本發明涉及在至(zhi)少(shao)一(yi)種能(neng)夠(gou)與(yu)單鏈DNA結合(he)(he)的(de)(de)(de)蛋白的(de)(de)(de)存(cun)在下，檢(jian)測樣品中靶核(he)(he)酸(suan)序列的(de)(de)(de)方(fang)法，其中使用(yong)包含(han)熒光團、猝滅(mie)劑(ji)和與(yu)所述(shu)靶核(he)(he)酸(suan)序列互補的(de)(de)(de)區域的(de)(de)(de)寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)探(tan)針(zhen)(zhen)用(yong)于(yu)(yu)(yu)檢(jian)測。所述(shu)寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)序列包含(han)至(zhi)少(shao)20％的(de)(de)(de)RNA核(he)(he)苷酸(suan)、經(jing)修飾的(de)(de)(de)RNA核(he)(he)苷酸(suan)和/或PNA核(he)(he)苷酸(suan)。本發明還涉及適用(yong)于(yu)(yu)(yu)該方(fang)法的(de)(de)(de)寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)探(tan)針(zhen)(zhen)、組合(he)(he)物和試劑(ji)盒，及其用(yong)于(yu)(yu)(yu)診斷病原體(ti)感染的(de)(de)(de)用(yong)途。

背景技術：

已使用(yong)包含熒(ying)光團/猝(cu)滅劑對的(de)DNA探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)來進行靶(ba)核酸(suan)序列的(de)檢測(ce)(ce)。這類(lei)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)在與靶(ba)核酸(suan)結(jie)合(he)時(shi)表現(xian)出(chu)(chu)猝(cu)滅活性(xing)的(de)改(gai)變(bian)，使得能(neng)夠定量檢測(ce)(ce)靶(ba)標(biao)。探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)可用(yong)于實時(shi)監測(ce)(ce)DNA擴增(zeng)，并且(qie)通過在用(yong)于待檢測(ce)(ce)靶(ba)標(biao)的(de)各探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)上(shang)使用(yong)不(bu)同(tong)(tong)的(de)熒(ying)光團/猝(cu)滅劑對，可在同(tong)(tong)一(yi)反應中(zhong)檢測(ce)(ce)不(bu)同(tong)(tong)的(de)靶(ba)標(biao)，因(yin)此(ci)允許多重化。之前的(de)用(yong)于檢測(ce)(ce)DNA擴增(zeng)的(de)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)系(xi)統的(de)實例包括在結(jie)合(he)靶(ba)標(biao)時(shi)表現(xian)出(chu)(chu)構象改(gai)變(bian)的(de)雜交探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(US7241596)、分子信標(biao)(US5925517)、Taqman化學(US6214979)和(he)內切核酸(suan)酶(mei)可切割的(de)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(US7435561和(he)US20050214809)。依賴(lai)于上(shang)游引物(wu)、下游引物(wu)和(he)鏈侵入系(xi)統的(de)等溫DNA擴增(zeng)方法記載于WO 2009/150467中(zhong)。

技術實現要素：

本發(fa)明(ming)(ming)(ming)在(zai)(zai)某種程度(du)上基于對在(zai)(zai)檢測試驗中與(yu)(yu)使用DNA探針(zhen)相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)問題(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)認識(shi)，在(zai)(zai)所述檢測試驗中存在(zai)(zai)能夠(gou)與(yu)(yu)單鏈(lian)DNA結(jie)合的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白。本發(fa)明(ming)(ming)(ming)人(ren)發(fa)現(xian)，在(zai)(zai)能夠(gou)與(yu)(yu)單鏈(lian)DNA結(jie)合的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)存在(zai)(zai)下，DNA探針(zhen)不(bu)能提供特(te)異的(de)(de)(de)(de)(de)、依(yi)賴(lai)模板(ban)的(de)(de)(de)(de)(de)信號(hao)，并且實(shi)際上甚至在(zai)(zai)不(bu)存在(zai)(zai)模板(ban)的(de)(de)(de)(de)(de)情況下產生信號(hao)。這一問題(ti)引導本發(fa)明(ming)(ming)(ming)人(ren)去研究(jiu)在(zai)(zai)能夠(gou)與(yu)(yu)單鏈(lian)DNA結(jie)合的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)背景下可提供可靠(kao)的(de)(de)(de)(de)(de)依(yi)賴(lai)模板(ban)的(de)(de)(de)(de)(de)DNA擴增(zeng)檢測的(de)(de)(de)(de)(de)解決(jue)方案。本發(fa)明(ming)(ming)(ming)人(ren)出乎意(yi)料地發(fa)現(xian)，與(yu)(yu)相(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)完全DNA探針(zhen)相(xiang)比，在(zai)(zai)標記有熒光團和猝滅(mie)劑的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)苷(gan)酸探針(zhen)的(de)(de)(de)(de)(de)序列中摻入RNA核(he)苷(gan)酸、經(jing)修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)RNA核(he)苷(gan)酸和/或(huo)肽核(he)酸(PNA)核(he)苷(gan)酸可抵抗能夠(gou)與(yu)(yu)單鏈(lian)DNA結(jie)合的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白對熒光信號(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)破壞。

本發(fa)明提供(gong)了在至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)一種能夠(gou)與單(dan)鏈(lian)DNA結合的(de)蛋白的(de)存在下檢測樣品中靶核酸(suan)序(xu)列(lie)的(de)方(fang)法，包(bao)(bao)括使所(suo)述樣品與至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)一種包(bao)(bao)含熒光團、猝滅劑(ji)和(he)與所(suo)述靶核酸(suan)序(xu)列(lie)互補的(de)區域的(de)寡核苷(gan)(gan)酸(suan)探針(zhen)接觸，其中所(suo)述寡核苷(gan)(gan)酸(suan)探針(zhen)的(de)序(xu)列(lie)包(bao)(bao)含至(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)20％的(de)RNA核苷(gan)(gan)酸(suan)、經修(xiu)飾的(de)RNA核苷(gan)(gan)酸(suan)和(he)/或PNA核苷(gan)(gan)酸(suan)。

本(ben)發(fa)明(ming)還提(ti)供(gong)了包含(han)熒光團、猝滅(mie)劑和(he)與(yu)靶核酸序(xu)列(lie)互補的(de)區域的(de)寡(gua)(gua)核苷酸探(tan)(tan)針，其(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)所述(shu)寡(gua)(gua)核苷酸探(tan)(tan)針的(de)序(xu)列(lie)包含(han)至少(shao)20％的(de)RNA核苷酸、經(jing)修飾的(de)RNA核苷酸和(he)/或(huo)PNA核苷酸。本(ben)發(fa)明(ming)還提(ti)供(gong)了組合物(wu)和(he)試劑盒，其(qi)均包括(kuo)本(ben)發(fa)明(ming)的(de)寡(gua)(gua)核苷酸探(tan)(tan)針，以及(ji)包含(han)與(yu)所述(shu)靶核酸序(xu)列(lie)互補的(de)區域的(de)鏈侵入寡(gua)(gua)核苷酸和(he)/或(huo)至少(shao)一種能夠與(yu)單鏈DNA結合的(de)蛋白。本(ben)發(fa)明(ming)還提(ti)供(gong)了在受試者中(zhong)(zhong)(zhong)診斷疾病的(de)方法，包括(kuo)在來自受試者的(de)樣品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)實施本(ben)發(fa)明(ming)的(de)檢(jian)測(ce)核酸序(xu)列(lie)的(de)方法以檢(jian)測(ce)與(yu)所述(shu)疾病相關的(de)靶核酸序(xu)列(lie)。

