專利名稱：：擴增特異核酸序列的方法
技術領域：
：本發明涉及體外擴增特異性核酸靶序列的方法。特別是本發明涉及用耐熱性限制性核酸內切酶介導選擇性擴增核酸靶序列的方法，該靶序列含有序列差異，包括點突變、缺失和插入。
背景技術：
：多種遺傳疾病和后天疾病與遺傳變異如點突變、缺失和插入有關。這些變異中有些與疾病出現直接相關，而其它則與疾病風險和/或預后相關。由于單基因突變而導致有500種人類遺傳疾病，這些包括囊性纖維化、肌肉營養不良、α1-抗胰蛋白酶缺陷、苯酮尿癥、鐮形細胞貧血或性狀，和各種其它的血紅蛋白病。此外，對幾種常見的多基因狀態如動脈粥樣硬化心臟病具有增加的易感性的個體，已顯示出與特定DNA序列多態性的遺傳有關。癌癥認為是由于涉及細胞增殖或分化基因的損傷積累所致。ras原癌基因K-ras、N-ras和H-ras及p53腫瘤抑制基因是在人類癌癥中頻繁突變的基因實例，這些基因中特異的突變導致激活或增加的轉化能力。遺傳分析很可能成為臨床上常規的分析，用于評定疾病風險，疾病診斷，預測病人的預后或對治療的反應，并且用于監測病情發展。這種遺傳測試的導入依賴于開發簡單、廉價且快速的遺傳變異分析方法。在很少的情況，如果突變恰巧位于天然限制性核酸內切酶識別/切割位點內時突變可以檢測。WO84/01389描述了一種通過篩選限制性核酸內切酶位點的存在與否而區分野生型基因和非野生型突變子的方法。發明人通過分析人類H-ras原癌基因密碼子12位置的變異體序列舉例說明了該原理。野生型序列密碼子12形成了限制性核酸內切酶NaeI和HpaII識別/切割位點的一部分。用這些核酸內切酶消化可區分野生型原癌基因和在該密碼子處具有突變的激活的癌基因。H-ras密碼子12的點突變頻繁發現于膀胱癌且此策略可形成醫療診斷篩選試劑盒的基礎。核酸體外擴增方法已廣泛應用于遺傳學和疾病診斷。聚合酶鏈反應(PCR)是強有力的體外擴增特異核酸片段的靈敏方法(R.K.Saiki等，1985，科學230，1350-1354和F.F.Cheheb等，1987，自然329，293-294和US4683202，US4683195，US4800159，US4965188和US5176995)。PCR由寡核苷酸引物介導，引物位于待合成靶序列的側翼，并且互補于位于模板DNA相反鏈的序列。這些步驟在反應中由于溫度循環(熱循環)而發生。模板DNA首先經加熱變性，然后將反應冷卻從而讓引物與靶序列退火，引物然后由DNA聚合酶延伸。變性、退火和DNA合成的循環重復多次且每輪擴增的產物用作下一輪的模板。此過程導致擴增子的指數擴增，其在5’未端摻入寡核苷酸引物且含有位于引物之間的新合成的序列拷貝。PCR應用極其廣泛并已開發出許多這種基本方法的改良形式。用于PCR的引物可與靶序列完全配對或者它們可含有錯配或修飾的堿基。引物5’端的額外序列可利于獲取PCR擴增子并且包括標記的引物可利于檢測。在引物中包括進錯配的堿基可導致產生新的限制性核酸內切酶識別/切割位點，這些位點可完全位于引物序列內，或者，它們可跨越部分位于引物內和部分位于新合成的靶序列內的序列(J.B.和A.D.Levinson(1988)，自然334，119-124)。設計含有近3’端錯配堿基引物的一般規則已經建立(S.Kwok等(1990)，核酸研究18，999-10005)。含有錯配堿基的修飾引物用于向在密碼子12突變的H-ras擴增子(R.Kumar和M.Barbacid(1988)，癌基因3，647-651)中導入新的限制性核酸內切酶的識別/切割位點。同樣地，含有錯配堿基的引物用于稱作等位基因特異性富集(ToddAV等白血病，1991，5160)或富集PCR(LeviS等，癌癥研究，1991，61079)的方法中，這些是檢測點突變很敏感的方法。在這些方法中，如果序列在密碼子12是野生型的，DNA樣品以在N-ras擴增子中導入EcoNI位點，或在K-ras擴增子中導入BstNI位點的引物進行擴增。PCR反應液的等份試樣以適當的限制性核酸內切酶消化從而在第二輪PCR循環中重新擴增抗消化的擴增子之前切割野生型擴增子。這些方法導致優先擴增在ras中的密碼子12帶有點突變的序列。最近，公開了一種允許反應在單個管中進行的簡化富集PCR方法(Singh等，國際癌癥學雜志，1994；51009)，該方法也需要一輪最初的PCR擴增，然而，限制性核酸內切酶然后直接加入到反應管中。與限制性核酸酶溫育以后，第二輪PCR循環導致擴增在限制性核酸內切酶識別/切割位點內帶有突變的序列。這種分析PCR擴增子中天然或誘導的限制核酸內切酶位點需要隨后的用于PCR的DNA聚合酶活性，接著是用于切割分析的限制性核酸內切酶的活性。富集PCR方法首先需要用于PCR的DNA聚合酶活性，然后是限制性核酸內切酶活性以切割特異的序列，接著進一步是DNA聚合酶活性以重新擴增抗消化的擴增子。在PCR過程中同時利用限制性核酶內切酶和DNA聚合酶的活性的能力可能會提供幾方面的優勢，它可允許形成用于在PCR起始時在含有所有試劑，包括酶的反應中單獨或優先擴增變異體序列的簡單方法。以前不知道是否在PCR中包括進限制性核酸內切酶會導致(i)對含有限制性核酸內切酶識別/切割位點的序列擴增的完全(或部分)抑制和(ii)單獨(或優先)擴增缺乏限制制性核酸內切酶識別/切割位點的序列的變異體。完全抑制序列擴增和/或單獨擴增變異體序列的能力會導致形成無需在分析之前進一步操作的方法。所需選擇性擴增和/或隨后分析擴增子的步驟數減少會導致形成更快、較小勞動強度和/或更易于自動化的方法。進一步的優勢在于反應將在密閉系統中完成且這將會減少PCR過程中污染的機會。這種方法將會同時需要在與PCR相容的條件下的限制性核酸內切酶和DNA聚合酶的活性。此限制性核酸內切酶和DNA聚合酶必需i)在必需與PCR相容的相同反應條件中(例如，鹽，PH)發揮功能和ii)必需在這些反應條件中足夠地熱穩定以在PCR需要的循環過程中維持活性。適于與PCR聯合的限制性核酸內切酶必需在PCR過程中與引物退火的嚴格條件相容的溫度，典型地為50℃-65℃時具有活性。耐熱DNA聚合酶和限制性核酸內切酶的同時活性以前已被開發用于介導稱為鏈替代擴增的等溫反應中的體外擴增(EPO384315AI)。以前不知是否限制性核酸內切酶在PCR所需的熱循環過程中能具有足夠的熱穩定性以維持活性。發明概述在第一方面，本發明包括一種檢測個體中遺傳多態性的方法，該方法包括以下步聚(1)獲取含有個體中核酸的樣品；(2)通過包括熱循環和引物的方法擴增步驟(1)的核酸樣品，擴增是在熱循環過程中維持活性的耐熱限制性核酶內切酶存在下進行，挑選引物以使它們能在擴增自不包括多態性的核酸或擴增自包括多態性的核酸的核酸中導入由耐熱的限制性核酸內切酶所識別的序列；和(3)分析步驟(2)的產物以檢測多態性的存在與否。在本發明該方面的一個實施方案中引物將由耐熱限制性核酸內切酶識別的序列導入擴增自不包括多態性的核酸的核酸中。在第二個方面，本發明包括一種檢測個體中遺傳多態性的方法，該方法包括下面的步驟(1)獲取含有個體核酸的樣品；(2)通過包括熱循環和引物的方法擴增步驟(1)的核酸樣品，擴增是在同時具有活性的耐熱限制性核酸內切酶存在下進行，限制性核酸內切酶的選擇是使它識別不包括多態性的核酸而不識別包括多態性的核酸或者使它們識別包括多態性的核酸而不識別不包括多態性的核酸；和(3)分析步驟(2)的產物以檢測多態性的存在與否。在本發明該方面的一個實施方案中耐熱限制性核酸內切酶識別不包括多態性的核酸。在本發明優選的一個實施方案中該方法進一步包括下面的額外步驟(4)將步驟(2)中擴增的核酸與至少一種限制性核酸內切酶反應，該至少一種限制性核酸內切酶的選擇是使其消化包括特定多態性的擴增核酸；和(5)檢測步驟(4)消化是否發生，消化是特定多態性存在的標志。