括引物長度、錯配數量、G/C含量和離子強度。核酸雜交的教導在Tijssen，P.，“雜交原理和核酸分析策略的綜述”(Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic AcidAssays)，生物化學和分子生物學中的實驗室技術與核酸探針雜交(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridizationwith Nucleic Acid Probes)，第24卷，Elsevier，阿姆斯特丹，1993)中提供。一般地，嚴緊條件被選擇為比特定溶液條件下(如離子強度、pH、核酸濃度)特定雜合體的熱解鏈點(Tm)低5-10℃。Tm定義為在特定溶液條件下，平衡時50％與靶核酸互補的引物序列被雜交或為單鏈的溫度。一般地，溶液條件是用于擴增靶核酸的溶液條件。由于嚴緊程度通常區別在于雜交溫度和Tm，即使雜交的溶液條件發生改變，只要與Tm的溫度差別是恒定的，可以保持嚴緊程度。雜交條件也可能隨著核酸主鏈的類型如核糖核酸或肽核酸(PNA)主鏈而變化。
在引物與靶核酸雜交和擴增反應中，通常在存在靶核酸時能夠形成雜合體的嚴緊條件下進行分析。本領域技術人員能夠改變溫度、鹽濃度、pH、有機溶劑、離液劑等參數或者其它變量來控制雜交的嚴緊性，還最小化引物與非特異性靶的雜交(如通過采用“熱啟動”PCR和者“降落”PCR)。
在將引物與靶核酸接觸后，用擴增酶通常是聚合酶來處理反應。各種合適的聚合酶在本領域是已知的，其中包括Taq聚合酶、KlenTaq、Tfl聚合酶、DynaZyme等。一般地，雖然所有的聚合酶都可用于本發明，但是由于采用具有強3’-5’外切活性的聚合酶傾向于切除錯配的3’末端核苷酸，優選的聚合酶是缺乏3’-5’外切活性的熱穩定聚合酶。也可以采用被構建來降低或無功能性的3’-5’外切活性的聚合酶(如，Pfu(exo-)、Vent(exo-)、Pyra(exo-)等)。還可以采用用于最佳地延伸被雜交的引物的聚合酶的混合物。在另一個方面，用于本發明的聚合酶被配制成僅在適合于擴增的溫度下具有活性。存在抑制聚合酶的抗體是合適的，抗體在擴增溫度下被滅活，或者以使酶在達到擴增溫度時才可獲得的方式封閉該酶。這些聚合酶制劑可以在單個反應容器中混合所有成分，而阻止非靶核酸序列的引發。
在另一個方面，本領域技術人員能夠預期，各種試劑可以被加到反應中來提高聚合酶的持續合成能力，穩定以防止聚合酶失活，降低引物的非特異性雜交，或者提高復制效率。這些添加劑包括但不限于二甲基亞砜、甲酰胺、乙酰胺、甘油、聚乙二醇，或proteinacious試劑如大腸桿菌單鏈DNA結合蛋白、T4基因32蛋白、牛血清白蛋白、明膠等。在另一個方面，本領域技術人員可以采用各種核苷酸類似物來擴增特定的序列，如富含GC或重復序列。這些類似物其中包括c7-dGTP、羥甲基-dUTP、dITP、7-脫氮(deaza)-dGTP等。
按照本領域熟知的方法進行擴增反應。聚合酶鏈式反應方法被廣泛地使用和描述(見如，美國專利4,683,195和4,683,202；在此引入作為參考)。簡而言之，雙鏈的靶核酸被變性，通常在足以使該鏈變性的溫度下溫育，然后在存在過量引物下溫育，引物與單鏈靶核酸雜交(即退火)。DNA聚合酶延伸雜交的引物，產生新的靶核酸的拷貝。得到的雙鏈被變性，重復雜交和延伸的步驟。在存在與靶核酸互補的第二引物時，通過重復變性、退火和延伸的步驟，被這兩條引物所限定的靶核酸被指數性地擴增。引物延伸步驟的時間和溫度取決于聚合酶、被擴增的靶核酸的長度和用于擴增的引物序列。充分地擴增靶核酸所需的重復步驟數取決于每個循環的擴增效率和靶核酸的起始拷貝數。這在本領域是熟知的，這些參數可以由技術人員調整以達到期望的擴增水平。本領域的技術人員能夠理解，本發明不受到用于擴增過程的時間、溫度、緩沖條件和擴增循環的變化的限制。
通過本領域熟知的方法來檢測和分析擴增產物。擴增產物在該產物的分離和/或純化后被分析，或者直接檢測在擴增反應中形成的產物。分離和純化的方法其中包括電泳，包括毛細管電泳(如在瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠中)；層析(如親和層析、分子篩層析、反向層析等)；和雜交。被純化的產物進一步進行本領域熟知的擴增。進行檢測，產物用熒光化合物直接鑒定，如用溴乙啶或SYBRTM綠，或者通過與標記的核酸探針雜交。另外，被標記的引物或被標記的核苷酸被用于擴增反應來標記擴增產物。標記包括任何可檢測的成分，包括熒光標記、放射性標記、電子標記，和間接標記如生物素或地高辛。當采用間接標記時，采用結合間接標記的第二結合試劑來檢測擴增產物的存在。這些第二結合試劑包含與間接標記結合的抗體、半抗原或其它結合配偶體(如抗生物素蛋白)。第二結合試劑優選用熒光成分、放射性成分、酶等標記。