附圖說明

圖1示出了(le)(A)重組酶(mei)、(B)單鏈(lian)DNA結合(he)蛋(dan)白(gp32)、(C)基(ji)(ji)于鏈(lian)侵入的(de)(de)擴增的(de)(de)試(shi)劑(ji)混合(he)物、(D)大腸桿菌(E.coli)重組酶(mei)RecA和(he)(he)(E)單鏈(lian)DNA結合(he)蛋(dan)白ET-SSB對來自包含(han)熒(ying)光團和(he)(he)猝滅(mie)劑(ji)的(de)(de)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)信(xin)號的(de)(de)影響。(A)和(he)(he)(B)的(de)(de)X軸：從(cong)左(zuo)至右(you)——各(ge)(ge)(ge)測(ce)試(shi)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)四種(zhong)(zhong)條件(jian)(僅(jin)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)；探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)與(yu)互(hu)補(bu)模(mo)板；探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)與(yu)蛋(dan)白；探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)與(yu)蛋(dan)白和(he)(he)互(hu)補(bu)模(mo)板)。(C)的(de)(de)X軸：從(cong)左(zuo)至右(you)——各(ge)(ge)(ge)測(ce)試(shi)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)兩(liang)種(zhong)(zhong)條件(jian)(探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)和(he)(he)試(shi)劑(ji)組合(he)物；探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)、試(shi)劑(ji)組合(he)物和(he)(he)互(hu)補(bu)模(mo)板)。(D)和(he)(he)(E)的(de)(de)X軸：從(cong)左(zuo)至右(you)——各(ge)(ge)(ge)測(ce)試(shi)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)兩(liang)種(zhong)(zhong)條件(jian)(僅(jin)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)；探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)與(yu)蛋(dan)白)。測(ce)試(shi)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)為DNA 16(SEQ ID NO：1)、DNA 21(SEQ ID NO：2)、2’-O-甲基(ji)(ji)RNA 16(SEQ ID NO：5)、2’-O-甲基(ji)(ji)RNA 21(SEQ ID NO：6)、2’-氟RNA 16(SEQ ID NO：7)、2’-氟RNA 21(SEQ ID NO：8)、LNA 12(SEQ ID NO：9)、PNA 14(SEQ ID NO：10)、RNA 16(SEQ ID NO：3)和(he)(he)RNA 21(SEQ ID NO：4)。各(ge)(ge)(ge)圖的(de)(de)Y軸：熒(ying)光(任意單位)。

圖(tu)2示出(chu)了通過(guo)基于鏈(lian)侵入(ru)的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)的(de)(de)(de)靶(ba)DNA擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)。A)引物、探(tan)針(zhen)、鏈(lian)侵入(ru)/中間體寡核苷酸(suan)(IO)和靶(ba)DNA的(de)(de)(de)構象。B)通過(guo)使(shi)用SYBR Green實時監測(ce)(ce)(ce)被檢測(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)。C)使(shi)用2’-氟RNA探(tan)針(zhen)SB-2FLUORO(SEQ ID NO：17)實時監測(ce)(ce)(ce)被檢測(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)。D)使(shi)用LNA探(tan)針(zhen)(SB-LNA SEQ ID NO：18)實時監測(ce)(ce)(ce)被檢測(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)。E)使(shi)用天然DNA探(tan)針(zhen)(SB-DNA SEQ ID NO：16)實時監測(ce)(ce)(ce)被檢測(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)。在(zai)B)至E)中，NTC＝無模(mo)板對照，示出(chu)模(mo)板的(de)(de)(de)稀釋度。反(fan)應平行進行兩次。X軸：時間(分(fen)鐘)。各(ge)圖(tu)的(de)(de)(de)Y軸：熒光(任意單位)。

圖(tu)3示出了使(shi)用(yong)包含(han)2’-氟RNA堿基的(de)(de)(de)探(tan)針實時(shi)(shi)監測(ce)擴(kuo)增(zeng)，所(suo)述(shu)包含(han)2’-氟RNA堿基的(de)(de)(de)探(tan)針標(biao)記有允許(xu)檢測(ce)多個(ge)DNA靶(ba)(ba)標(biao)的(de)(de)(de)不(bu)同的(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)團(tuan)和(he)猝滅劑(ji)。(A)通過(guo)使(shi)用(yong)用(yong)于艱難梭茵(Clostridium difficile)靶(ba)(ba)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)Cy5和(he)Iowa Black標(biao)記的(de)(de)(de)探(tan)針(SC-2FLURO，SEQ ID NO：25)和(he)用(yong)于人工靶(ba)(ba)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)ROX和(he)BHQ2標(biao)記的(de)(de)(de)探(tan)針(SB2-FLURO，SEQ ID NO：17)擴(kuo)增(zeng)和(he)檢測(ce)兩種DNA靶(ba)(ba)標(biao)。X軸(zhou)(zhou)：時(shi)(shi)間(jian)(分鐘)。各圖(tu)的(de)(de)(de)Y軸(zhou)(zhou)：熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(任意(yi)單(dan)位(wei))。(B)使(shi)用(yong)Sybr Green I擴(kuo)增(zeng)后(hou)對靶(ba)(ba)標(biao)的(de)(de)(de)熔(rong)解分析。X軸(zhou)(zhou)：溫度(攝氏度)。Y軸(zhou)(zhou)：-(d(熒(ying)光(guang)(guang)(guang))/d(溫度)，任意(yi)單(dan)位(wei))。(C)使(shi)用(yong)2’-氟RNA探(tan)針擴(kuo)增(zeng)后(hou)對靶(ba)(ba)標(biao)的(de)(de)(de)熔(rong)解分析。X軸(zhou)(zhou)和(he)Y軸(zhou)(zhou)如圖(tu)3(B)。

圖4示出了(le)通過添加切割探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)RNase H2引起(qi)的(de)(de)(de)2’-氟RNA探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)信號增(zeng)強。(A)在(zai)存(cun)(cun)在(zai)或不(bu)(bu)存(cun)(cun)在(zai)RNase H2試(shi)劑混合物(wu)(wu)的(de)(de)(de)情(qing)(qing)況(kuang)下(xia)，用(yong)互(hu)(hu)補(bu)(bu)DNA孵育(yu)雙(shuang)標記探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)。X軸：從左至右——各測試(shi)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)四種條件(探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)與(yu)試(shi)劑混合物(wu)(wu)；探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)與(yu)互(hu)(hu)補(bu)(bu)模板(ban)和試(shi)劑混合物(wu)(wu)；探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)與(yu)試(shi)劑混合物(wu)(wu)和RNase H2；探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)與(yu)互(hu)(hu)補(bu)(bu)模板(ban)、試(shi)劑混合物(wu)(wu)和RNase H2)。測試(shi)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)為LNA 12(SEQ ID NO：9)、PNA 14(SEQ ID NO：10)、SB-2’-O-甲基RNA 16(SEQ ID NO：32)、SB-DNA 16(SEQ ID NO：1)和SB-2’-氟RNA 16(SEQ ID NO：17)。各圖的(de)(de)(de)Y軸：熒(ying)光(guang)(任意單位)。(B)使用(yong)2’-氟RNA探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)SC-2FLURO(SEQ ID NO：24)在(zai)存(cun)(cun)在(zai)或不(bu)(bu)存(cun)(cun)在(zai)RNase H2的(de)(de)(de)情(qing)(qing)況(kuang)下(xia)艱(jian)難(nan)梭茵靶序列擴增(zeng)的(de)(de)(de)實時(shi)監(jian)測。X軸：時(shi)間(jian)(分鐘)。Y軸：熒(ying)光(guang)(任意單位)。