有許多包括熱循環的用于擴增核酸的技術，這些技術包括聚合酶鏈式反應(PCR)，連接酶鏈式反應，基于轉錄的擴增和限制性擴增。然而，現在優選包括熱循環的方法為PCR。在另一優選的實施方案中步驟(3)的分析包括檢測步驟(2)擴增的核酸存在與否，擴增的核酸存在與否表示多態性的存在與否。同時本發明的方法可用于各種類型的核酸，典型地核酸為DNA。在本發明另一個優選的實施方案中耐熱限制性核酸內切酶選自BstNI、BslI、Tru9I和Tsp509I。本發明方法可用于檢測一定范圍的遺傳多態性，包括出現于以下其中之一的多態性ras原癌基因如K-ras、N-ras和H-ras，或p53腫瘤抑制基因，或HIV-I，囊性纖維化轉膜傳導調節子，α-抗胰蛋白酶或β-珠蛋白。本發明方法在檢測K-ras密碼子12位置的多態性中特別有用。本發明方法可用于分析一定范圍的遺傳多態性，包括點突變、小的缺失和插入。已發現耐熱限制性核酸內切酶可足夠耐熱以在熱循環過程中維持活性，也發現PCR可用各種聚合酶在維持限制性核酸內切酶活性和耐熱性的相同緩沖液條件下進行。已發現在PCR過程中包括進耐熱性限制性核酸內切酶可導致(i)抑制含有限制性核酸內切酶識別/切割位點序列的擴增和(ii)僅擴增缺失限制性核酸內切酶識別/切割位點序列的變異體。這些發現允許形成限制性核酸內切酶介導的選擇性PCR(REMS-PCR)的方法。REMS-PCR較其它PCR方法更為簡單，其利用限制性核酸內切酶分析序列變異。所有的反應成分在PCR起始時便存在并在分析之前無須隨后的操作，因此反應可在密閉的容器或小室中完成。也已發現在PCR過程中包括進耐熱限制性核酸內切酶可導致(i)含有限制性核酸內切酶識別、切割位點的核酸擴增的部分抑制和(ii)優先擴增缺失限制性核酸內切酶識別/切割位點列的變異體。本發明的詳細描述正如本文所用的，下面的術語和短語定義如下PCR是一種需要2個位于待合成靶序列兩側的引物的體外DNA擴增方法。引物是一段寡核苷酸序列，其能夠以序列特異性的方式雜交到靶序列上并在PCR過程中延伸。擴增子(Amplicons)或PCR產物或PCR片段是包括引物和新合成的靶序列拷貝的延伸產物。多重PCR系統含有多套引物，其導致同時產生多個擴增子。引物可與靶序列完全匹配或者它們可含有內部錯配的堿基，該堿基可導致在特異的靶序列中導入限制性核酸酶識別/切割位點。引物也可含有額外的序列和/或修飾或標記的核苷酸以便于獲取或檢測擴增子。DNA的熱變性、引物與其互補序列的退火和退火引物以DNA聚合酶的延伸的重復循環導致靶序列的指數擴增。術語靶或靶序列指待擴增的核酸序列。術語模板指待擴增的原始核酸。限制性核酸內切酶介導的選擇性PCR(REMS-PCR)是由本發明人應用本發明方法建立的一種分析方法。該方法同時需要在PCR過程中有限制性核酸內切酶和DNA聚合酶活性。適于REMS-PCR的限制性核酸內切酶優選在與寡核苷酸引物在PCR過程中退火的嚴格條件相容的溫度，典型地為50℃-65℃時具有活性。在此范圍內具有高最適溫育溫度的一組商業上可得到的限制性核酸內切酶列于下表1。術語“個體”本文以廣義使用且意在囊括人類和非人類動物、細菌、酵母、真菌及病毒。表1</tables>A＝腺嘌呤，G＝鳥嘌呤，T＝胸腺嘧啶，C＝胞嘧啶，N＝A或G或T或C為了更為清晰地理解本發明的性質，其優選的形式將參照下面的實施例加以描述。實施例1評價限制性核酸內切酶活性/耐熱性的試驗活性/耐熱性試驗用于經一定數目的熱循環以后檢測包括BstNI、BslI、Tru9I和Tsp509I的限制性酸內切酶在各種緩沖液系統中的耐熱性和殘余的酶活性。比較BstNI、BslI和Tru9I在多種緩沖液條件中的活性/耐熱性。在25μl的總反應體積中含有引物(如下表2所示)，dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)各100μM，0.5單位的TaqDNA聚合酶(5單位/μl；AmpliTaq，珀金埃爾默公司)，以及或者20單位的BstNI(10單位/μl；新英格蘭Biolabs)或Tru9I(10單位/μl；BoehringerMannheim)或10單位的BslI(50單位/μl；新英格蘭Biolabs)。表2此外，反應含有下面堿性緩沖液系統(列于表3)之一，具有或不具有各種額外試劑。表3反應置于GeneAmpPCR系統9600熱循環儀(珀金埃爾默)中，加熱至高溫并按表4所示熱循環。表4熱循環以后，將5μl體積中的8μg質粒DNA(pGFP-Cl；Clontech)加入到每管中且反應在制造商列出的最佳溫度進行1小時。限制性核酸內切酶切割質粒DNA的能力通過在3％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上電泳加以測定。核酸內切酶分為失活(I)；具有低(L)、中等(M)或高(H)活性；或具有完全(F)活性(表5)。表5</tables>這些實驗表明在熱循環過程中限制性核酸內切酶的活性/耐熱性依據限制性核酸內切酶和其所處的緩沖液系統有很大的不同。Tris緩沖液中的pH和離子強度、單價陽離子(K+或Na+)的選擇和濃度、自由Mg2+的濃度和其它添加劑的存在，尤其是DTT的存在會影響活性/耐熱性。這些成份中每種成份的影響會依賴于緩沖液中的其它成分，例如，BstNI在含10mMMgCl2的PCR緩沖液II中較含3或6mMMgCl2的緩沖液中保留更多的活性。相反，當在HTris50(pH8.3)緩沖液中時在3～10mM之間改變MgCl2的濃度對BstNI活性幾乎沒有影響。在另一個實例中，緩沖液pH在MTris10較HTris50中對BstNI熱穩定性/活性具有更大的影響。在含有下面之一的緩沖液系統中BstNI經15個熱循環后維持完全活性且經30個熱循環后維持中等活性i)100mMNaCl，50mMTrisHCl(pH8.3)和6mMMgCl2或ii)100mMNaCl，50mMTrisHCl(pH8.0-8.5)和10mMMgCl2或iii)NEB3緩沖液和0.1mg/ml。在熱循環過程中BstNI在這些緩沖液中較在具有制造商推薦的緩沖液條件的0.1mg/ml乙酰化BSA的NEB2緩沖液中具有更高活性。類似檢測BslI活性/熱穩定性實驗表明為了在熱循環之后維持該核酸內切酶活性需要1mMDTT的存在。如果DTT存在，BslI在廣泛的條件范圍內保留活性。BslI在含有下面的緩沖液系統中經30輪熱循環后維持中等活性i)PCR緩沖液II(珀金埃爾默)，1mMDTT和10mMMgCl2，ii)Stoffel緩沖液(珀金埃爾默)，1mMDTT和10mMMgCl2，iii)50mMNaCl，10mMTrisHCl(pH8.5)，1mMDTT和10mMMgCl2，iv)100mMNaCl，50mMTrisHCl(pH8.3-8.5)，1mMDTT和10mMMgCl2或v)100mMNaCl，50mMTrisHCl(pH8.5)，1mMDTT和6mMMgCl2。Tru9I在含有100mMNaCl、50mMTrisHCl(pH8.5-9.25)、10mMMgCl2和1mMDTT的緩沖液系統中經30個熱循環后維持中等活性。類似上述的實驗表明Tsp509I在含有50mMNaCl、10mMTrisHCl(pH9.0～10)、10mMMgCl2和1mMDTT的緩沖系統中經30輪熱循環后維持中等活性。實施例2與限制性核酸內切酶和DNA聚合酶耐熱性/活性及PCR相容的緩沖液系統的鑒定測定能用于維持BstNI耐性/活性的緩沖液范圍(上述)也評定其與使用引物5BKIT或5BKIW與3KiE的PCR的相容性。