基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，屬于化學及生物醫學領域。
【背景技術】
[0002]病毒熒光標記對于病毒侵染過程和機制研宄至關重要。理想的病毒標記要在確保病毒活性的前提下實現病毒單顆粒可視化，目前采用的方法主要集中于利用熒光蛋白進行標記或直接使用染料分子進行標記。然而這兩類方法都有明顯不足，比如，有的有機染料標記方法需要對病毒進行修飾和分離純化，會降低病毒活性，并且對病毒內部結構的標記效果差，而那些直接將有機染料嵌入病毒結構中的方法由于染料分子容易脫落而信號不穩定；熒光蛋白的構建步驟比較繁瑣，且熒光蛋白的大量表達會影響病毒的結構和功能，病毒的目標蛋白與熒光蛋白融合后其表達水平可能下降并影響其他組分的結構，而且不是每種病毒都可以通過熒光蛋白進行標記。
[0003]利用溫和高效的生物正交反應和病毒自然的生命活動過程進行活病毒高效穩定的標記是當前的新思路和新策略。B1-Hai Huang等(ACS Chem.B1l.2012)報道了一種利用磷脂的代謝交換嵌入過程進行病毒包膜的生物素化，之后利用鏈霉親和素修飾的量子點，通過生物素-親和素共價體系實現了病毒包膜的熒光標記，該方法簡單快速，然而只適用于病毒包膜的單熒光標記。我們課題組在分別建立基于無銅催化點擊化學反應的病毒包膜標記方法(Anal.Chem.2012)和基于核酸分子光開關釕多吡啶配合物的病毒核酸標記方法(Chem.Commun.2012)的基礎上，結合細胞內膽堿磷脂的合成和代謝交換嵌入過程實現了病毒包膜的疊氮基衍生，并在宿主細胞內，在病毒自然的復制組裝過程中實現了病毒核酸和包膜的雙重標記(Anal.Chem.2013)，避免了繁瑣和破壞性很強的病毒額外修飾和精細的分離純化操作，可在最大程度上保持病毒的活性。然而上述方法也都存在一定局限性:釕多吡啶配合物只適用于雙鏈DNA病毒的核酸標記，膽堿磷脂類似物只適用于包膜病毒的標記。所以拓展這種順應自然的病毒標記新思路和新策略，探索更可靠、簡便、普適性的病毒標記方法仍是一個待解決的重要生物醫學課題。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是為了解決現有病毒標記方法不但操作繁瑣，還無法保證病毒的感染力和病毒活性，普適性不夠強等問題，提供一種基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，該方法更加簡便、可靠，普適性更強。
[0005]本發明的目的是通過下述技術方案實現的。
[0006]基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，具體步驟如下:
[0007]步驟一、合成甲硫氨酸類似物---疊氮甲硫氨酸(azidohomoalanine，AHA)及脫氧胸苷類似物---乙稀脫氧尿苷(5_Vinyl_2’-deoxyuridine，VdU)；
[0008]步驟二、將病毒加入含有宿主細胞的培養液中進行侵染，待病毒完全侵染宿主細胞，即宿主細胞發生病變的時候，加入疊氮甲硫氨酸與乙烯脫氧尿苷，得到細胞A;利用核酸和蛋白質的生物合成過程實現了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的疊氮基衍生。
[0009]步驟三、向步驟二所得的細胞A中加入熒光探針一四嗪化的Cy5 (Tetrazine-Cy5)，通過四嘆-稀徑之間的Diels-Alder反應得到核酸被焚光標記的子代病毒B ;向所得的子代病毒B中加入熒光探針環辛炔化的Flour 525 (DBCO-Flour525);通過疊氮-環辛炔之間的無銅催化點擊化學反應得到包膜蛋白被熒光標記的子代病毒，即實現了病毒的核酸和蛋白的雙重熒光標記。
[0010]有益效果
[0011]1、本發明的基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，針對現有技術不但操作繁瑣，還無法保證病毒的感染力和病毒活性的問題，合成疊氮甲硫氨酸及乙烯脫氧尿苷，這兩種物質與甲硫氨酸及脫氧胸苷結構極其相似，可直接通過生物自身的合成嵌入病毒的蛋白質及核酸中。操作簡便，快速，特異性好，且對病毒的活性影響小。
[0012]2、本發明的基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，可以應用于所有DNA病毒，包括單鏈DNA病毒和雙鏈DNA病毒，以及包膜病毒和非包膜病毒，是一種絕對意義上的普適性病毒熒光標記方法。
[0013]3、本發明的基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，可推廣應用于其他的生物熒光標記，包括細胞類、菌類、病毒類等所有含DNA和蛋白質的生物熒光標記。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明的基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法的流程示意圖；