圖5示出了用于使用系列稀釋的10⁵至(zhi)10個拷(kao)貝的(de)(de)(de)鼠(shu)傷寒(han)(han)沙門氏茵(Salmonella typhimurium)基因(yin)組DNA檢測(ce)鼠(shu)傷寒(han)(han)沙門氏茵的(de)(de)(de)基于鏈(lian)侵入的(de)(de)(de)擴增試驗(yan)的(de)(de)(de)靈敏度。使用2’-氟RNA探針(zhen)(zhen)實(shi)時(shi)監測(ce)擴增。使用的(de)(de)(de)探針(zhen)(zhen)為SM-2FLURO(SEQ ID NO：30)。X軸(zhou)(zhou)：時(shi)間(分(fen)鐘(zhong))。Y軸(zhou)(zhou)：熒光(任意單位)。NTC＝無模(mo)板對照，示(shi)出了模(mo)板的(de)(de)(de)稀釋(shi)度。

圖(tu)6示出了(le)(A)在(zai)(zai)(zai)不(bu)存在(zai)(zai)(zai)RNase H2的(de)情(qing)(qing)況(kuang)(kuang)下和(he)(B)在(zai)(zai)(zai)存在(zai)(zai)(zai)RNase H2的(de)情(qing)(qing)況(kuang)(kuang)下2’-氟RNA探針既未(wei)擴增(zeng)也未(wei)檢測到不(bu)依賴于引(yin)(yin)物的(de)靶標。示出了(le)各跡線的(de)反應條件。在(zai)(zai)(zai)存在(zai)(zai)(zai)或(huo)(huo)不(bu)存在(zai)(zai)(zai)同源反向(xiang)引(yin)(yin)物(SEQ ID NO：12)或(huo)(huo)假(jia)引(yin)(yin)物SPU(SEQ ID NO：33)的(de)情(qing)(qing)況(kuang)(kuang)下進行反應。通過檢測來自探針SB-2FLURO(SEQ ID NO：17)或(huo)(huo)SYBR Green的(de)ROX熒光團實時監測擴增(zeng)。X軸：時間(分鐘(zhong))。Y軸：熒光(任意單(dan)位)。

圖7示(shi)出了使用雙功能2’-氟(fu)RNA引(yin)物(wu)(wu)(wu)/探(tan)針和天然DNA引(yin)物(wu)(wu)(wu)，通過基于鏈侵入的(de)(de)(de)(de)(de)擴增的(de)(de)(de)(de)(de)靶DNA擴增。(A)正(zheng)向引(yin)物(wu)(wu)(wu)、反向探(tan)針引(yin)物(wu)(wu)(wu)、鏈侵入/中(zhong)間(jian)體寡核苷(gan)酸(IO)和靶DNA的(de)(de)(de)(de)(de)構象(xiang)。B)使用SYBR Green實時(shi)監(jian)測被檢(jian)(jian)測的(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)工(gong)模(mo)板的(de)(de)(de)(de)(de)擴增。所使用的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)為DNA引(yin)物(wu)(wu)(wu)SB-R20(SEQ ID NO：12)、2’-氟(fu)RNA引(yin)物(wu)(wu)(wu)SBFLURO1-RNA(SEQID NO：13)和2’-氟(fu)RNA/DNA引(yin)物(wu)(wu)(wu)SBFLURO2-RNA(SEQ IDNO：14)。C)使用標記有(you)內(nei)部熒光團(FAM)和5’猝滅劑的(de)(de)(de)(de)(de)SB-R20(SEQ ID NO：12)或2’-氟(fu)RNA探(tan)針-引(yin)物(wu)(wu)(wu)(SB-2FLURO 2，SEQ ID NO：19)實時(shi)監(jian)測被檢(jian)(jian)測的(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)工(gong)模(mo)板的(de)(de)(de)(de)(de)擴增。使用SYBR Green檢(jian)(jian)測使用DNA引(yin)物(wu)(wu)(wu)(SEQ ID NO：12)的(de)(de)(de)(de)(de)擴增；經由(you)FAM通道(未添加SYBR Green)檢(jian)(jian)測使用2’-氟(fu)RNA探(tan)針引(yin)物(wu)(wu)(wu)(SEQ ID NO：19)的(de)(de)(de)(de)(de)擴增。NTC＝無模(mo)板對照(zhao)，示(shi)出了模(mo)板的(de)(de)(de)(de)(de)稀釋(shi)度(du)。X軸：時(shi)間(jian)(分鐘)。各圖的(de)(de)(de)(de)(de)Y軸：熒光(任意單位)。

圖(tu)8示出了在不存(cun)在互(hu)補模板(ban)的(de)情況(kuang)下，重組酶(mei)UvsX和(he)單鏈結合蛋(dan)白T4-gp32對具有DNA和(he)RNA堿基(ji)(ji)(DNA/RNA或DNA/2’-氟(fu)RNA或DNA/2’-O-甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)RNA)的(de)雙(shuang)標記嵌合探針(zhen)(zhen)的(de)信號的(de)影(ying)(ying)響。A)UvsX的(de)影(ying)(ying)響。B)T4-gp32的(de)影(ying)(ying)響。C)使用其他系列(lie)探針(zhen)(zhen)的(de)額外(wai)的(de)UvsX測定。D)使用其他系列(lie)探針(zhen)(zhen)的(de)額外(wai)的(de)T4gp32測定。所測試(shi)的(de)探針(zhen)(zhen)為(wei)DNA 21(SEQ ID NO：2)、DNA 16+RNA5(SEQ ID NO：35)、DNA 10+RNA 11(SEQ ID NO：36)、DNA5+RNA16(SEQ ID NO：37)、RNA21(SEQ ID NO：4)、DNA16+2-氟(fu)RNA5(SEQ ID NO：38)、DNA10+2-氟(fu)RNA11(SEQ ID NO：39)、DNA 5+2-氟(fu)RNA 16(SEQ ID NO：40)、2-氟(fu)RNA21(SEQ ID NO：8)、DNA16+2-O-甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)RNA5(SEQ ID NO：41)、DNA10+2-O-甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)RNA11(SEQ ID NO：42)、DNA5+2-O-甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)RNA16(SEQ ID NO：43)、2-O-甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)RNA21(SEQ ID NO：6)、DNA20+RNA1(SEQ ID NO：45)、DNA19+RNA2(SEQ ID NO：46)、DNA18+RNA3(SEQ ID NO：47)、DNA17+RNA4(SEQ ID NO：48)。Y軸：熒(ying)光(guang)增(zeng)加的(de)倍(bei)數(shu)(存(cun)在UvsX或T4-gp32的(de)情況(kuang)下的(de)熒(ying)光(guang)除以不存(cun)在UvsX或T4-gp32的(de)情況(kuang)下的(de)熒(ying)光(guang))，任意單位。

序列描述

SEQ ID NO：1是(shi)DNA探針的(de)核苷酸序列(lie)。

SEQ ID NO：2是(shi)DNA探針的核苷(gan)酸序列。

SEQ ID NO：3是(shi)RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是RNA探針的(de)核(he)苷酸(suan)序列。