建立含有基因組K562DNA(800ng)、30pmol5BKIT或30pmol5BKIW，30pmol3KiE，和dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)各100μM的PCR混合物用于各種緩沖系統。4單位的TaqDNA聚合酶(5單位/μl；AmpliTaq，珀金埃爾默)與TaqStartTM抗體(0.16μl于3.8μl的抗體稀釋緩沖液中；Clontech)混合以產生終摩爾比為1∶5的TaqDNA聚合酶TaqStartTM抗體。TaqDNA聚合酶TaqStartTM抗體混合物在加入上述混合物之前于室溫溫育15分鐘。總反應體積為100μl。反應置于GeneAmpPCR系統9600(珀金埃爾默)中，94℃變性2分鐘然后經60℃1分鐘，92℃20秒的30輪循環。熱循環以后反應在60℃維持15分鐘。無隨后的操作，通過5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上的電泳分析每個反應的28μl等分試樣，凝膠用StratageneEagleEyeIIVideo系統照相。以引物5BKIT與3KiE，或5BKIW與3KiE擴增的效率判定為低、中等或高。這些引物設計與限制性核酸內切酶BstNI結合用于多重REMS-PCR系統中。對BstNI活性/耐熱性的分析和PCR在相同的反應緩沖液中完成并經歷相同的熱循環過程。檢測兩種分析結果以找出既允許有效的PCR擴增又保持限制性核酸內切酶活性的條件(表6)。表6</tables>選擇同時i)導致以引物對5BKIT和3KiE的高效率擴增和以引物對5BKIW和3KiE的中等效率的擴增和ii)經至少15輪熱循環后保持完全的BstNI活性和經30輪熱循環后保持中等活性的緩沖液條件用于同時需要DNATaq聚合酶和BstNI活性的REMS-PCR分析。適合這些標準的緩沖液條件為100mMNaCl，50mMTrisHClpH8.3和6mMMgCl2。實施例3使用BstNI和DNATaq聚合酶的REMS-PCR在加入內部對照的多重系統中對K-ras基因密碼子12的分析。REMS-PCR方法用于檢測K-ras癌基因密碼子12的點突變。人類細胞系CaluI[ATTCHTB54]和K562[ATCCCCL243]獲自美國典型培養物保藏中心，CaluI是一種肺腺癌細胞，其在K-ras密碼子12是雜合的，既具有野生型(GGT)又具有突變型(TGT)序列(D.J.Capon1983自然304，507-513)，K562是一種人類白血病細胞系，其K-ras密碼子12為野生型的(R.L.Ward等，分子病理學1995，48，M273-277)。用標準技術(Sambrook等1989)從CaluI和K562中提取基因組DNA。DNA樣品用引物5BKIT，5BKIW，3MKiC和3KiE(表7)通過REMS-PCR擴增。表7引物5BKIT中的黑體字C相對于K-ras基因序列是錯配，如果密碼子12為野生型的，該錯配的堿基導致在K-ras擴增子中導入BstM識別/切割位點。含有在密碼子12的第1個或第2個核苷酸突變的擴增子不含有BstM識別/切割序列。引物5BKIT和5BKIW在其5’端以生物素標記并產生被類似標記的PCR擴增子。引物3MKiC的黑體字G相對于K-ras序列是錯配，這導致在引物內部導入BstM識別/切割位點并且將被摻入到以該引物和5BKIT或5BKIW擴增而產生的任何擴增子中。K562、CaluI的基因組DNA和CaluIK562的1∶10混合物(重量比)以多重REMS-PCR系統擴增，反應含有于100mMNaCl、50mMTris(pH8.3)和6mMMgCl2中的基因組DNA(800ng)，30pmol5BKIT，30pmol3KiE，5pmol5BKIW，80pmol3MKiC，dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)各100μM，80單位的BstNI(10單位/μl，新英格蘭Biolabs)和4單位TaqDNA聚合酶(5單位/μl，AmpliTaq，珀金埃爾默)。總反應體積為100μl，兩個對照反應或者含有CaluIDNA或者含有dH2O(無DNA)且均無BstNI存在。反應置于GeneAmpPCR系統9600(珀金埃爾默)中，94℃變性3分鐘后進行60℃1分鐘繼之以92℃20秒的30輪循環，熱循環后反應于60℃維持15分鐘。每個反應的25μl產物沒有隨后的操作而于5％的NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上電泳加以分析，凝膠用寶麗來(PolaroidLand)相機照相。在含有CaluIDNA但無BstNI的對照反應中，三個片段清晰可見；包括摻入引物5BKIT和3KiE擴增子的185bp的片段，包括摻入引物5BKIT和3MKiC的擴增子的156bp片段，和包括摻入引物5BKIW和3KiE的擴增子的114bp片段。包括摻入引物5BKIW和3MKiC擴增子的85bp的一條片段微弱可見。在含有BstNI的反應中，185bp片段的存在用于診斷K-ras密碼子12突變的存在，該片段可見于含CaluI和1∶10比例的CaluIK562DNA的反應中，但在只含K562DNA的反應中不能見到，156bp(和85bp)的BstNI對照片段在含有BstNI的任何反應中均不能見到，這證明BstNI可介導對第二個片段擴增的完全抑制。由于任何156bp的擴增子將含有BstNI位點，該片段擴增的抑制不依賴于密碼子12的突變狀況。限制性核酸內切酶對照片段的缺失可對陰性結果作清楚的判斷。114bp的PCR對照片段可見于包括含K562DNA反應的所有反應中，這證實反應條件，包括模板DNA量足以通過PCR進行擴增。PCR對照片段的存在可對陽性結果作清楚的判斷。在不含DNA的反應中未見任何片段。實施例4REMS-PCR點突變檢測的限度用REMS-PCR檢測點突變的限度通過分析含有以SupTIDNA稀釋的CaluIDNA的樣品中K-ras基因的密碼子12加以評定。SupTI[ATCCCRL1942]是獲自美國典型培養物保藏中心的一種白血病細胞系。CaluI是K-ras密碼子12的雜合突變子而SupTI是K-ras基因密碼子12的野生型。用標準技術(Sambrook等1989)從這些細胞系中提取基因組DNA并以REMS-PCR擴增。CaluIDNA以SupTIDNA稀釋成1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105和1∶106的CaluI∶SupT1的比例(重量比)。REMS-PCR反應含有在100mMNaCl、50mMTris(pH8.3)和6mMMgCl2中的基因組DNA(1μg)，30pmole5BKIT、30pmole3KiE，5pmole5BKIW，dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)各100mM，和40單位的BstNI(10單位/μl，新英格蘭Biolabs)。將4單位的TaqDNA聚合酶(5單位/μl；AmpliTaq，珀金埃爾默)與TaqStartTM(0.16μl于3.8μl的抗體稀釋緩沖液中；Clontech)混合以產生終摩爾比例為1∶5的TaqDNA聚合酶TaqStartTM。TaqDNA聚合酶TaqStartTM抗體混合物在加入PCR混合物之前于室溫溫育15分鐘。總反應體積為100μl。