[0015]圖2為本發明合成的疊氮甲硫氨酸的氫譜圖；
[0016]圖3為本發明合成的疊氮甲硫氨酸的碳譜圖；
[0017]圖4為本發明合成的乙烯脫氧尿苷的氫譜圖；
[0018]圖5為本發明合成的乙烯脫氧尿苷的質譜圖；
[0019]圖6為本發明通過熒光探針Tetrazine-Cy5以及DBCO-Flour 525分別檢測子代病毒核酸衍生的乙烯基和蛋白衍生的疊氮基的熒光成像；
[0020]圖7為本發明通過四嗪-烯烴之間的Diels-Alder反應以及疊氮-環辛炔之間的無銅催化點擊化學反應，自然地實現了病毒的一步核膜雙重熒光標記的熒光成像；
[0021]圖8為本發明核膜雙重熒光標記的病毒侵染宿主細胞的免疫熒光成像；
[0022]圖9為本發明核膜雙重焚光標記的病毒與未修飾的病毒侵染宿主細胞不同時間點，檢測病毒感染力的熒光成像。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例與附圖對本發明進行進一步說明。
[0024]實施例1
[0025]基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，具體步驟如下，如圖1所示:
[0026]步驟一、合成甲硫氨酸類似物---疊氮甲硫氨酸(azidohomoalanine，AHA)及脫氧胸苷類似物---乙稀脫氧尿苷(5_Vinyl_2’-deoxyuridine，VdU)；
[0027]合成疊氮甲硫氨酸的方法為:逐滴向含他乂的水溶液中加入蒸餾后的三氟甲磺酸酐，室溫攪拌反應2h;產物用二氯甲烷萃取兩次；同時，將水與甲醇加入裝有轉子的圓底燒瓶，之后加入Boc-Dab (叔丁氧羰基-L-2，4- 二氨基丁酸)，此03和催化劑CuSO4.5Η20 ;將萃取得到的疊氮化的三氟甲磺酸酐，逐滴加入上述反應液中，室溫攪拌過夜；將反應物40°C旋蒸，去除甲醇和二氯甲烷；加入鹽酸，調PH為3，并用乙酸乙酯萃取2次；產物用飽和NaCl溶液洗滌，并加入干燥劑除水，之后用濾紙過濾。將產物40°C旋蒸，去除乙酸乙酯；加入濃HCl,以脫去Boc保護基；用水稀釋溶液，并用陽離子交換樹脂純化產物；產物4°C冰箱放置過夜，抽濾收集疊氮甲硫氨酸結晶。如圖2，3所示。通過上述反應步驟成功合成疊氮甲硫氨酸。
[0028]表征:圖2，氫譜 -1H NMR(400MHz, D20) δ 2.167-2，239 (m, 2H), 3.669 (m, 2H), 3.920(t, J = 6.3Hz, 1H) p.p.m ；
[0029]圖3，碳 if:13C NMR(100MHz, D2O) δ 29.075 (CH2), 46.959 (CH2), 52.331 (CH), 173.662o
[0030]合成乙烯脫氧尿苷的方法為:碘代脫氧尿苷，二(三苯基膦)-鈀(II)-二氯)，用氬氣脫氣30min ;加入三正丁基錫及四氫呋喃超干溶劑，氬氣脫氣30min ;磁力攪拌，30°C反應48h。之后用硅藻土過濾，甲醇洗滌；產物通過真空旋蒸去除甲醇；通過硅膠柱層析(二氯甲烷:乙腈:甲醇=70:25:5)分離獲得黃色油狀物。產物再溶于甲醇，加入Sn/Pd金屬清除劑室溫處理4h;濾掉沉淀，重復上述清除步驟。之后進行第二次硅膠柱層次分離(乙酸乙酯:甲醇:氨水=97:2.7:0.3)得到的產物為白色固體。如圖4，5所示。通過上述反應步驟成功合成乙烯脫氧尿苷。
[0031]表征:圖4，氫譜:匪R[(CD3/2S0] δ 11.423(1H, bs, N-H), 8.124(1H, S，H-6)，6.352 (1H, dd, vinylic H_l")，6.158 (1H, t, H_l’)，5.940 (1H, dd, vinylicH-2")，5.259-5.13 (3H, m, vinylic H_2", 0H-3’ and 0H-5’)，4.255 (1H, m, H_3’)，3.787 (1H,m, H-4’)，3.619-3.587 (2H, m, H_5’)，2.138-2.129 (2H, t, H_2’)；
[0032]圖5，質譜:乙烯脫氧尿苷的分子量為:254 ;[M+H]+:255 ;[M+Na] +:277
[0033]本次試驗的結果:本發明的基于核酸和蛋白質生物合成的病毒雙熒光標記新方法，通過化學方法成功合成了甲硫氨酸類似物一疊氮甲硫氨酸及脫氧胸苷類似物一乙烯脫氧尿苷，具體表征結果如圖2-5所示。
[0034]步驟二、將病毒加入含有宿主細胞的培養液中進行侵染，待病毒完全侵染宿主細胞，即宿主細胞發生病變的時候，加入疊氮甲硫氨酸與乙烯脫氧尿苷，得到細胞A ;利用核酸和蛋白質的生物合成過程實現了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的疊氮基衍生。
[0035]衍生后的病毒純化的具體操作步驟:將病毒侵染的宿主細胞置于_80°C冰箱內在室溫/_80°C冰箱反復凍融3-4次；將病毒液收集于無菌離心管中，40C，4500rpm離心30min去細胞碎片，離心結束后棄沉淀留上清；將上清加入到含36%蔗糖溶液的type70離心管中，4°C，80000g，離心2h，離心結束后棄上清，用0.0lM