SEQ ID NO：5是(shi)2’-O-甲基RNA探針的核苷(gan)酸(suan)序列(lie)。

SEQ ID NO：6是2’-O-甲基RNA探針的(de)核苷酸序(xu)列。

SEQ ID NO：7是2’-氟RNA探針的核苷酸序(xu)列。

SEQ ID NO：8是2’-氟(fu)RNA探針(zhen)的核苷酸(suan)序列。

SEQ ID NO：9是LNA探針的核苷酸(suan)序列。

SEQ ID NO：10是PNA探針的(de)序列。

SEQ ID NO：11是(shi)DNA引物(wu)的(de)核苷(gan)酸序列。

SEQ ID NO：12是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是2’-氟RNA引(yin)物的(de)核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是混合的DNA/2’-氟RNA引(yin)物的核苷(gan)酸(suan)序列。

SEQ ID NO：15是DNA鏈侵入寡核苷酸(suan)的核苷酸(suan)序(xu)列(lie)。

SEQ ID NO：16是DNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17是(shi)2’-氟RNA探針(zhen)的(de)核苷酸序列。

SEQ ID NO：18是(shi)LNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19是混(hun)合(he)的DNA/2’-氟RNA探(tan)針(zhen)/引物的序列(lie)。

SEQ ID NO：20人工DNA靶(ba)核酸序(xu)列(lie)的核苷酸序(xu)列(lie)。

SEQ ID NO：21是DNA引物的核(he)苷酸序列。

SEQ ID NO：22是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23是DNA鏈侵入(ru)寡核(he)苷酸的核(he)苷酸序(xu)列。

SEQ ID NO：24是(shi)2’-氟RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是(shi)2’-氟RNA探針的核苷酸(suan)序(xu)列。

SEQ ID NO：26來自(zi)艱難梭菌(C.difficile)ATCC BAA 1382的靶DNA核(he)苷酸序列。

SEQ ID NO：27是DNA引物的核(he)苷酸序列。

SEQ ID NO：28是DNA引物的核苷(gan)酸序列。

SEQ ID NO：29是DNA鏈侵入寡核苷酸(suan)的核苷酸(suan)序(xu)列。

SEQ ID NO：30是2’-氟RNA探針的核苷酸(suan)序列。

SEQ ID NO：31是來自(zi)鼠傷寒沙門氏茵(S.typhimurium)ATCC 14028的靶DNA核苷酸序(xu)列。

SEQ ID NO：32是(shi)2’-O-甲基RNA探針的核苷(gan)酸序列。

SEQ ID NO：33是(shi)DNA引物的核苷酸(suan)序列。

SEQ ID NO：34是SEQ ID NO 1至8的探(tan)針的互補靶(ba)DNA核苷酸序列(lie)。

SEQ ID NO：35至43表示嵌合(he)的DNA/RNA、DNA/2’-氟(fu)RNA和DNA/2’-O-甲(jia)基(ji)RNA探針的寡核苷(gan)酸序列。

SEQ ID NO：44是SEQ ID NO 9和10的(de)探針的(de)互補靶(ba)DNA核苷酸序列。

SEQ ID NO：45至(zhi)48表(biao)示嵌合的(de)DNA/RNA探針(zhen)的(de)核苷酸序列。

具體實施方式

應理(li)解，所(suo)(suo)公開的(de)方法的(de)不同(tong)應用(yong)可(ke)根據本(ben)領域中的(de)特定需要(yao)進行(xing)調整。還應理(li)解，本(ben)文(wen)(wen)(wen)所(suo)(suo)使用(yong)的(de)術語(yu)僅用(yong)于描述本(ben)發明(ming)(ming)的(de)具體實施方案的(de)目的(de)，并且不意(yi)欲進行(xing)限制。此(ci)外，除非上下文(wen)(wen)(wen)中另有明(ming)(ming)確說明(ming)(ming)，本(ben)說明(ming)(ming)書(shu)和所(suo)(suo)附權利(li)要(yao)求書(shu)中所(suo)(suo)使用(yong)的(de)單數形式(shi)(shi)“一(yi)”、“一(yi)個”和“所(suo)(suo)述”包(bao)括(kuo)復數指代(dai)對象。因(yin)此(ci)，例如，提及“一(yi)個寡(gua)核苷酸(suan)”包(bao)括(kuo)兩個或(huo)(huo)更多個這樣的(de)寡(gua)核苷酸(suan)，等等。本(ben)文(wen)(wen)(wen)所(suo)(suo)引用(yong)的(de)所(suo)(suo)有出版物、專(zhuan)利(li)和專(zhuan)利(li)申請，無論在(zai)上文(wen)(wen)(wen)或(huo)(huo)在(zai)下文(wen)(wen)(wen)，都以(yi)引用(yong)的(de)形式(shi)(shi)全文(wen)(wen)(wen)納入(ru)本(ben)文(wen)(wen)(wen)。

靶核酸序列的檢測方法

樣品

可(ke)使用任何樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)來檢(jian)測(ce)靶核酸序(xu)列，只要(yao)可(ke)從(cong)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)獲得(de)(de)或(huo)(huo)衍(yan)生(sheng)出核酸。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)可(ke)以是例(li)如(ru)環境樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)、參照(zhao)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)或(huo)(huo)臨床(chuang)(chuang)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。當本發明(ming)的方(fang)法(fa)用于(yu)通(tong)過檢(jian)測(ce)靶核酸序(xu)列診斷疾(ji)病(bing)時(shi)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)通(tong)常為(wei)臨床(chuang)(chuang)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)，例(li)如(ru)從(cong)疑(yi)(yi)似患有或(huo)(huo)患有所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)疾(ji)病(bing)的患者中(zhong)獲得(de)(de)的樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。臨床(chuang)(chuang)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)的適合(he)類型(xing)隨著存(cun)(cun)在(zai)于(yu)或(huo)(huo)疑(yi)(yi)似存(cun)(cun)在(zai)于(yu)受(shou)(shou)試者中(zhong)的疾(ji)病(bing)或(huo)(huo)感(gan)染的特定類型(xing)而變化。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)可(ke)以是唾液(ye)、痰、血液(ye)、血漿、血清、尿(niao)或(huo)(huo)糞(fen)便(bian)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)可(ke)以是細胞或(huo)(huo)組織樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。在(zai)優(you)選(xuan)的實施方(fang)案中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)取(qu)自(zi)動物(wu)受(shou)(shou)試者，例(li)如(ru)哺(bu)乳動物(wu)受(shou)(shou)試者。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)通(tong)常取(qu)自(zi)人類受(shou)(shou)試者，但是本發明(ming)通(tong)常也適用于(yu)家(jia)養動物(wu)、牲畜、鳥(niao)類和魚(yu)。例(li)如(ru)，本發明(ming)可(ke)應用于(yu)獸醫(yi)或(huo)(huo)農業環境。在(zai)本發明(ming)檢(jian)測(ce)艱(jian)難梭茵(yin)和鼠傷寒(han)沙(sha)門氏茵(yin)感(gan)染的實施方(fang)案中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)優(you)選(xuan)為(wei)糞(fen)便(bian)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)糞(fen)便(bian)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)可(ke)取(qu)自(zi)患有胃腸道感(gan)染的受(shou)(shou)試者。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)感(gan)染可(ke)存(cun)(cun)在(zai)于(yu)患有腹(fu)瀉的患者中(zhong)。