反應置于GeneAmpPCR系統9600(珀金埃爾默)中，94℃變性2分鐘后進行60℃1分鐘繼之以92℃20秒的30輪循環。熱循環以后反應在60℃維持15分鐘。每個反應的28μl等份試樣未經隨后的操作而通過5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上的電泳加以分析，凝膠用Polaroidland(寶麗來)相機和Stratagene鷹眼II成像系統照相。以引物5BKIT和3KiE擴增而產生的185bp片段用于診斷密碼子12突變的存在，該片段通過Polaroid照相和鷹眼成像可見于含有1∶10、1∶102和1∶103比例的CaluI∶SupT1DNA的反應中及通過鷹眼成像可見于含有1∶104比例的反應中。該185bp片段既不見于含有1∶105和1∶106比例的CaluI∶SupT1DNA的反應中也不見于僅含SupT1的反應中。以引物5BKIW和3KiE片段擴增而產生的114bp的PCR對照片段可見于所有反應中，這證明反應條件，包括模板DNA的量足以通過PCR有效地擴增。REMS-PCR反應也進行了比色分析，該分析類似于Findlay等描述的比色分析(臨床化學，199339/9，1927-1933)。PCR擴增子通過雜交到寡核苷酸探針上而被特異性捕獲，該探針共價附著到施加到PeriodontalSurecell空白處分離位置的乳膠珠上。捕獲寡核苷酸的序列和捕獲到的特異PCR擴增子列表如下(表8)。K-Capl和K-Cap2被特異性地設計成僅捕獲以引物5BKIT和3KiE經突變模板擴增而產生的診斷性K-ras擴增子。K-Cap3被設計成捕獲以5BKIT或5BKIW與3KiE經突變或野生型模板擴增而產生的擴增子。H-Capl捕獲非特異性擴增子并提供非特異性擴增或雜交的陰性對照。表84種寡核苷酸乳膠珠(以0.25％分散于1.6μl10mMTris，1mMEDTApH7.4中)的等分試樣施加到Surecell膜上的不同位點，所有4種寡核苷酸位于每個Surecell孔中。讓寡核苷酸乳膠珠干燥15分鐘。30μl每個PCR的等分試樣以170μl50mM的KCl、10mMTris(pH8.3)和10mMMgCl2稀釋。溶液于95℃變性6分鐘并施加于Surecell孔。Surecells然后于50℃溫育5分鐘從而使PCR擴增子與捕獲寡核苷酸雜交。以300μl50mMKCl、10mMTris(pH8.3)和10mMMgCl2于50℃洗孔。雜交的擴增子與三滴結合到辣根過氧化物酶(EC1.11.1.7)的鏈霉菌抗生物素蛋白綴合物反應并于室溫溫育2分鐘。重復洗滌步驟使非特異性反應降至最低。加入4滴Leucodye/H2O2且Surecell于室溫溫育2分鐘。固定的復合物在染料分子從無色至藍色形式的氧化性轉化中用作催化劑。反應以4滴0.1％NaN3終止。得到的有色斑點通過與顏色表比較而以肉眼計分且分級為0(無色)至10(深藍)(表9)表9</tables>當通過凝膠電泳或比色分析時，REMS-PCR方法的敏感性當存在于1∶103～∶1∶104野生型序列的背景中時允許對選擇性擴增的K-ras密碼子12突變子序列的檢測。野生型K-ras密碼子12序列在該REMS-PCR分析中沒有檢測到。文獻表明此水平的敏感性將足以分析從臨床標本中提取的DNA，包括組織切除和活體解剖，細胞學樣品和體液/分泌物如糞便、尿液和含有少量表皮脫落腫瘤細胞的痰。在臨床上，大量的樣品同時分析，擴增不預先開始是必要的，因為這會導致非特異性產物包括引物二聚體的擴增。單克隆抗體會結合到DNATaq聚合酶上，因而在第一個變性步驟之前抑制活性和擴增。在最初用REMS-PCR的實驗中，由Clontech推薦的1∶28的DNATaq聚合酶TaqStartTM的標準摩爾比由于野生型SupTlDNA模板的擴增而導致假陽性結果，檢測了各種摩爾比并確立了DNATaq聚合酶TaqStartTM抗體的低摩爾比如1∶5可抑制非特異性擴增和引物二聚體的形成而無假陽性結果。實施例5用REMS-PCR對臨床標本的分析用標準的方法(Sambrook等1989)從正常結腸粘膜(NC)和結腸腺癌(CA)中提取基因組DNA。用實施例4中的帶有下列步驟變化的REMS-PCR分析樣品中K-ras密碼子12突變的存在；DNA(0.5μg)在4單位TaqDNA聚合酶和80單位BstNI的存在下擴增。不經隨后的操作通過5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上的電泳分析每個反應的30μl等份試樣。以引物5BKIT和3KiE擴增而產生的185bp片段診斷密碼子12中突變的存在，通過凝膠電泳在含有腺癌樣品CA7和CAg的DNA的兩個反應中可見該片段，該診斷片段在含有腺癌樣品CA1和CA2的DNA的其它兩個反應中未能見到，在含有從正常結腸粘膜NC1、NC2、NC7及NC8中提取的DNA的4個反應中也未能見到。以引物5BKIW和3KiE擴增而產生的114bp的對照片段可見于所有的反應，表明有效的PCR擴增發生于所有的反應中。結腸組織基因組DNA以前通過標準的富集PCR(R.LWard等，分子病理學199548，M273-277)分析K-ras密碼子12突變的存在。用REMS-PCR或富集PCR進行的擴增接著以凝膠電泳分析獲得了一致的結果。兩種PCR方法表明腺癌樣品CA7和CA8的DNA帶有K-ras密碼子12的突變而腺癌CA1和CA2、以及正常的粘膜樣品NC1、NC2、NC3和NC4的DNA在密碼子12位置是野生型的。這些結果證明REMS-PCR適于臨床標本的快速分析。實施例6REMS-PCR一種允許鑒定特異性核苷酸取代的系統REMS-PCR系統用于檢測K-ras癌基因密碼子12的點突變，額外的以限制性核酸內切酶的分析既證實了密碼子12突變的診斷又允許鑒定特異的核苷酸取代。人類細胞系CaluI[ATCCHTB54]，A549[ATCC]，K562[ATCCCCL243]，SupT1[ATCCCRL1942]獲自美國典型培養物保藏中心。CaluI為一種肺腺癌細胞，其在K-ras密碼子12上為雜合的，既具有野生型(GGT)又具有突變(TGT)序列(D.J.Capon1983自然304，507-513)。A549為一種K-ras密碼子12純合突變子(AGT)的肺腺癌細胞(D.M.Valenzuela和J.Groffen1986NAR14，843-852)。K562和SupT1為K-ras密碼子12為野生型的白血病細胞系。用標準技術(Sambrook等1989)從這些細胞系中提取基因組DNA。REMS-PCR以引物5BKIT和3AKIP完成，其同時導入多個限制性核酸內切酶識別/切割位點。引物5BK5和3K6作為PCR對照引物而起作用。(表10)表10</tables>引物5BKIT導致在密碼子12為野生型的K-ras擴增子中導入BstNI識別/切割位點。引物3AKIP在密碼子12突變的K-ras擴增子中誘導一個或更多個限制內切酶BsaJI、StyI、AvrII、MnlI、AciI、RleI和Bsu36I的識別/切割位點，如下所示(表11)。表11</tables>突變擴增子對限制性核酸內切酶BsaJI、StyI、AvrII、MnlI、AciI、RleI和Bsu36I切割敏感性和抗性的預期模式依賴于密碼子12的實際突變并列于表12。