一種天牛科幼蟲不同家系的分子標記方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子標記技術護領域，尤其涉及一種天牛科幼蟲不同家系的分子標記 方法。
【背景技術】
[0002] 天牛幼蟲的分類研究主要集中在個體形態學領域，但由于幼蟲分離鑒定資料極其 缺乏，許多種類的幼蟲形態迄今尚未描述；不同地理分布的同種天牛幼蟲，形態有一定差 異；親緣關系較近的種類，形態非常相似，鑒定時容易混淆。因此，隨著分子生物學的發展， 核酸序列分析（DNA sequenceanalysis)被越來越多地用于天牛幼蟲的分子鑒定，在出入境 檢驗檢疫工作中具有重要意義。
[0003] 線粒體DNA (mtDNA)分子量較小，遵循母系遺傳，進化速率快，是分子分類學重要 的標記之一。其細胞色素氧化酶I、II (C0I、C0 II )在近緣種及種下階元的分類鑒定以及 不同地理種群的遺傳變異中應用較廣。
[0004] 隨著分子生物學技術的飛速發展，分子標記技術被廣泛應用于昆蟲種群間的親 緣關系分析。C0I基因在昆蟲近緣種及種下階元的分類系統研究中應用較廣。安榆林等 (2004)用mtDNA序列分析了光肩星天牛mtDNA的特點，得出mtDNA可用于天牛不同地理種 群及近緣種的的鑒定和系統遺傳分析。張凱（2013)將Z i/?cWiiM?Pascoe的mtDNACOI序 列與來自幽天牛亞科、天牛亞科、溝腔天牛亞科的不同種天牛的mtDNACOI序列構建NJ系統 樹，發現在進化關系上與天牛亞科最近。
[0005] DNA條形碼技術通常是利用線粒體C0I5'端序列將物種鑒定到種水平的一種鑒 定方法（Hebert等，2003)。Hebert等（2003)對包括脊椎動物和無脊椎動物動物界的 C0I基因序列比較分析得出：除腔腸動物外，98%同屬物種的C0I種間遺傳距離差異平均為 11. 3%，不同屬物種的C0I遺傳距離差異更大。

【發明內容】

[0006] 發明目的：為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種天牛科幼蟲不 同家系的分子標記方法。本發明通過對口岸經常截獲的天牛科C0I基因進行擴增，同網上 登錄序列進行比較，分析其基因組成及變異，并構建系統發育樹，研究其分類地位。以期在 實際工作中輔助天牛科幼蟲分類鑒定，為形態學分類做補充，為進一步的研究奠定基礎。
[0007] 技術方案：為了解決上述目的，本發明所采用的技術方案為：一種天牛科幼蟲不 同家系的分子標記方法，采用以下步驟實現： 1)選用兩對特異性引物進行PCR反應，所述兩對特異性引物為 上游引物 J173 :5' - TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' 下游引物 J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' ； 上游引物 J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' 下游引物 N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3' ； 2) 從待測不同家系的天牛個體及親本，采用DNA提取法提取基因組DNA ; 3) 用步驟2)的基因組DNA為模板，步驟1)所選的兩對引物分別進行兩輪PCR擴增； 4) 對步驟3)的PCR產物用1.5 %瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色后紫外線下觀察并拍 照電泳結果，剩余部分送上海金斯瑞有限公司純化并測序； 5) 獲得的DNA序列先提交到GenBank數據庫中，然后利用BLAST工具進行相似性檢 索，并確定片段方向；用GenDoc軟件進行序列同源性比較；用MEGA5. 0軟件，計算各物種間 的遺傳距離，轉換和顛換值及其比值，保守位點及變異位點等數值，用鄰接法構建系統發育 樹，根據個體間的遺傳距離聚類結果，區分來自不同家系的個體。
[0008] 在步驟3)中，在進行PCR擴增時，PCR反應體系采用50 μ 1標準反應體系，其中含 有 10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ 1，2. 5 mmol/L 的 dNTPs 4 μ 1，ragDNA 聚合酶 0· 4 μ 1， cDNA模板2μ 1，上下游引物各1 μ 1，后加 ddH20補足5〇μ1。
[0009] 在步驟3)中，第一輪PCR反應的條件為：94 °C預變性3min ;94 °C變性30s，55°C 退火30s，72°C延伸lmin，循環35次，循環結束后再72 °C延伸10 min。
[0010] 在步驟3)中，第二輪PCR反應的條件為：94 °C預變性3min ;94 °C變性30s，47°C 退火30s，72°C延伸45s，循環35次，循環結束后再72 °C延伸10 min。
[0011] 有益效果：與現有技術相比，本發明的優點是：本發明對33種天牛C0I基因的遺 傳距離表明：該片段C0I基因在斷眼天牛屬3種天牛種間的遺傳距離介于0. 052~0. 087 間；其余天牛種間的遺傳距離介于〇. 〇75~0. 292間，不同屬間遺傳距離明顯大于同屬間遺 傳距離，C0I基因完全符合DNA條形碼有效性的檢驗標準，該片段可以較好的區分天牛的 不同屬的不同種類，可用于天牛科的快速鑒定。
【附圖說明】
[0012] 圖1PCR方法特異性實驗的電泳圖；俄羅斯天牛幼蟲擴增出了一條481bp的片段， 參見泳道1和泳道2,其他天牛均未擴增出片段，參見泳道； 圖2a和圖2b天牛C0I基因的遺傳距尚； 圖3天牛C0I序列構建NJ系統進化樹。
【具體實施方式】
[0013] 下面結合實驗例詳細闡述本發明。
[0014] 實施例1 : 1、試驗材料： 所用天牛標本均為江蘇出入境檢驗檢疫局各口岸昆蟲實驗室多年截獲的標本。5種標 本來源和采集時間見表1。此外，選取Genbank登錄的28種天牛C0I基因序列進行比對，見 表2。
[0015] 表1實驗標本名稱和來源 表2Genbank下載序列信息 2、基因組總DNA的提取 采用GenMag動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒：將酒精浸泡過的蟲體，選擇適當 大小的肌肉組織，無菌水清洗2-3次，浙干水分后，將組織進行研磨，加入適量的裂解液和 蛋白酶K，55 °C溫浴，使得組織完全裂解。再加入磁珠和緩沖液，使DNA吸附到磁珠上，使用 Wash Buffer進行除雜，除雜完畢后，加入少量的Elution Buffer，將DNA溶解，得到基因組 DNA溶液，-20°C保存。
[0016] 3、C0I基因擴增及測序 PCR擴增采用巢式PCR，所用引物分別為： 第一輪：J173 :5, - TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' 第二輪：J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3'，均由上海金斯瑞有限公司合成。
[0017] PCR反應體系采用50μ 1標準反應體系，其中含有10XPCR Buffer (Mg2+)5 μ 1， dNTPs(2.5mmol/L)4 ylJai/DNA