所(suo)述樣(yang)品(pin)包含(han)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)，其可以(yi)是DNA或(huo)(huo)RNA。如果核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)以(yi)允(yun)許進行本發明的(de)(de)檢(jian)測(ce)的(de)(de)適合形(xing)式存在(zai)于樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)，則(ze)可直接使用(yong)所(suo)述樣(yang)品(pin)。但是，通(tong)常，核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)衍生(sheng)自、獲自或(huo)(huo)提取(qu)自所(suo)述樣(yang)品(pin)。處理含(han)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)樣(yang)品(pin)、提取(qu)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)(huo)純化核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)以(yi)用(yong)于檢(jian)測(ce)方法的(de)(de)方法是本領域中(zhong)(zhong)公知的(de)(de)。可分離(li)總(zong)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)，或(huo)(huo)單獨地分離(li)DNA或(huo)(huo)RNA。

通常(chang)(chang)，以(yi)適當(dang)的(de)(de)方式(shi)處(chu)理(li)樣品(pin)，以(yi)使得以(yi)便于與寡核(he)(he)苷酸(suan)探針和(he)(he)單鏈DNA結合蛋白和(he)(he)任選的(de)(de)其他核(he)(he)酸(suan)組(zu)分接觸的(de)(de)形式(shi)提供核(he)(he)酸(suan)。如(ru)果所述(shu)核(he)(he)酸(suan)是DNA，則(ze)所述(shu)DNA通常(chang)(chang)以(yi)雙鏈形式(shi)提供。如(ru)果所述(shu)核(he)(he)酸(suan)是RNA，則(ze)通常(chang)(chang)使用(yong)逆轉錄(lu)酶或具有(you)逆轉錄(lu)酶活(huo)性的(de)(de)聚合酶將(jiang)其轉換為(wei)cDNA。RNA可用(yong)于細菌(jun)檢(jian)測(ce)，因為(wei)細菌(jun)細胞中(zhong)存在(zai)著非常(chang)(chang)大(da)量的(de)(de)核(he)(he)糖(tang)體，其有(you)效地增加(jia)了靶序(xu)列的(de)(de)濃度(du)。除(chu)了核(he)(he)糖(tang)體RNA(rRNA)外(wai)，其他形式(shi)的(de)(de)RNA，例如(ru)轉移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、小干擾RNA(siRNA)、小核(he)(he)核(he)(he)糖(tang)核(he)(he)酸(suan)(snRNA)、microRNAs(miRNA)也可用(yong)于原核(he)(he)生(sheng)物(wu)和(he)(he)真核(he)(he)生(sheng)物(wu)檢(jian)測(ce)。

靶核酸序列

可檢測任何來源的(de)(de)(de)(de)(de)任何靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)。所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)可以是人(ren)、哺乳動(dong)物(wu)、細菌或(huo)病毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)。所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)可以是基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)區域或(huo)染色體的(de)(de)(de)(de)(de)區域。優選地，所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)對待檢測的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)型(xing)(xing)或(huo)生物(wu)體(例如病原體)是特(te)異性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)。所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)可以是特(te)定(ding)物(wu)種(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)組所(suo)特(te)有的(de)(de)(de)(de)(de)。因(yin)此，用于(yu)檢測特(te)定(ding)物(wu)種(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)通常(chang)區別于(yu)相(xiang)關(guan)物(wu)種(zhong)(zhong)中的(de)(de)(de)(de)(de)任何同源核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)。通常(chang)，所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)包含與相(xiang)關(guan)物(wu)種(zhong)(zhong)中的(de)(de)(de)(de)(de)同源核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)若干錯(cuo)配(pei)。所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)可以是細菌的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)定(ding)菌株(zhu)(zhu)或(huo)病毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)定(ding)血(xue)清型(xing)(xing)、分離(li)株(zhu)(zhu)或(huo)進化枝(clade)所(suo)特(te)有的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)。所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)對艱難梭茵(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)產毒(du)菌株(zhu)(zhu)或(huo)鼠傷寒沙門氏(shi)茵(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)菌株(zhu)(zhu)是特(te)異性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)。

待檢測的靶核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)可以是任何大小并(bing)具有(you)任何序(xu)(xu)列(lie)。所(suo)述靶核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)包(bao)含與(yu)寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)探(tan)針互補(bu)的區域。通常，所(suo)述靶核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)在擴(kuo)增(zeng)的同時被探(tan)針檢測，因(yin)(yin)此(ci)其還(huan)包(bao)含與(yu)引物(wu)(wu)互補(bu)的區域。在等(deng)溫條件(jian)下(xia)通過基于(yu)鏈侵(qin)入的擴(kuo)增(zeng)來擴(kuo)增(zeng)靶核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(或(huo)擴(kuo)增(zeng)子)時，該靶核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)通常具有(you)足夠的長度以提(ti)供對靶基因(yin)(yin)型或(huo)生物(wu)(wu)體的特異檢測，并(bing)且使上游(you)和下(xia)游(you)引物(wu)(wu)與(yu)鏈侵(qin)入寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)以適合的方式(shi)雜(za)交。優選地，如從(cong)所(suo)述上游(you)引物(wu)(wu)的5’結合位點到所(suo)述下(xia)游(you)引物(wu)(wu)的5’結合位點所(suo)測量的，在等(deng)溫條件(jian)下(xia)用于(yu)基于(yu)鏈侵(qin)入的DNA擴(kuo)增(zeng)的擴(kuo)增(zeng)子的長度為至(zhi)少(shao)(shao)45個核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)，更優選長度為至(zhi)少(shao)(shao)50、至(zhi)少(shao)(shao)55或(huo)至(zhi)少(shao)(shao)60個核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)。

用于檢測產毒艱難梭(suo)茵(yin)的(de)(de)適合的(de)(de)靶(ba)核酸序列的(de)(de)實例為SEQ ID NO 26。用于檢測鼠傷(shang)寒沙門氏(shi)茵(yin)的(de)(de)適合的(de)(de)靶(ba)序列的(de)(de)實例為SEQ ID NO 31。

通過提供兩種(zhong)(zhong)或更多(duo)種(zhong)(zhong)各自對不同的(de)靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)具有特異性的(de)寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)探針，可(ke)(ke)在本發(fa)明的(de)方法中(zhong)檢測(ce)多(duo)于一種(zhong)(zhong)靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)。通常，用不同的(de)熒光團/猝(cu)滅劑(ji)對標記與不同靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)結合的(de)寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)探針，因此(ci)允許多(duo)重化(hua)。可(ke)(ke)檢測(ce)至少2、3、4、5、10或更多(duo)種(zhong)(zhong)不同的(de)靶(ba)(ba)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)。可(ke)(ke)檢測(ce)來自同一生物體(ti)的(de)多(duo)于一種(zhong)(zhong)靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)。或者，可(ke)(ke)檢測(ce)對至少2、3、4、5、10或更多(duo)種(zhong)(zhong)不同的(de)基(ji)因型、生物體(ti)或病原體(ti)具有特異性的(de)靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)。

寡核苷酸探針

所(suo)述(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)(zhen)(zhen)包(bao)(bao)含與靶核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)互補(bu)的(de)(de)區域、熒光團(tuan)和(he)(he)猝滅劑。所(suo)述(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)序(xu)列(lie)包(bao)(bao)含至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)20％的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、經修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)/或PNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)。換言之，存在(zai)于所(suo)述(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)(zhen)(zhen)中(zhong)的(de)(de)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)20％的(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)是RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、經修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)/或PNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)。所(suo)述(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)可包(bao)(bao)括RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、經修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)/或PNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)混(hun)合物，例(li)如(ru)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)經修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)混(hun)合物。或者，所(suo)述(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)序(xu)列(lie)可包(bao)(bao)含DNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)20％的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，DNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)20％的(de)(de)經修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，或DNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)20％的(de)(de)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)。