表12</tables>人類細胞系CaluI、A549、K562和SupTl的基因組DNA于多重REMS-PCR系統中擴增，反應于100mMNaCl、50mMTris(pH8.3)和6mMMgCl2中含有基因組DNA(500ng)、50pmole5BKIT、50pmole3AKIP、3pmole5BK5、3pmole3K6、dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)各100mM、40單位的BstNI(10單位/μl，新英格蘭Biolabs)。4單位的TaqDNA聚合酶(5單位/μl；AmpliTaq，珀金埃爾默)與TaqStatTM抗體(0.06μl于1.5μl抗體稀釋緩沖液，Clontech)混合以產生終摩爾比為1∶2的TaqDNA聚合酶TaqStartTM抗體。在加入反應之前將TaqDNA聚合酶TaqStartTM抗體混合物于室溫溫育15分鐘。總反應體積為100μl。反應置于GeneAmpPCR系統9600(珀金埃爾默)中，94℃變性3分鐘且然后進行60℃1分鐘接著92℃20秒的30輪循環。熱循環以后反應于60℃維持15分鐘。每個反應的20μl等分試樣不經隨后的操作通過于5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上的電泳加以分析，凝膠用寶麗來(polaroidland)相機照相。以引物5BKIT和3AKIP擴增而產生的58bp的片段診斷密碼子12突變的存在，此片段可見于含有CaluI和A549DNA的反應中，但未能見于含SupTl或K562DNA的反應中。以引物5BK5和3K6擴增而產生的167bp的PCR對照片段存在于所有的反應中，包括含有SupTl和K562DNA的反應中。這證實了在所有反應中出現有效的PCR擴增。含有CaluI或A549DNA反應的15μl等分試樣以10單位限制性核酸內切酶BsaJI、StyI、AvrII、MnlI或AciI(如下表13所示)消化并于制造商(新英格蘭Biolabs)說明的最適消化溫度溫育。反應用5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上的電泳加以分析且凝膠用寶麗來相機照相。表13此REMS-PCR系統允許對K-ras癌基因密碼子12突變的檢測。隨后的限制性核酸內切酶分析證實了突變的存在并且允許對特異核苷酸取代的鑒定。實施例7使用BstNI和Stoffel聚合酶的REMS-PCR系統人類細胞系CaluI[ATCCHTB54]和SupT1[ATCCCRL1942]的基因組DNA用REMS-PCR擴增。用標準的技術(Sambrook等1989)從這些細胞系中提取基因組DNA，DNA用REMS-PCR擴增，反應中含有溶于10mMKCl、10mMTris(pH8.3)和10mMMgCl2(1×Stoffel緩沖液；珀金埃爾默)中的基因組DNA(1μg)、30pmol5BKIT、30pmole3KiE、2pmole的5BKIW，dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)各100mM，和40單位的BstNI(10單位/μl，新英格蘭Biolabs)，對照反應不含DNA(dH2O)。將5單位的Stoffel片段(10單位/μl；珀金埃爾默)與Taq抗體TP4(D.J.Sharkey等1994生物/技術12，506-509)(0.05μl于1.2μl的Clontech抗體稀釋緩沖液)混合以產生終摩爾比為1∶2的Stoffel片段Taq抗體TP4。在加入反應之前將Stoffel片段Taq抗體混合物于室溫溫育15分鐘。總反應體積為100ul。反應置于GeneAmpPCR系統9600(珀金埃爾默)中，94℃變性2分鐘且然后進行60℃1分鐘接著92℃20秒的30輪循環。熱循環以后反應于60℃維持15分鐘。25μl的每種反應的等份試樣未經隨后的操作通過5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上的電泳加以分析，凝膠用寶麗來相機拍照。以引物5BKIT和3KiE擴增而產生的185bp片段診斷密碼子12突變的存在，此片段可見于含CaluIDNA的反應中，但未見于含SupTIDNA的反應中，以引物5BKIW和3KiE擴增而產生的114bpPCR對照片段可見于兩者的反應中，表明PCR有效地擴增。沒有片段可見于不含模板的對照反應中。實施例8使用BslI和TaqDNA聚合酶的REMS-PCR系統REMS-PCR分析方法被開發以檢測K-ras癌基因密碼子12的點突變。在這種分析中，如果擴增子在密碼子12為野生型，它們含有耐熱限制性核酸內切酶BslI的識別/切割序列。在密碼子12的第一或第二個核苷酸含有突變的擴增子不含有BslI的識別/切割序列。人類細胞系CaluI[ATCCHTB54]和K562[ATCCCCL243]的基因組DNA用REMS-PCR擴增。CaluI在K-ras基因的密碼子12為雜合突變子而K562在密碼子12為野生型。用標準技術(Sambrook等1989)從這些細胞系中提取基因組DNA，CaluIDNA以K562DNA稀釋成1∶10、1∶102、1∶103的CaluIK562比例(重量)。DNA用引物5BKIQ、5BKIW和3KiH(表14)通過REMS-PCR擴增。5BKIQ中的2個粗體C相對于K-ras基因的序列是錯配，這些錯配的堿基導致在密碼子12為野生型的擴增子中引入BslI位點。引物5BKIQ和5BKIW為生物素標記的。表14</tables>反應含有溶于100mMNaCl、50mMTris(pH8.5)、1mMDDT和6mMMgCl2中的基因組DNA(400ng)、30pmole5BKIQ、15pmole3KiH、0.5pmole5BKIW、dNTP(dATP、dCTP、dCTP、dTTP、dGTP)各100μM和10單位的BslI(50單位/μl，新英格蘭Biolabs)。將8單位的TaqDNA聚合酶(5單位/μl；AmpliTaq，珀金埃爾默)與TaqStartTM抗體(0.16μl于3.8μl的抗體稀釋緩沖液中；Clontech)混合以產生終摩爾比為1∶5的TaqDNA聚合酶TaqStartTM抗體。TaqDNA聚合酶TaqStartTM抗體混合物在加入反應之前于室溫溫育15分鐘。總反應體積為50μl。反應置于GeneAmpPCR系統9600(珀金埃爾默)中并于94℃變性2分鐘。反應然后進行10輪63℃30秒接著92℃20秒的循環且然后20輪55℃1分鐘接著92℃20秒的循環。熱循環以后反應于55℃維持15分鐘。每種反應的28μl等份試樣未經隨后的操作，通過5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rock/and，MD)上的電泳加以分析，凝膠用寶麗來相機照相。以引物5BKIQ和3KiH擴增而產生的180bp的片段診斷密碼子12突變的存在，此片段可見于含有1∶10和1∶102比例的CaluI∶K562的反應中。此180bp的診斷片段未能見于含1∶103比例CaluI∶SupT1的反應中或僅含K562的反應中。以引物5BKIW和3KiH擴增而產生的109bp的PCR對照片段可見于所有的反應中表明經PCR有效地擴增。此系統用限制性核酸內切酶BslI檢測K-ras密碼子12的突變，此限制性核酸內切酶可用于檢測發生于3個ras-癌基因K-ras、H-ras及N-ras中任何一個密碼子12或13突變的系統，其也可用于分析發生于編碼甘氨酸或脯氨酸密碼子的其它突變或發生于核苷酸C或G的其它突變。實施例9通過需要隨后的BstNI消化的REMS-PCR方法對K-ras密碼子12的分析一種替代方法可用于檢測K-ras癌基因密碼子12的點突變。