在另一個優選實施方案中，擴增產物在擴增反應中通過實時定量PCR被檢測和量化，實時(real time)定量PCR的改變在本領域是熟知的。例如，TaqMan系統采用與被引物限定的核酸片段中的內部序列中的序列雜交的探針引物，引物用于擴增靶核酸(Heid，C.A.等，基因組研究(Genome Res.)6986-994(1996)；Holland，P.M.等，美國國家科學院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)887276-7280(1991)；引入作為參考)。該探針用兩種不同的熒光染料(即雙標記熒光寡核苷酸探針)標記，5’末端報道(reporter)染料(TAMRA)和3’末端熒光淬滅染料(FAM)。在PCR延伸階段通過DNA聚合酶的5’-3’外切核酶活性裂解探針，從淬滅劑附近釋放熒光分子，從而增強了熒光強度。
在另外一個方面，實時定量PCR可能基于雜交探針之間的熒光能量共振轉移(FRET)(Wittwer，C.T.生物技術(Biotechniques)22130-138(1997)；引入作為參考)。這種方法中，兩條寡核苷酸探針雜交到靶核酸效率的鄰近區域。上游的探針的3’末端用激發染料(excitor dye)(如FITC)標記，而毗鄰雜交的下游探針的5’端用報道染料標記。兩個探針雜交到被擴增的核酸序列使得兩種染料處于足以使FRET發生的接近位置。這使得可以在聚合酶鏈式反應過程中監測被擴增的產物的數量。一種相似的方法用于分子束探針(Tyagi，S.國家生物技術(Nat.Biotechnol.)1649-53(1998)；引入作為參考)。分子束是在PCR生產特異性寡核苷酸的兩端分別包含淬滅染料和報道染料的寡核苷酸探針。染料還基于FRET起作用，因此可能還由激發染料和報道染料組成。5’末端和3’末端的短互補片段可以形成莖-環結構，其使寡核苷酸末端的染料十分接近，從而導致熒光淬滅或FRET。當寡核苷酸通過分子束探針的內部區域的互補序列雜交到PCR產物上，會影響寡核苷酸探針的熒光，從而可以監測產物的合成。
實時定量PCR還采用在PCR反應中優先地結合到雙鏈核酸擴增產物的熒光染料，從而可以持續地檢測產物合成(Higuchi，R.等，生物工藝學(Biotechnology)111026-1030(1993)；Morrison，T.B.等，生物技術(Biotechniques)24954-962(1998))。適合的熒光染料其中包括溴乙啶、YOPRO-1TM(Ishiguro，T.，分析生物化學(Anal.Biochem.)229207-213(1995))和SYBRTM綠染料(分子探針(Molecular Probes)，Eugene，OR，美國)。當擴增包含重復區域的靶核酸時，FRET和分子束探針不是優選的，當FRET或分子束探針被導向重復單位時，會雜交到引物的重復序列上，從而不能區分引物和被擴增的產物。
在另一個優選實施方案中，實時定量PCR用接近3’末端核苷酸結合了單一熒光團(flurophore)的引物來進行(Nazarenko，I.等，核酸研究(NucleicAcids Res.)30e37(2002)；Nazarenko，I.等，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)302089-2195(2002)；LUXTM熒光引物，Invitrogen，Palo Alto，CA；在此引入作為參考)。這些引物的5′末端有能夠與3’末端區域雜交來產生平端發夾(即莖-環)結構的5-7個核苷酸區域，該結構形成導致熒光團的熒光淬滅。當引物形成二聚物(duplex)時，如通過在模板上起始延伸，該淬滅被降低或消除，從而在樣本中測量PCR產物。由于只采用單一熒光團(fluorphore)，在一個反應中可以使用和檢測不同的熒光團(flurophore)。因此，通過使用具有可區別的熒光團的不同引物組，這些引物可以用于在一個反應容器中擴增和檢測大量不同靶核酸。如此處所討論，不同的靶核酸包括單拷貝基因和重復序列的組合。
適合用于實時監控PCR反應的儀器可以用于定量PCR方法(ABI Prism7700，Applied Biosystems Division，Perkin Elmer，福斯特城，CA，美國；LightCyclerTM，Roche Molecular Biochemicals，印第安納波利斯，IN，美國)。