更優選地(di)，所述寡核(he)苷(gan)酸探針的序列(lie)包含至(zhi)少(shao)25％、至(zhi)少(shao)30％、至(zhi)少(shao)35％、至(zhi)少(shao)40％、至(zhi)少(shao)50％、至(zhi)少(shao)60％、至(zhi)少(shao)70％、至(zhi)少(shao)80％或至(zhi)少(shao)90％RNA核(he)苷(gan)酸、經修(xiu)飾(shi)的RNA核(he)苷(gan)酸和(he)/或PNA核(he)苷(gan)酸。

當所(suo)述(shu)(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)的(de)長(chang)度(du)為(wei)12至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)25或(huo)15至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)25個(ge)(ge)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)時，所(suo)述(shu)(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)通(tong)常(chang)包(bao)含至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)5個(ge)(ge)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修飾(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，更(geng)優選(xuan)至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)6個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)7個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)8個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)9個(ge)(ge)或(huo)至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)10個(ge)(ge)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修飾(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。長(chang)度(du)最多達20個(ge)(ge)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(例如長(chang)度(du)為(wei)10至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)20或(huo)12至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)20個(ge)(ge)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan))的(de)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)通(tong)常(chang)包(bao)含至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)4個(ge)(ge)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修飾(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，更(geng)優選(xuan)至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)6個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)7個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)8個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)9個(ge)(ge)或(huo)至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)10個(ge)(ge)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修飾(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。長(chang)度(du)為(wei)20至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)25個(ge)(ge)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)可(ke)包(bao)含至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)12個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)15個(ge)(ge)或(huo)至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)18個(ge)(ge)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修飾(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。長(chang)度(du)為(wei)8至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)12個(ge)(ge)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)可(ke)包(bao)含至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)3個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)4個(ge)(ge)或(huo)至(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)(shao)6個(ge)(ge)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修飾(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。所(suo)述(shu)(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探針(zhen)的(de)序(xu)列包(bao)含足夠的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修飾(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)以在(zai)存(cun)(cun)在(zai)能夠與單(dan)鏈DNA結合的(de)蛋白、不(bu)存(cun)(cun)在(zai)互補模板序(xu)列的(de)情況下阻止來(lai)自探針(zhen)的(de)熒光信(xin)號。

在(zai)特別優選(xuan)的(de)(de)(de)實施方案(an)中(zhong)，所述(shu)(shu)(shu)寡(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針(zhen)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列僅由(you)(you)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(其(qi)可(ke)以是(shi)天然(ran)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或經(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan))組(zu)成(cheng)或僅由(you)(you)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)。所述(shu)(shu)(shu)探(tan)針(zhen)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列可(ke)僅由(you)(you)天然(ran)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)、僅由(you)(you)經(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)或由(you)(you)天然(ran)和經(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)混合物組(zu)成(cheng)。所述(shu)(shu)(shu)寡(gua)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針(zhen)可(ke)具有(you)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)混合主(zhu)鏈或經(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)混合主(zhu)鏈。優選(xuan)的(de)(de)(de)經(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)包括2’-氟核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、2’-O-甲(jia)(jia)基(ji)(ji)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和LNA(鎖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan))核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，及(ji)其(qi)組(zu)合。上述(shu)(shu)(shu)任何百分(fen)含量或最(zui)小數目的(de)(de)(de)經(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)可(ke)尤其(qi)適用于(yu)探(tan)針(zhen)中(zhong)的(de)(de)(de)2’-氟核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、2’-O-甲(jia)(jia)基(ji)(ji)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或LNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)比例(li)。或者，所述(shu)(shu)(shu)探(tan)針(zhen)可(ke)僅由(you)(you)2’-氟核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、2’-O-甲(jia)(jia)基(ji)(ji)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或LNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)。其(qi)他適合的(de)(de)(de)經(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)包括2’-O-甲(jia)(jia)氧基(ji)(ji)-乙基(ji)(ji)和其(qi)他2’-取代(dai)。

在一些實施方案中(zhong)，如果(guo)所(suo)(suo)述(shu)(shu)寡核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針(zhen)包(bao)(bao)含(han)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)20％的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)RNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和/或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，它還可(ke)包(bao)(bao)含(han)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，其可(ke)以是天然(ran)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)經(jing)(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。當(dang)所(suo)(suo)述(shu)(shu)寡核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針(zhen)的(de)長度為25個或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)更少(shao)(shao)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)時，其通常(chang)包(bao)(bao)含(han)少(shao)(shao)于(yu)(yu)20個、更優選少(shao)(shao)于(yu)(yu)18個、少(shao)(shao)于(yu)(yu)15個、少(shao)(shao)于(yu)(yu)12個或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)少(shao)(shao)于(yu)(yu)10個脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)寡核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針(zhen)可(ke)包(bao)(bao)含(han)1至(zhi)(zhi)5、1至(zhi)(zhi)8、1至(zhi)(zhi)10或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)1至(zhi)(zhi)15個脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。當(dang)所(suo)(suo)述(shu)(shu)寡核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針(zhen)包(bao)(bao)含(han)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)經(jing)(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)時，這些脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)可(ke)存(cun)在于(yu)(yu)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)經(jing)(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列的(de)5’和/或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)3’端。所(suo)(suo)述(shu)(shu)寡核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針(zhen)可(ke)在其5’和/或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)3’端例如包(bao)(bao)含(han)1、2、3、4或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)5個脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)經(jing)(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)者，所(suo)(suo)述(shu)(shu)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)(huo)(huo)(huo)(huo)經(jing)(jing)修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)可(ke)散(san)布(bu)在核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列中(zhong)。

所(suo)(suo)述(shu)寡核(he)(he)(he)苷(gan)酸探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)(du)(du)通常為約(yue)(yue)(yue)8至(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)25個(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)酸。所(suo)(suo)述(shu)探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)(du)(du)通常為至(zhi)(zhi)少(shao)8個(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)酸，或(huo)長(chang)度(du)(du)(du)少(shao)于30個(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)酸，更優選(xuan)長(chang)度(du)(du)(du)少(shao)于25個(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)酸。所(suo)(suo)述(shu)探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)(du)(du)可以(yi)(yi)為至(zhi)(zhi)少(shao)10個(ge)、至(zhi)(zhi)少(shao)12個(ge)或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)15個(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)酸。所(suo)(suo)述(shu)探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)(du)(du)可以(yi)(yi)為約(yue)(yue)(yue)10至(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)20、約(yue)(yue)(yue)12至(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)25、約(yue)(yue)(yue)15至(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)25、或(huo)約(yue)(yue)(yue)12至(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)22個(ge)核(he)(he)(he)苷(gan)酸。所(suo)(suo)述(shu)探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)(du)(du)根據(ju)在所(suo)(suo)使用的(de)(de)(de)(de)條件(jian)下(xia)與靶(ba)序列(lie)的(de)(de)(de)(de)區(qu)域特異性(xing)或(huo)選(xuan)擇性(xing)雜交(jiao)的(de)(de)(de)(de)需求(qiu)進行(xing)選(xuan)擇，并(bing)且(qie)可根據(ju)用于擴增靶(ba)序列(lie)的(de)(de)(de)(de)引物的(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)(du)(du)進行(xing)選(xuan)擇，如以(yi)(yi)下(xia)所(suo)(suo)討論(lun)的(de)(de)(de)(de)。