用標準的技術(Sambrook等1989)從CaluI[ATCCHTB54]和K562[ATCCCCL243]中提取基因組DNA。CaluIDNA用K562DNA以1∶10、1∶102、1∶103和1∶104的CaluI∶K562比(重量)稀釋。DNA樣品用具有序列GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT的引物5BKIM和具有序列GGATGACTCATTTTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAG的引物3AKIL擴增。在引物5BKIM中的粗體C相對于K-ras基因序列是錯配并且如果它們在密碼子12為野生型則導致在K-ras擴增子中引入BstNI的識別/切割位點。3AKIL中與K-ras錯配的堿基在下面劃線。在總反應體積為100μl的反應中含有基因組DNA(800ng)、40pmole5BKIM和40pmol3AKIL、dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)各100μM、10μl的10×PCR緩沖液II(珀金埃爾默)、1.5mMMgCl2、80單位的BstNI(10單位/μl，新英格蘭Biolabs)和2單位TaqDNA聚合酶(5單位/μl；AmpliTaq，珀金埃爾默)。反應置于GeneAmpPCR系統9600(珀金埃爾默)中，94℃變性3分鐘并且然后進行40輪60℃1分鐘接著92℃20秒的循環。熱循環以后反應于60℃維持15分鐘。25μl的每種反應液的等份試樣未經隨后的操作加以分析。每種反應的第二個25μl等份試樣在35μl的總反應體積中與15單位BstNI(10單位/μl，新英格蘭Bioolabs)，100μg/ml牛血清白蛋白(新英格蘭Biolabs)和3.5μl的10XNEB2緩沖液(新英格蘭Biolabs)溫育。這些反應覆蓋以20μl的礦物油并于60℃溫育過夜。所有反應通過5％NusieveGTG凝膠(FMCBioproducts，Rockland，MD)上的電泳加以分析并用寶麗來相機照相。在PCR以后以BstNI消化的所有反應中，可見以引物5BKIM和3AKIL擴增而產生的103bp的片段僅可見于含1∶10、1∶102和1∶103比例CaluI∶K562DNA的反應中。103bp片段未能見于含有1∶104比例的CaluI∶K562DNA的反應中也未能見于僅含K562DNA的反應中。由BstNI消化野生型擴增子而產生的73bp片段可見于所有的反應中。在PCR以后以BstNI消化的反應中，103bp片段的存在能診斷K-ras密碼子12突變的存在。當以1∶103比例的CaluI∶K562DNA存在時此種方法的敏感性允許對突變CaluIDNA的檢測。在這些反應條件下，在PCR反應中包括BstNI導致優先擴增(富集)突變序列但不導致野生型K562序列擴增的完全抑制。因此反應在最好分析之前用BstNI的消化。這種方法具有在標準富集PCR方法(需要二輪PCR加上中間的限制性核酸內切酶消化以富集突變序列)和標準的REMS-PCR方法(其中野生型序列的擴增被完全抑制且在分析之前無需隨后的操作如消化)之間的中度簡單性。討論在REMS-PCR方法中限制性核酸內切酶和DNA聚合酶必需i)在必需與PCR相容的相同反應條件(如，鹽、pH)中起作用和ii)在這些反應條件中足夠耐熱以在PCR需要的熱循環過程中維持活性。列于表1的一些限制性核酸內切酶以及其它耐熱限制性核酸內切酶如果緩沖液條件可鑒定如下將適用于摻入REMS-PCR方法中，所述的緩沖液條件為i)與限制性核酸內切酶活性相容并當反應為PCR過程中的熱循環時維持核酸內切酶活性和ii)與同時的DNA聚合酶活性相容并當PCR過程中熱循環時維持聚合酶活性。由于以前對限制性核酸內切酶在PCR所需的熱循環過程中維持活性的能力知之甚少，故開發出一種簡便易行的分析方法以鑒定候選的耐熱限制性核酸內切酶和反應條件。在活性/耐熱性分析中，在各種反應條件中限制性核酸內切酶的酶活性可在一定數目的熱循環以后加以比較。在這種分析方法中，制備含標準PCR濃度的引物、dNTP，和DNA聚合酶的反應液。反應液中不含模板DNA但包括緩沖液系統，具有或不具有額外試劑，和待測的限制性核酸內切酶。反應置于熱循環器中，升至高溫然后熱循環，經一定數目的熱循環以后終止反應，質粒DNA加入管中并且反應在制造商指定的限制性核酸內切酶的最適溫度下溫育。限制性核酸內切酶的酶活性可通過觀察凝膠電泳上質粒DNA的切割程度而加以評定。活性/耐熱性分析鑒定出各種限制性核酸內切酶，包括BstNI、BslI、Tru91和Tsp509I，它們在一些緩沖液條件中足以耐熱以在PCR必需的熱循環以后維持適度的或完全的催化活性。在熱循環過程中保持催化活性最有效的反應條件被鑒定出來。限制性核酸內切酶經熱循環后的催化活性依據緩沖液的pH和離子強度、單價陽離子(K+或N+)的選擇和濃度、游離Mg2+的濃度、和其它添加劑包括二硫蘇糖醇(DTT)的存在而改變。這些成份中每種成分的影響依賴于緩沖液中的其它成分。也很有可能限制性核酸內切酶的酶活性通過降低PCR過程中的溫度和DNA變性的時間而得以保持。已知影響雙螺旋DNA分子解鏈溫度的因素包括鹽濃度和試劑如甲酰胺、二甲亞砜、甘油和乙二醇的存在，這些試劑至少有一些PCR系統相容。包括進這些或其它影響DNA解鏈溫度的試劑可以允許PCR在降低的變性溫度和/或時間完成。這些試劑也可對限制性核酸內切酶(和/或DNA聚合酶)的活性和/或耐熱性具有直接的正面或負面影響。在額外試劑的存在下各種熱循環溫度曲線對限制性核酸內切酶活性的影響可通過上述的耐熱性/活性分析方法加以評定。額外的耐熱限制性核酸內切酶，和熱循環過程中保持限制性核酸內切酶活性的反應條件的鑒定可用常規的活性/耐熱性檢測無需創造性勞動便可完成。對于REMS-PCR，反應條件必需不僅保持限制性核酸內切酶的催化活性而且它們必需適用于PCR，因此緩沖液條件必需與熱循環過程的DNA聚合酶的活性和耐熱性相容。有許多商業上提供的可用于PCR的DNA聚合酶，這些酶的一般性質變化很大，包括它們的最適緩沖液條件和它們可耐受的條件范圍。在已知保持限制性核酸內切酶活性的反應條件下對PCR中各種DNA聚合酶效率的檢測允許對相容的DNA聚合酶/限制性核酸內切酶/緩沖液組合的鑒定。已證明維持限制性核酸內切酶活性的反應條件范圍也用各種引物和各種DNA聚合酶分析了它們與PCR的相容性。反應條件的不同成分對PCR的影響依不同的引物對而變化并且可依賴其它的反應成分。為此，PCR需要的具體引物套應以這種方式檢測。與限制性核酸內切酶和DNA聚合酶同時活性相容并導致用具體引物對有效擴增的PCR條件可經常規的無需創造性勞動的測試加以鑒定。REMS-PCR需要耐熱限制性核酸內切酶識別/切割位點跨越待分析遺傳變異的核苷酸，該位點或者可自然產生或者可通過含內部的與模板錯配的引物加以誘導。當限制性核酸內切酶識別/切割位點通過引物誘導時，該位點部分位于引物內且部分位于擴增子中引物3’的合成序列內。因此，引物必需包括需要用于誘導限制性核酸酶位點的任何錯配堿基，但不應該與待分析堿基重疊。設計在近3’末端含有錯配堿基的PCR引物的規則已經建立(S.Kwok，等1990，核酸研究18，999-10005)。雖然有些末端錯配的引物不能有效地擴增并降低特異性擴增子的產量達100倍，但大多數將與完全配對的引物一樣有效地擴增。例如當引物中末端3’堿基為G時，它在互補位置上含C、T或G的模板上延伸，但不在互補位置上含A的模板上延伸。當限制性核酸內切酶僅需要一個短的四核苷酸識別序列(如Tru9I或Tsp509I)或當它們識別多個序列(如BstNI)時，識別/切割位點可更容易地誘導。