當實時定量PCR用于檢測和測定擴增產物時，各種算法被用于計算樣本中的靶核酸的數量(見ABI Prism 7700軟件版本1.7；LightcyclerTM軟件版本3；引入作為參考)。量化包括使用具有已知拷貝數的靶核酸的標準樣本和從標準物的計算和閾值循環(Ct)中得到標準曲線。總之，Ct是PCR循環或部分PCR循環，其中擴增產物產生的熒光偏離上述基線熒光數倍(Higuchi，R.等，同上)。實時定量PCR產生7-8倍數量級的線性關系，可以在一個較寬的動力學范圍內測量靶核酸的拷貝數。靶核酸拷貝數的絕對數量可以從比較標準曲線與樣本的Ct值得到。
靶核酸的拷貝數還可以通過比較定量實時PCR來確定。采用已知拷貝數或恒定拷貝數的核酸可以測定樣本中靶核酸的拷貝數。標準物可以是單拷貝基因、已知拷貝數的核酸、或當定量RNA拷貝數時為組成型地表達的看家基因(見Johnson，M.R.分析生物化學(Anal.Biochem.)278175-184(2000)；Boulay，J.-L.，等，生物技術(Biotechniques)27228-232(1999))。
上述組合物和方法可用于聚合酶鏈式反應擴增靶核酸的任何方法中。因此，本發明可用于檢測和監控傳染病，例如用于檢測病原性細菌和病毒的存在(如病毒載量)。例如，靶病毒核酸包括而不限于HIV，HCV細胞巨噬化病毒、肝炎等載量。本發明還可用于監控醫學治療。例如包括監控施用抗生素后的細菌感染進程。
本發明可應用于描述細胞的功能狀態，特別是與疾病狀態相關的細胞變化。例如，在卵巢或乳癌(breast cancer)的癌癥發展過程中擴增特定的基因片段不僅與癌癥階段而且與存活率相關(見Kalioniemi，A.等，美國國家科學院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)912156-2160(1994))。因此，基因擴增量化對于各種腫瘤具有診斷和預后的價值(Kawate，S.等，腫瘤學(Oncology)57157-163(1999)；Biechi，I.等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)78661-666(1998))。相反，遺傳元件的缺失(即缺乏雜合性或微衛星不穩定性)還與特定疾病狀態相關，從而提供了有用疾病診斷的焦點。例如，在直腸癌中常常出現染色體區的18q21缺失，而在各種癌癥類型中位于染色體17pl3.1的抑制子p53基因常常缺失。(Largey，J.S.等，癌癥(Cancer)171933-1937(1993))。
在細胞功能和疾病中極其重要的是重復序列，特別是在許多生物基因組中發現的串聯重復序列。在真核細胞中，這些序列一般被分成三種主要類型衛星、小衛星和微衛星。衛星DNAs的重復長度約1到數千個堿基，構成達到10億個堿基對簇的重復區域，例如真核細胞染色體中的異染色質區中。這些序列主要與著絲粒和端粒相關。小衛星序列是中度重復的，約9-100個堿基對重復的串聯重復排列，通常具有約0.5-30kb的平均排列長度。這些通常存在于常染色質區，其大小變化大。微衛星是短(即約2-6個堿基對)重復的中度重復排列。這些重復的拷貝數在典型為約10-100個堿基的平均排列大小的群體中變化。在大多數情況下，重復范圍的變化通常與特定疾病相關。例如，三聯體重復CGG、CTG和GAA的拷貝數的增加與亨廷頓病(Huntington’s disease)、脆性X綜合征(Fragile X syndrome)、以及肌強直性營養障礙(myotonic dystrophy)相關。這些三聯體重復的放大程度通常與疾病的嚴重性和起始相關，使得繼承放大重復的后代具有更加嚴重的疾病或者，如果該疾病不是先天性的，會在較早時期發生。與串聯重復序列的放大相關的疾病不限于三核苷酸重復，包括較大的重復單位(Lafreniere，R.G.等，國家遺傳學(Nat.Genet.)15298-302(1997))。
串聯重復序列還具有重要的生物學功能。除了一些例外(如芽殖酵母)，絕大多數的植物、動物和真菌的著絲粒具有大量串聯重復序列的排列。雖然這些序列的生理作用尚不清楚，一般認為它們在kinetichore的裝配中起作用，以確保忠實有效的染色體分離。因此，確定重復數的可變性提供關于著絲粒的功能和調控以及與著絲粒功能紊亂相關的疾病的信息。
更加確定的細胞功能的重要性是包含線性真核染色體的端粒的串聯重復序列。端粒DNA或端粒區是位于染色體末端的染色體區，由范圍在5-26個堿基對的短序列重復單位的串聯排列構成。不同生物的端粒區的重復單位或重復序列是不同的。這些重復序列在各種生物中是已知的，包括人和其它哺乳動物、四膜蟲(Tetrahymena)、酵母、果蠅(Drosophila)和線蟲類。在人類中，端粒重復單位是5′-TTAGGG-3′，而四膜蟲的重復單位是5′-TTGGGG-3′。