特(te)異性(xing)或選(xuan)擇性(xing)雜交是指當特(te)定核(he)苷酸序(xu)列存在于(yu)樣品(例(li)(li)如(ru)(ru)包括總(zong)的(de)(de)細胞和外源DNA或RNA的(de)(de)復合(he)生物混合(he)物)中的(de)(de)核(he)酸中時(shi)，在給定條件下寡核(he)苷酸(例(li)(li)如(ru)(ru)探針(zhen)或引物)僅與(yu)(yu)該(gai)核(he)苷酸序(xu)列結合(he)。適合(he)的(de)(de)雜交條件是本領域中已(yi)知的(de)(de)。參見，例(li)(li)如(ru)(ru)，Sambrook、Fritsche和Maniatis，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第(di)二版，Cold Spring Harbor Press(1989)，其(qi)(qi)以引用(yong)的(de)(de)方(fang)式(shi)全文納入本文。以下實(shi)施(shi)例(li)(li)中也(ye)提供了適合(he)的(de)(de)雜交條件。如(ru)(ru)技(ji)術人員所已(yi)知的(de)(de)，適合(he)的(de)(de)雜交條件可(ke)(ke)隨(sui)著(zhu)探針(zhen)長度及其(qi)(qi)堿基(ji)組成而改(gai)變。雜交通常在與(yu)(yu)擴增(zeng)溫度相(xiang)同的(de)(de)溫度下進行，因此也(ye)依(yi)賴(lai)用(yong)于(yu)擴增(zeng)的(de)(de)酶(包括依(yi)賴(lai)擴增(zeng)方(fang)法而可(ke)(ke)適用(yong)的(de)(de)聚合(he)酶和重組酶)的(de)(de)活(huo)性(xing)譜。

所(suo)述(shu)(shu)探(tan)針的(de)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列(lie)可部分或(huo)完全與(yu)靶(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列(lie)的(de)區域(yu)互(hu)(hu)補。長(chang)度(du)少(shao)(shao)于25個(ge)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針通(tong)常包(bao)含長(chang)度(du)為(wei)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)10個(ge)、至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)15個(ge)或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)20個(ge)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)區域(yu)，其與(yu)所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列(lie)的(de)區域(yu)互(hu)(hu)補。所(suo)述(shu)(shu)寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針還可在所(suo)述(shu)(shu)互(hu)(hu)補區域(yu)的(de)5’或(huo)3’端(duan)包(bao)含長(chang)度(du)為(wei)1、2、3、4、5、8或(huo)10個(ge)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)側翼(yi)(yi)區，所(suo)述(shu)(shu)側翼(yi)(yi)區不與(yu)所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列(lie)互(hu)(hu)補。所(suo)述(shu)(shu)寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針可在所(suo)述(shu)(shu)互(hu)(hu)補序列(lie)側翼(yi)(yi)的(de)5’和3’端(duan)包(bao)含共(gong)1、2、3、4或(huo)5、8或(huo)10個(ge)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，這些(xie)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)不與(yu)所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列(lie)互(hu)(hu)補。所(suo)述(shu)(shu)側翼(yi)(yi)區可以是(shi)自身互(hu)(hu)補的(de)，產生發夾結構。

所(suo)(suo)(suo)述(shu)寡核(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)探針和(he)所(suo)(suo)(suo)述(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列之間(jian)(jian)可存(cun)在(zai)錯(cuo)配(pei)，然而仍然允(yun)許(xu)特(te)異性檢(jian)測(ce)所(suo)(suo)(suo)述(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列，特(te)別是當使(shi)用對所(suo)(suo)(suo)述(shu)靶(ba)序(xu)(xu)列具有特(te)異性的上游和(he)下游引物擴增所(suo)(suo)(suo)述(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列時。探針的結合(he)與特(te)異性擴增一起將特(te)異性地檢(jian)測(ce)所(suo)(suo)(suo)述(shu)靶(ba)序(xu)(xu)列。在(zai)所(suo)(suo)(suo)述(shu)寡核(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)探針的互補區域和(he)所(suo)(suo)(suo)述(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)(xu)列的相應區域之間(jian)(jian)可存(cun)在(zai)1、2、3、4或5個錯(cuo)配(pei)。在(zai)所(suo)(suo)(suo)述(shu)探針序(xu)(xu)列中的任(ren)何錯(cuo)配(pei)優選間(jian)(jian)隔至(zhi)少4個、至(zhi)少5個、至(zhi)少8個或至(zhi)少10個核(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)。

優選地(di)，所述探(tan)針與(yu)所述靶核酸序列的區域完全互補(bu)。

所(suo)述寡(gua)(gua)核(he)苷酸(suan)探針可具有(you)二(er)(er)級(ji)結構(gou)(gou)區(qu)(qu)(qu)，該二(er)(er)級(ji)結構(gou)(gou)區(qu)(qu)(qu)的(de)(de)(de)構(gou)(gou)象在(zai)與(yu)所(suo)述靶核(he)酸(suan)序列結合時發生改變。因(yin)此(ci)，所(suo)述寡(gua)(gua)核(he)苷酸(suan)探針可包含(han)通(tong)過探針的(de)(de)(de)5’和(he)3’端的(de)(de)(de)自身互補(bu)區(qu)(qu)(qu)域形(xing)成(cheng)的(de)(de)(de)發夾莖(stem)和(he)包含(han)靶序列的(de)(de)(de)互補(bu)區(qu)(qu)(qu)的(de)(de)(de)環形(xing)區(qu)(qu)(qu)域。在(zai)這(zhe)樣的(de)(de)(de)實施方案中，熒光團和(he)猝滅(mie)劑通(tong)常位于(yu)探針的(de)(de)(de)5’和(he)3’端，在(zai)莖區(qu)(qu)(qu)域彼(bi)此(ci)緊密鄰近(jin)，使得(de)在(zai)不存(cun)在(zai)靶核(he)酸(suan)序列時熒光被猝滅(mie)。所(suo)述寡(gua)(gua)核(he)苷酸(suan)探針可以是分子信(xin)標(biao)探針。在(zai)其(qi)他實施方案中，所(suo)述寡(gua)(gua)核(he)苷酸(suan)探針不具有(you)任(ren)何二(er)(er)級(ji)結構(gou)(gou)區(qu)(qu)(qu)或不是分子信(xin)標(biao)探針。