識別間斷的短序列的限制性核酸內切酶的識別/切割位點特別易于誘導，例如，BslI識別序列CCNNNNNNNGG，其中N為任意核苷酸。BslI可用于分析發生于編碼甘氨酸(GGN)或脯氨酸(CCN)密碼子的突變。一般地，設計的在這些密碼子中誘導BslI識別位點的引物可由DNA聚合酶延伸因為它們將不需要近3’末端的錯配堿基并且位于引物序列中部的單個或兩個不匹配堿基能耐受并常不抑制PCR擴增。此外，本領域的技術人員可設計能誘導BslI識別位點的引物用于分析發生于G或C的大多數(約80％)突變。堿基G和C的突變很常見，例如，發生于G或C堿基的p53突變的百分比在結腸癌突變中至少為77％，在肺癌突變中至少為72％，在膀胱癌突變中至少為74％，在乳腺癌突變中至少為61％且在腦腫瘤突變中至少為66％(M.Hollstein等1996核酸研究24，141-146)。下表列出圍繞堿基C或G序列的所有可能的組合和用于在這些位置誘導CC或GG作為BslI位點的一部分的引物所需的末端堿基。預計與PCR相容的模板/引物組合示于表15。表15</tables>與獲得性疾病有關的基因中天然或誘導的耐熱限制性核酸內切酶的識別/切割位點的實例列于表16，在這些實例中，識別野生型序列的限制性核酸內切酶被鑒定。該表包括已知與REMS-PCR相容的限制性核酸內切酶和與本方法可能相容的其它核酸內切酶。用于這些突變分析的引物必需包括需要誘導的堿基(以粗體表示)但不能與待分析的堿基(下劃線)重疊。Ras-原癌基因(K-ras，H-ras和N-ras)在很多人類癌癥中通過獲得密碼子12、13和61的點突變而被頻繁激活。由于所有三種ras基因的密碼子12和13均編碼甘氨酸所以BslI能用于分析大多數ras-突變。H-ras的內含子D中的一個新的點突變也發現于膀胱癌中。HIV毒株對一些藥物的抗性與獲得點突變有關。表16</tables>可帶有與疾病有關的可遺傳突變的一組基因的選擇列于表17。列出的序列或者為野生型或者為突變子并且可能的序列變異位置在其下面劃線示出。隱性突變的分析需要區分雜合的攜帶者與純合的個體，后者具有疾病發生的風險。對于所有下面的實例，識別野生型序列的限制性核酸內切酶被鑒定出來。對于囊性纖維化轉膜傳導基因，識別突變序列的限制性核酸內切酶也被鑒定出來。表17</tables>以前很少知道關于PCR中包括耐熱限制性核酸內切酶的作用。已發現在PCR過程中同時具有限制性核酸內切酶和DNA聚合酶活性會導致(i)含有限制性核酸內切酶識別/切割位點序列擴增的抑制和(ii)缺乏限制性核酸內切酶識別/切割位點的此序列變異體的選擇性擴增，此發現使得開發出名為REMS-PCR的方法，這種方法可用于分析獲得性或遺傳多態性，包括點突變、小的缺失和插入。當REMS-PCR方法被設計成檢測突變序列時，野生型而不是突變子序列含有耐熱限制性核酸內切酶的識別/切割序列。野生型序列的PCR擴增被限制性核酸內切酶的活性抑制。相反，突變子序列在PCR過程中被DNA聚合酶選擇性擴增。REMS-PCR方法也可被設計成選擇性抑制突變子的擴增而不是抑制野生型序列的擴增。如果REMS-PCR方法被設計成檢測野生型序列，突變子而不是野生型序列含有耐熱限制性核酸內切酶識別/切割序列。突變子序列的PCR擴增將被限制性核酸內切酶的活性抑制并且野生型序列將由PCR選擇性的擴增。未能擴增特異的野生型序列表示純合突變。既能檢測野生型又能檢測突變序列表示雜合突變的存在。幾種REMS-PCR方法被開發用于K-ras癌基因密碼子12的點突變分析。這些方法利用了同時具有酶活性的BstNI和DNATaq聚合酶，或BstNI和Stoffel片段聚合酶，或BslI和DNATaq聚合酶。這些方法包括多重引物系統，包括診斷引物和一套或兩套對照引物。如果密碼子12位置1和2為野生型的，診斷性引物在K-ras擴增子中誘導BstNI或BslI的識別/切割位點。在PCR中包括進這些限制性核酸內切酶中的一種導致對野生型DNA模板擴增的抑制和含有密碼子12位置1或2突變DNA模板的選擇性擴增，因此以這些引物的擴增能診斷密碼子12點突變的存在。額外的對照引物包括在所有的反應中以證實反應條件，包括模板DNA的量足以通過PCR擴增。這些PCR對照引物可位于不含限制性核酸內切酶識別/切割位點的任何區域的兩側，摻入這些引物的擴增子必需存在以用于清楚地解釋陰性結果。第二個對照引物包括進一個多重系統中以證實限制性核酸內切酶可介導PCR擴增的完全抑制。用于限制性核酸內切酶的對照引物必需或者誘導用于REMS-PCR方法中的限制性核酸內切酶的識別/切割位點或者位于該位點兩側。缺少摻入這些引物的擴增子明確指示陽性結果。REMS-PCR檢測的限度通過在BstNI和DNATaq聚合酶的存在下分析含有稀釋于SupT1DNA(K-ras密碼子12野生型)中的CaluIDNA(K-ras密碼子12的雜合突變子)的樣品加以評定。診斷性擴增子的檢測表明密碼子12為的K-ras序列的存在。診斷性擴增子用凝膠電泳和比色分析，在含有1∶10-1∶10,000比例的CaluI∶SupT1的樣品而不是僅含有SupT1的樣品中加以觀察。PCR對照擴增子在所有包括SupT1DNA的樣品加以檢測。文獻表明此水平的敏感性將足以對從以下臨床標本中提取DNA的分析，包括組織切除和活體解剖材料，細胞學樣品和體液/分泌物如糞便、尿液和含有少量脫表皮的腫瘤細胞的痰(D.Sidranky等.，1992科學256，102-1；L.Mao等，1994癌癥研究，54，1634-1637)。應用REMS-PCR對臨床標本的分析已被證實。K-ras密碼子12的突變在4個結腸腺癌中的2個提取的DNA中檢測到但沒有在4個正常結腸粘膜中提取的DNA中檢測到。REMS-PCR的延伸中，此方法可用下面的引物完成，該引物同時誘導i)僅存在于野生型序列中的限制性核酸內切酶識別/切割位點和ii)對所有可能的突變序列特異的限制性核酸內切酶多重識別/切割位點。以限制性核酸內切酶對診斷擴增子的隨后分分證實了在這些擴增子中突變的存在和對所有情況下確切核苷酸取代的鑒定。開發這樣一種REMS-PCR系統也是可能的其導致突變序列的選擇性擴增但不導致野生型序列擴增抑制或反之亦然。因此在分析之前，反應物在PCR以后需要以適當的限制性核酸內切酶消化。這種方法具有標準富集PCR方法和野生型序列擴增被完全抑制的標準REMS-PCR方法之間的中度簡單性。REMS-PCR與多種捕獲和檢測系統是相容的，其能使全部方法自動化并因此可對大量樣品快速分析。捕獲系統的實例包括但不限于i)GCN4包被平板上捕獲的帶GCN4識別標記的PCR引物；ii)以抗生物素蛋白或鏈霉菌抗生物素蛋白捕獲生物素標記的引物；iii)用抗地高辛抗體捕獲的地高辛標記的產物；和iv)附著于乳膠珠或磁珠上的互補寡核苷酸。檢測系統的實例包括，但不限于，i)以鏈霉菌抗生物素蛋白/辣根過氧化物酶觀察的生物素標記的PCR引物；ii)以異硫氰酸熒光素或堿性磷酸酶分子直接標記；和iii)用抗地高辛抗體檢測的地高辛標記的產物。REMS-PCR提供了適于分析與疾病有關的遺傳變異的靈敏而快速的方法。在PCR過程中同時維持限制性核酸內切酶和DNA聚合酶活性的能力使得能開發在反應中選擇性擴增變異體序列的簡單方法，該反應在PCR起始時便含有所有試劑，包括所有的酶。反應可在密閉的系統中完成從而減少PCR減少過程中污染的機會。EMS-PCR方法較其它應用限制性核酸內切酶介導選擇性擴增和/或分析突變序列的方法具有更少的步驟。一般地，在檢測之前反應不需進一步的操作，然而，為了鑒定確切的核苷酸取代，該方法不排除對診斷擴增子的隨后分析。