端粒重復單位不僅是種屬間重復序列不同，而且在生物中重復單位數量也是變化的。已經知道端粒的長度和完整性對于細胞生長和染色體的正確分離是重要的。例如，許多種癌癥的發展與端粒維持的激活相關，細胞老化是雖然正常的復制信號還存在而細胞已經失去復制的能力的狀態，與端粒完整性的缺乏有關。例如，端粒縮短引起細胞增生性老化，而端粒酶抑制會導致引起細胞凋亡(Zhang，X.等，基因發育(Genes Dev.)2388-2399(1999))。而且，敲除小鼠的端粒酶RNA導致發育缺陷、老化相關疾病和增加癌癥易感性(Rudolph，K.L.等，細胞(Cell)96701-712(1999)；Herrera，E.等，EMBO雜志(EMBO J.)182950-2960(1999))。
因此，測定特定重復序列的重復單位數量具有重要應用，包括但不限于癌癥診斷、老化相關的疾病、克隆生物的整合、篩選遺傳疾病、和用于指向調控重復序列長度的酶(即端粒酶)和細胞路徑的試劑的藥物篩選。
因此，在一個優選實施方案中，本發明提供端粒長度的快速分析方法，通過用不會產生引物-二聚體但是當雜交到端粒重復單位時能起始延伸的引物直接擴增重復序列。由于各種生物的端粒具有不同的重復單位序列，擴增特定生物的端粒將采用特異于該生物的重復單位的引物。在此采用人端粒序列來闡明本發明用于直接擴增和量化串聯重復核酸序列的實際操作，但不限于在此描述的特定實施方案。
進行確定端粒重復單位的數量時，選擇的引物與重復區域的重復單位互補。第一引物具有與靶核酸的第一條單鏈上的端粒重復序列互補的序列，而第二引物具有與靶核酸的第二條單鏈上的端粒重復序列互補的序列，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補的。在一個優選實施方案中，第一引物的核苷酸殘基被改變，在被改變的殘基與靶核酸的第一條鏈的每個端粒重復單位相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配。當引物相互雜交時，這些被改變的殘基還與第二引物的3’末端核苷酸產生錯配。在另一個優選實施方案中，第二引物的核苷酸殘基還類似地被改變，使得引物相互雜交導致第一引物和第二引物具有錯配的3’末端核苷酸。
在優選的實施方案中，被改變的核苷酸殘基在第一引物和第二引物上產生錯配，來限制任何引物-二聚體產物的形成。在這種排列中，錯配位于重復單位的鄰近的或非鄰近的核苷酸位置上。位于重復單位的鄰近核苷酸位置上的錯配最大化3’末端核苷酸與每條引物的被改變的殘基的堿基配對的數量。附圖1中給出用于擴增人端粒重復單位的引物示例。
將第一引物和第二引物與單鏈形式的重復區域接觸后，引物被聚合酶延伸，通過重復變性、退火和延伸的循環擴增重復單位。在優選實施方案中，5’末端區域變化非堿基配對的序列來限制從被擴增的重復序列的內部重復起始。
擴增產物如上述被量化。在優選實施方案中，實時定量PCR用于確定靶核酸樣本中的端粒重復單位的拷貝數。用于確定和比較端粒重復單位數量的標準物包括使用單拷貝基因(如核糖體磷蛋白364B)或者已知拷貝數的靶核酸(如具有已知端粒重復單位數量的質粒)。采用在此描述的方法，大量樣本的重復單位的拷貝數被量化來確定端粒重復單位的數量，以及端粒的平均長度。
測定端粒重復單位的數量可以廣泛應用于醫學診斷、疾病預測和治療。由于端粒酶活性的激活與細胞無限增殖相關，本發明可用于確定各種類型癌癥細胞的端粒長度。細胞可以被持續地被分析來確定端粒的增加、減少或穩定是否與疾病進展相關。用于檢測的各種癌癥細胞類型包括乳房、肝臟、腦、骨骼、前列腺、淋巴細胞、黑素瘤、結腸癌等。
本發明還可以應用于診斷與老化早期起始相關的疾病。例如，具有兒童早衰癥(Hunchinson Gilford progeria disease)的個體表現為與端粒長度損失相關的過早老化和成纖維細胞的增生能力下降(Alssopp，R.C.等，美國國家科學院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910114-10118(1992))，而患有先天性角化不良(dyskeratosis congenita)的患者由于缺失端粒酶RNA，表現為漸進骨髓衰竭、異常皮膚色素沉著、黏膜白斑病(leukoplakia)和指甲營養不良(dystrophy)(見Vulliamy，T.自然(Nature)413432-435(2001))。因此，擴增和量化端粒重復的數量可用于確定特定疾病與端粒長度變化的關系。
另一個優選實施方案中，本發明用于監控治療效果或用于篩選影響端粒長度或端粒酶活性的藥物候選。例如，由于細胞增生潛能與保持端粒完整性相關，本發明可用于監控癌癥治療的效果。監控端粒特征的能力給檢測特定治療和藥理學試劑的效果提供一個窗口。在另一個方面，本發明可用作篩選作用于調控端粒長度的生物學路徑，如端粒酶活性的候選引物的常規方法。快速擴增端粒重復的能力提供了鑒定小分子、候選核酸和影響細胞中的端粒特性的肽試劑的高通量篩選方法。
本領域技術人員應當理解，構建引物的步驟和擴增靶核酸序列的方法可以按照本文提供的選擇進行變化。下面的實施例作為更加充分描述的使用方式和上述發明的最佳模式。但是，還應當可以理解，這些實施方案無論如何不是限定本發明的保護范圍，本領域技術人員可以根據本領域的技術進行改進。本文引用的所有文獻被引入作為參考。
實施例實施例1直接擴增人端粒重復序列基因組DNA通過標準方法從血液樣本中提取。用于比較用于端粒測定的定量PCR與Southern印跡方法的樣本由21位毫不相干的個體提供(11名女性和10男性，年齡在61-94歲)，他們來自猶它(utah家族，是世界上廣泛用于建立遺傳連鎖圖譜的Centre pour les Etudes du PolymorphismeHumaine(CEPH)collection的部分(White，R.等，自然(Nature)313101-105(1985))。被純化的DNA樣本在96-孔微板的10mM Tris-HCl，0.1mMEDTA，pH7.5(最終體積為300ul/孔)中稀釋到約1.75ng/ul，在熱循環中加熱到95℃5min，轉移到冰水浴中5min來迅速冷卻，以700×g離心，用粘性鋁箔封裝，在4℃下保存直到分析。
在分離的96孔平板上對提取的DNA樣本進行實時定量PCR。制備兩種PCR試劑的混合母液(master mix)，一種具有端粒(T)引物對，另一種具有單拷貝基因(S)引物對。根據反應條件，30或10ul的T混合母液被加到第一塊平板的各個樣本孔和標準物曲線孔中，30或10ul的S混合母液被加到第二塊平板的各個樣本孔和標準物曲線孔中。對于每個個體，分析其T/S比，三個相同的20ulDNA樣本的等分試樣(每個試樣35ng)被加到平板1中，而另一三個等分試樣被加到平板2的相同孔位置上。對于每條標準物曲線，標準物DNA樣本在TE(10mM Tris、1mM EDTA，pH7.0)中被連續稀釋，以每次稀釋～1.68倍來產生從0.63ng/ul到5ng/ul的5種DNA濃度范圍，然后分布在20ul等分試樣，加到每個平板的標準曲線孔中。然后平板用透明的粘性膜密封，以700×g離心，在黑暗中4℃下保存直到進行PCR(0-3天后)。
PCR擴增條件取決于所有的引物和被擴增的DNA模板。在一組試驗中，端粒重復序列用引物組tel1(5′-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3′)(SEQ IDNO1)和tel2(5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3′)(SEQ ID NO2)擴增。PCR混合物中試劑的濃度為50ul的最終體積中含有150nM 6-ROX和0.2x SYBRTM綠I(Molecular Probes，Inc.)；15mM Tris-HCl，pH8.0；50mM KCl；2mM MgCl2；0.2mM各種dNTP；5mMDTT；1％DMSO；1.25單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(AppliedBiosystems，Inc.)；270nM tel1引物；和900nM tel2引物。熱循環擴增以95℃溫育10min開始來激活AmpliTaq Gold DNA聚合酶，接著以95℃×15s和54℃×2min進行18個循環。
可選擇地，端粒特異性引物序列被優化以具有相似Tms，特別通過設計引物來具有相似或相同的GC含量。引物組tel1b(5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3′)(SEQID NO8)和tel2b(5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′)(SEQ ID NO9)的每一個引物在從3’末端的第6個堿基和其后朝向5’端方向的每第6個堿基攜帶特意導入的單個堿基取代，在重復序列的每第6個位置上總共有5個導入的堿基變化。當引物雜交到靶端粒DNA上時，產生5個單一的堿基錯配，但是該雜合體在每條引物的3’末端的最后5個堿基與靶端粒DNA序列具有最佳互補性。引物相互雜交導致6個位置中的4個上發生堿基配對，每條引物的3’末端殘基與另一條引物形成錯配。具有這些Tm最優化的引物的PCR條件是在每個反應的30ul的最終體積中含有0.4x Sybr綠I，15mM Tris-HCI，pH8.0；50mM KCl；1.5mM MgCl2，1％DMSO，2.5mM DTT，200uM各種dNTP，0.75單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶，450nM tel1b引物，和450nM tel2b引物。熱循環擴增為95℃×10min，接著以95℃15sec(變性)和56℃2min(退火/延伸)進行18個循環。該分析條件不需要ROX染料。總之，三個PCR反應用各種試驗進行。每個96孔端粒PCR平板含有具有2NTC孔的(無基因組DNA)排，和10個含有系列稀釋為5個濃度的參比DNA標準曲線的孔，每種濃度是雙份的，范圍在0.25ng/ml(最終濃度)到2ng/ml(最終濃度)。