選擇性擴增和以限制性核酸內切酶分析所需步驟數的減少使REMS-PCR分析變得快速、省力且更易自動化。本領域的技術人員將會懂得在不離開大概描述的本發明的精神或范圍時可對具體實施方案中顯示的本發明作眾多的變化和/或改良。因此，本實施方案在各個方面被看成是說明性的而不是限制性的。參考文獻Capon，D.J.，Seeburg，P.H.，McGarth，J.P.，Hayflick，J.S.，Edmun，U..Levinson，A.D.和Goeddel，D.V.(1983)在人類結腸和肺癌中Ki-ras2基因通過2個不同的點突變而激活。自然304，507-513。Chehab，F.F.，Doherty，M.，Cai，S.，Kan，Y.W.，Copper，S.和Rubin，E.M.(1987)鐮刀型細胞貧血和地中海貧血的檢測。自然329，293-294。Cohen，J.B.和LevinsonA.D(1988)負責c-Ha-ras癌基因增加的表達和轉化活性的最后一個內含子中的點突變。自然334，119-124。KumarR.和BarbacidM.(1988)單細胞水平癌基因的檢測。癌基因3，647-651。Kwok，S.，Kellogg，D.E.，McKinney，N.，Spasic，D.，Goda，L.，Levenson，C.和Sninsky，J.J.(1990)引物模板錯配對聚合酶鏈式反應的影響人類免疫缺腺病毒I型模式研究。核酸研究，18，999-10005)。Levi，S.，Urbano-Ispizua，A.，Gill，R.，ThomasD.M.，GilbertsonJ.，FosterC和MarshallC.J.(1991)，以靈敏的聚合酶鏈式反應技術證明的膽管腺癌中多重K-ras密碼子12突變。癌癥研究，51，3497-3502。Mao，L.，HrubanR.H.，BoyleJ.O.，TockmanM.和SidranskyD.(1994)痰中癌基因突變的檢測領先于肺癌的診斷。癌癥研究，54，1634-1637。Saiki，R.K.，Scharf，S.，Faloona，F.，Mullis，K.B.，Horn，G.T.，Erlich，H.A.和Amheim，N.(1985)β-珠蛋白基因組序列的酶促擴增和用于診斷鐮刀型細胞貧血的限制位點分析。科學230，1350-1354。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆實驗手冊，第二版，紐約冷泉港實驗室出版社。Sharkey，D.J.，Scalice，E.R.，Christy，K.G.Jr.，Atwood，S.M.和Daiss，J.L.(1994)作為不耐熱開關的抗體高溫激發聚合酶鏈式反應。生物/技術12，506-509。Sidransky，D.，TokinoT.，HamiltonS.R.，KinzlerK.W.，LevinB.，FrostP.和VogelsteinB.(1992)可治愈結腸癌病人糞便中ras癌基因突變的鑒定。科學256，102-105。Singh，J.，Rao，C.V.，KulkarniN.，SimiB.和ReddyB.S.(1994)在結腸癌化學預防中作為過渡端點的分子標記在結腸癌發生過程中由sulindac和苯己烷異硫酸氰鹽導致ras激活的調節。國際癌癥學雜志5，1009-1018。Todd，A.V.，Ireland，C.M.和Iland，H.J(1991)等位基因特異性富集在急性骨髓白血病中低水平N-ras基因的檢測方法。白血病5，160-161。Valenzuela，D.M.和GroffenJ.(1986)具有c-K-ras癌基因位置12新突變的4個人類腫瘤細胞系。核酸研究14，843-852。Ward，R.L.，Santiago，F.，Hawkins，N.J.，Coomber，D.，O’Connor，T.和Todd，A.V.(1995)用于檢測結腸癌中激活的K-ras的快速PCRELISA。臨床病理學雜志分子病理學48，M273-277。引用的專利WO84/01389(Weinberg等，馬塞諸薩工學院)EPO684315AI(BectonDickinsonandCompany)US4683202(Mullis，K.B.Cetus公司)US4683195(Amheim，N.等，Cetus公司)US4800159(Ainheim，N等，Cetus等)US4965188(EhrlichH.A.等，Cetus公司)US5176995(ErlichH.A.等，Hoffmann-LaRoche公司)權利要求1.一種檢測個體中遺傳多態性的方法，該方法包括以下步驟(1)獲取含有個體核酸的樣品；(2)通過包括熱循環和引物的方法擴增步驟(1)的核酸樣品，擴增在耐熱的限制性核酸內切酶存在下進行，該酶在熱循環過程中保持活性，挑選引物以使它們向擴增自不包括多態性的核酸或擴增自包括多態性的核酸的核酸中導入由耐熱的限制性核酸內切酶所識別的序列；和(3)分析步驟(2)的產物以檢測多態性的存在與否。2.如權利要求1的方法，其中的引物將耐熱限制性核酸內切酶所識別的序列導入擴增自不包括多態性核酸的核酸中。3.一種檢測個休中遺傳多態性的方法，該方法包括下面的步驟(1)獲取含有個體核酸的樣品；(2)通過包括熱循環和引物的方法擴增步驟(1)的核酸樣品，擴增在同時具有活性的耐熱限制性核酸內切酶存在下進行，限制性核酸內切酶的選擇是使其識別不包括多態性的核酸但不識別包括多態性的核酸或者使其識別包括多態性的核酸但不識別不包括多態性的核酸；和(3)分析步驟(2)的產物以檢測多態性的存在與否。4.如權利要求3的方法，其中的耐熱限制性核酸內切酶識別不包括多態性的核酸。5.如權利要求2或權利要求4的方法，其中該方法進一步包括下面的額外步驟(4)將步驟(2)擴增的核酸與至少一種限制性核酸內切酶反應，此至少一種限制性核酸內切酶的選擇是使其消化包括特定多態性的擴增核酸；和(5)檢測是否在步驟(4)發生消化，消化表明特定多態性的存在。6.如權利要求1-5中任一權利要求的方法，其中包括熱循環的方法為PCR。7.如權利要求1-6中任一權利要求的方法，其中步驟(3)的分析包括檢測步驟(2)擴增核酸的存在與否，該擴增核酸的存在與否表明多態性的存在與否。8.如權利要求1-7中任一權利要求的方法，其中的核酸為DNA。9.如權利要求1-8中任一權利要求的方法，其中的耐熱限制性核酸內切酶選自BstNI、BslI、Tru9I和Tsp509I。10.如權利要求1-9中任一權利要求的方法，其中的遺傳多態性在ras原癌基因K-ras、N-ras和H-ras、或p53腫瘤抑制基因的其中之一中檢測到。11.如權利要求10的方法，其中的遺傳多態性在K-ras的密碼子12中檢測到。12.如權利要求1-9中任一權利要求的方法，其中的遺傳多態性在HIV-I、囊性纖維化轉膜傳導調節子、α-抗胰蛋白酶或β-珠蛋白中檢測到。全文摘要本發明提供了檢測個體中遺傳多態性的方法。在一種形式上該方法包括下面的步驟:(1)獲取含有個體核酸的樣品;(2)通過包括熱循環和引物的方法擴增步驟(1)的核酸樣品,擴增在耐熱限制性核酸內切酶存在下進行,該酶在熱循環過程中保持活性,挑選引物以使它們向擴增自不包括多態性的核酸或擴增自包括多態性的核酸中導入由耐熱限制性核酸內切酶所識別的序列;和(3)分析步驟(2)的產物以檢測多態性的存在與否。文檔編號C12Q1/68GK1185181SQ96194151公開日1998年6月17日申請日期1996年4月12日優先權日1995年4月13日發明者艾利森·韋利安·托德申請人:強生研究有限公司