編碼酸性核糖體磷蛋白PO的36B4基因被用于標準化端粒信號(Boulay等，生物技術(Biotechniques)27228-232(1999))。所用的引物是36B4u(5′-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3′)和36B4d(5′-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′)。PCR條件為在每個反應的50ul最終體積中含有150nM 6-ROX和0.2x SYBRTM綠I(Molecular Probes，Inc.)；15mM Tris-HCl，pH8.0；50mM KCl；2mM MgCl2；200uM各種dNTP；5mM DTT；1％DMSO；1.25單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，Inc.)；300nM 36B4u引物；和500nM 36B4u引物。熱循環模式為95℃下溫育10min，接著以95℃×15s(變性)和56℃×1min(變性/延伸)進行30個循環。在第二組條件下不需要ROX染料。
與擴增端粒重復相似，對每個試驗DNA樣本進行三個36B4 PCR反應。每一個96孔端粒PCR平板含有具有2NTC孔的排(無基因組DNA)和10個含有系列稀釋為5個濃度的參比DNA標準曲線的孔，每種濃度是雙份的，范圍在0.25ng/ml(最終濃度)到2ng/ml(最終濃度)。
所有的PCRs在ABI Prism7700序列檢測系統(Applied Biosystems，Inc。，福斯特城，CA，美國)中進行，裝備了熱循環儀來在每個PCR循環中激發和讀取熒光分子的發射。然后用ABI的SDS版本1.7軟件來獲得每個平板的標準曲線和確定對應于各種樣本的T和S含量的標準物的稀釋因子。
存在35ng人DNA時，端粒PCR產物可以通過以約9個PCR循環的實時定量PCR檢測。在25個循環后通過在瓊脂上電泳和用溴乙啶染色的分析顯示起始于76個堿基對的產物到約400堿基對的產物的條帶(附圖4)，76個堿基對等價于端粒特異性引物的長度的總和。PCR拷貝數與第一個PCR循環的引物可以結合的位點數成比例。去除基因組DNA導致在端粒或單拷貝基因引物的25個循環后沒有可檢測的擴增產物。
實施例2確定相對端粒長度平均端粒限制性片段(TRF)長度按照Slagboom等，美國人基因組雜志(Am.J.Hum.Genet.)55876-882(1994)的描述確定，在此引入作為參考。
大約0.5ug純化的全血DNA用Hae III限制性酶消化。然后被消化的樣本與DNA大小標準物混合，在瓊脂凝膠上電泳分離，轉移到尼龍膜上。該膜用32P末端標記的寡核苷酸(TTAGGG)7雜交，洗滌以去除非特異性結合的探針，暴露于磷光平板(phosphor plate)1-5天，用磷光圖像儀(MolecularDynamics，Inc.)掃描該平板。然后去除斑點上的端粒探針，與放射性探針雜交來確定DNA大小標準，洗滌，暴露于磷光平板，掃描該平板。然后大小標準圖像和端粒條帶圖像被疊加來定位端粒條帶的大小間隔的位置。然后以平均TRF長度＝(∑ODi)/(∑ODi/Li)計算平均TRF長度，其中ODi是在間隔i中相對于背景的總放射值，Li是i的平均堿基對長度。整個操作進行兩次；即從兩個獨立試驗中得到對各個個體測定的兩個平均TRF長度值。
為了測定T/S值(端粒與單拷貝基因的比)，測定用端粒特異性(T)引物和單拷貝基因(S)特異性引物擴增的樣本的Ct值-擴增樣本所積累熒光超過設定的閾值的部分循環數，該閾值比背景熒光的大數倍標準偏差。由于在每個PCR循環中，PCR產物含量基本上加倍，T/S比接近[2Ct(端粒)/2Ct(單拷貝基因)]-1＝2-ΔCt。平均ΔCt為-9.05(見附圖2)。也就是說，單拷貝基因的PCR需要比端粒PCR多約9個以上循環來產生相同的熒光信號，該信號通過實時PCR測定。標準偏差1.48％。
相對T/S比是一個樣本的T/S相對于另一個樣本的T/S，表示為2-(ΔCt1-ΔCt2)＝2-ΔΔCt。該公式可以計算每種樣本的相對T/S比。21名毫不相干的患者的DNA樣本通過實時定量PCR擴增和量化(見實施例2)。從PCR計算的相對T/S比的比較與通過Southern雜交測定的平均TRF長度十分相關(見附圖3)。Y軸截取值(intercept)約3.6kbp，近似于限制性酶識別位點與端粒六聯體重復的起始之間的近端區的平均長度(Hultdin，M.，核酸研究(Nucleic Acids.Res.)263651-3656(1998))。而且在毫不相干的相應年齡和性別的成人中，通過相對T/S比測定的全血中的試驗端粒長度在2.5的范圍內變化。如果從每個報道的平均TRF長度(Hultdin，M.核酸研究(Nucleic AcidsRes.) 3651-3656(1998)；Vaziri，H.等，美國人基因組雜志(Am.J.Hum.Genet.)52661-667(1993))中減去3.4kbp的平均近端粒(subtelomeric)長度，這種可變性的范圍與其它關于在相應年齡的成人中的TRF長度的變化幅度的研究十分吻合。
權利要求
1.一種擴增靶核酸的方法，包括a)將包含基本上互補的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈上，其中當被雜交到各自的鏈時所述被雜交的引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個核苷酸殘基被改變以在第一引物和第二引物相互雜交時在所述被改變的殘基與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配；和b)通過聚合酶鏈式反應擴增靶核酸。
2.按照權利要求1的方法，其中所述第二引物的至少一個核苷酸殘基被改變以在第一引物和第二引物相互雜交時在所述第二引物上的所述被改變的殘基與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
3.一種擴增靶核酸的重復區域中重復單位的方法，包括a)將包含基本上互補的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的至少一個重復單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的至少一個重復單位上，其中當被雜交到各自的鏈時所述被雜交的引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配；和b)通過聚合酶鏈式反應擴增靶核酸。
4.按照權利要求3的方法，其中所述第二引物的至少一個核苷酸殘基被改變以在所述第二引物上的所述被改變殘基與所述第二條鏈的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
5.一種擴增靶核酸的重復區域中重復單位的方法，包括a)將包含基本上互補的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的一個以上重復單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的一個以上重復單位上，其中當被雜交到各自的鏈時所述被雜交的引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的每個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配；和b)通過聚合酶鏈式反應擴增靶核酸。
6.按照權利要求5的方法，其中所述第二引物的核苷酸殘基被改變以在所述第二引物的所述被改變殘基與所述第二條鏈的每個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
7.按照權利要求3、4、5或6的方法，其中所述第一引物和第二引物還包含不與所述重復單位雜交的5’末端序列。
8.按照權利要求6的方法，其中所述錯配位于所述重復單位的鄰近核苷酸位置上。
9.按照權利要求6的方法，其中所述錯配位于所述重復單位的非鄰近核苷酸位置上。
10.按照權利要求3、4、5或6的方法，其中所述重復單位包含六核苷酸重復。
11.按照權利要求3、4、5或6的方法，其中所述重復單位包含五核苷酸重復。
12.按照權利要求3、4、5或6的方法，其中所述重復單位包含四核苷酸重復。
13.按照權利要求4或6的方法，其中所述重復單位包含端粒重復單位。
14.按照權利要求13的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID NO1和所述第二引物包含SEQ ID NO2。
15.按照權利要求13的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID NO8和所述第二引物包含SEQ ID NO9。
16.一種按照權利要求3、4、5或6確定靶核酸的重復區域中重復單位的數量的方法，還包含測定擴增產物的量(T)。
17.按照權利要求16的方法，其中所述測定是通過實時定量PCR進行。
18.按照權利要求16的方法，還包含a)擴增已知拷貝數的靶核酸(S)；和b)確定T/S比來確定重復單位拷貝數。
19.一種按照權利要求18用于診斷癌癥的方法。
20.一種按照權利要求18用于診斷細胞老化的方法。
21.一種用于擴增靶核酸的組合物，所述靶核酸包含基本上互補的第一條和第二條靶鏈，所述組合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈和所述第二引物雜交到第二條鏈，其中當被雜交到它們各自的鏈時所述引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個核苷酸殘基改變以在第一引物和第二引物相互雜交時在所述被改變的殘基與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
22.按照權利要求21的組合物，其中所述第二引物的至少一個核苷酸殘基被改變以在第一引物和第二引物相互雜交時在所述第二引物上的所述被改變的殘基與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
23.一種用于擴增靶核酸的重復區域中的重復單位的組合物，所述靶核酸包含基本上互補的第一條和第二條靶鏈，所述組合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的至少一個重復單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的至少一個重復單位上，其中當被雜交到它們各自的鏈時所述引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
24.一種按照權利要求23的用于擴增重復區域中重復單位的組合物，其中所述第二引物的至少一個核苷酸殘基被改變以在所述第二引物上的所述被改變殘基與所述第二條鏈的至少一個重復單位的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
25.一種用于擴增靶核酸的重復區域中的重復單位的組合物，所述靶核酸包含基本上互補的第一條和第二條靶鏈，所述組合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的重復單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的重復單位上，其中當被雜交到它們各自的鏈時所述引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的各個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產生錯配。
26.一種按照權利要求25的用于擴增重復區域中重復單位的組合物，其中第二引物的核苷酸殘基被改變以在所述第二引物上的所述被改變殘基與所述第二條鏈的各個重復單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產生錯配，其中當第一引物和第二引物相互雜交時所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基產生錯配。
27.按照權利要求21、22、23、24、25或26的組合物，其中所述第一和第二引物還包含不與所述重復單位雜交的5’末端序列。
28.一種按照權利要求24或26的用于擴增重復區域中的重復單位的組合物，其中所述重復單位包含端粒重復單位。
29.一種按照權利要求28的用于擴增所述端粒重復單位的組合物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO1和所述第二引物包含SEQ ID NO2。
30.一種按照權利要求28的用于擴增所述端粒重復單位的組合物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO8和所述第二引物包含SEQ ID NO9。
全文摘要
本發明提供采用被設計來限制非靶核酸被動引發事件的核酸引物來擴增靶核酸的組合物和方法。本發明可以擴增和量化重復區域中的重復單位的數量，如端粒重復單位的數量。
文檔編號C12N15/09GK1639352SQ03804867
公開日2005年7月13日 申請日期2003年1月31日 優先權日2002年1月31日
發明者理查德·考索恩 申請人:猶他州大學