所(suo)述(shu)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)可(ke)同時具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)和引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)功(gong)(gong)能。因(yin)此，所(suo)述(shu)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)可(ke)以(yi)能夠引(yin)(yin)(yin)(yin)發(fa)(fa)其靶(ba)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序列的(de)(de)(de)(de)(de)擴增。作為引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)可(ke)僅(jin)由RNA、經修飾的(de)(de)(de)(de)(de)RNA或(huo)(huo)PNA組成(cheng)。或(huo)(huo)者，作為引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)可(ke)包含1至(zhi)5、1至(zhi)8、1至(zhi)10或(huo)(huo)1至(zhi)15個(ge)脫氧核(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)。作為引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)在(zai)(zai)(zai)其3’端(duan)(duan)可(ke)包含至(zhi)少(shao)1個(ge)脫氧核(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)，更優選在(zai)(zai)(zai)其3’端(duan)(duan)可(ke)包含至(zhi)少(shao)兩個(ge)或(huo)(huo)至(zhi)少(shao)3個(ge)脫氧核(he)(he)(he)(he)糖核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)。所(suo)述(shu)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)可(ke)以(yi)是針(zhen)(zhen)對其靶(ba)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)序列的(de)(de)(de)(de)(de)上游或(huo)(huo)下(xia)游引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)。具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)功(gong)(gong)能的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)游離的(de)(de)(de)(de)(de)3’端(duan)(duan)并且(qie)在(zai)(zai)(zai)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)序列的(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)部(bu)位(wei)置處包含熒光團(tuan)(tuan)和猝滅劑之一或(huo)(huo)兩者。具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)功(gong)(gong)能的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)可(ke)在(zai)(zai)(zai)5’端(duan)(duan)具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)熒光團(tuan)(tuan)并且(qie)在(zai)(zai)(zai)內(nei)部(bu)位(wei)置處具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)猝滅劑，或(huo)(huo)在(zai)(zai)(zai)3’端(duan)(duan)具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)猝滅劑并且(qie)在(zai)(zai)(zai)內(nei)部(bu)位(wei)置處具(ju)(ju)(ju)有(you)(you)熒光團(tuan)(tuan)。本發(fa)(fa)明的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)作為引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)用(yong)途(tu)在(zai)(zai)(zai)下(xia)文中有(you)(you)更詳細的(de)(de)(de)(de)(de)描述(shu)。

可用任何熒光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)和任何猝(cu)(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑標記(ji)所(suo)述寡核(he)苷(gan)酸探(tan)針(zhen)。選擇熒光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)和猝(cu)(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑，以(yi)使(shi)(shi)猝(cu)(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑的吸收光(guang)(guang)譜與(yu)熒光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)的發射光(guang)(guang)譜重疊。還(huan)將進(jin)一(yi)步(bu)選擇熒光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)和猝(cu)(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑并將其在所(suo)述探(tan)針(zhen)中定位，使(shi)(shi)得在與(yu)靶(ba)模(mo)板(ban)雜(za)交時(shi)，由(you)于(yu)猝(cu)(cu)(cu)滅(mie)(mie)效應降低，所(suo)述熒光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)產生的信號增加。

所(suo)述(shu)(shu)(shu)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)可(ke)以(yi)是非熒(ying)光(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，例如(ru)非熒(ying)光(guang)(guang)生色團(tuan)(tuan)(tuan)。所(suo)述(shu)(shu)(shu)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)可(ke)以(yi)是暗猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)。或(huo)(huo)(huo)者，所(suo)述(shu)(shu)(shu)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)可(ke)發出(chu)具有不同于(yu)熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)發射光(guang)(guang)譜的(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)，使得當特異性地(di)(di)監(jian)測(ce)熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)或(huo)(huo)(huo)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)時，任一信號的(de)(de)(de)(de)(de)(de)改變可(ke)報(bao)告與靶模板(ban)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)雜交(jiao)。熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)和(he)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)優(you)選定(ding)位(wei)(wei)于(yu)所(suo)述(shu)(shu)(shu)探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)5’和(he)3’末(mo)(mo)端(duan)(duan)，特別是在(zai)不需要(yao)依賴聚(ju)合(he)酶的(de)(de)(de)(de)(de)(de)探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)延伸(shen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)施方案中。所(suo)述(shu)(shu)(shu)熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)可(ke)位(wei)(wei)于(yu)探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)5’末(mo)(mo)端(duan)(duan)，并(bing)(bing)且(qie)所(suo)述(shu)(shu)(shu)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)位(wei)(wei)于(yu)探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3’末(mo)(mo)端(duan)(duan)。或(huo)(huo)(huo)者，所(suo)述(shu)(shu)(shu)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)可(ke)位(wei)(wei)于(yu)探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)5’末(mo)(mo)端(duan)(duan)，并(bing)(bing)且(qie)所(suo)述(shu)(shu)(shu)熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)位(wei)(wei)于(yu)探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3’末(mo)(mo)端(duan)(duan)。所(suo)述(shu)(shu)(shu)熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)和(he)/或(huo)(huo)(huo)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)也(ye)可(ke)位(wei)(wei)于(yu)探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)部(bu)位(wei)(wei)置，例如(ru)距離探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)5’或(huo)(huo)(huo)3’末(mo)(mo)端(duan)(duan)10個或(huo)(huo)(huo)更少(shao)核(he)苷酸處(chu)。例如(ru)，在(zai)長度少(shao)于(yu)25個核(he)苷酸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)探(tan)(tan)(tan)針中，熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)或(huo)(huo)(huo)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)可(ke)位(wei)(wei)于(yu)距離探(tan)(tan)(tan)針的(de)(de)(de)(de)(de)(de)5’或(huo)(huo)(huo)3’末(mo)(mo)端(duan)(duan)1至(zhi)3、1至(zhi)5、1至(zhi)8或(huo)(huo)(huo)1至(zhi)10個核(he)苷酸處(chu)。優(you)選地(di)(di)，熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)(tuan)(tuan)和(he)猝(cu)(cu)滅(mie)(mie)劑(ji)(ji)中僅(jin)有一個位(wei)(wei)于(yu)內(nei)部(bu)位(wei)(wei)置，所(suo)述(shu)(shu)(shu)對中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)另一個成員(yuan)位(wei)(wei)于(yu)5’或(huo)(huo)(huo)3’末(mo)(mo)端(duan)(duan)。

所述(shu)熒光團(tuan)(tuan)和(he)(he)(he)猝(cu)(cu)(cu)(cu)滅(mie)劑在探(tan)針序(xu)列中(zhong)的(de)(de)位置通常間(jian)(jian)隔至(zhi)少(shao)(shao)8個(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸，更優選間(jian)(jian)隔至(zhi)少(shao)(shao)10個(ge)(ge)(ge)(ge)或至(zhi)少(shao)(shao)12個(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸，這取決于探(tan)針的(de)(de)長(chang)度。當探(tan)針長(chang)度為15至(zhi)25個(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸時(shi)，所述(shu)熒光團(tuan)(tuan)和(he)(he)(he)猝(cu)(cu)(cu)(cu)滅(mie)劑可間(jian)(jian)隔至(zhi)少(shao)(shao)8個(ge)(ge)(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)(shao)10個(ge)(ge)(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)(shao)12個(ge)(ge)(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)(shao)15個(ge)(ge)(ge)(ge)或至(zhi)少(shao)(shao)20個(ge)(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸。所述(shu)熒光團(tuan)(tuan)和(he)(he)(he)猝(cu)(cu)(cu)(cu)滅(mie)劑可位于5’和(he)(he)(he)3’末端，這是探(tan)針中(zhong)可間(jian)(jian)隔的(de)(de)最大距離。選擇熒光團(tuan)(tuan)和(he)(he)(he)猝(cu)(cu)(cu)(cu)滅(mie)劑之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)距離，使得當探(tan)針與靶核(he)酸序(xu)列(處于開放或線性(xing)構(gou)象(xiang))雜交時(shi)由猝(cu)(cu)(cu)(cu)滅(mie)劑導致的(de)(de)熒光團(tuan)(tuan)的(de)(de)猝(cu)(cu)(cu)(cu)滅(mie)減少(shao)(shao)，產生表示存在靶核(he)酸序(xu)列的(de)(de)可檢測信號。熒光團(tuan)(tuan)和(he)(he)(he)猝(cu)(cu)(cu)(cu)滅(mie)劑之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)適合的(de)(de)距離可通過經驗來優化。

所述(shu)熒(ying)光(guang)(guang)團可以(yi)是任(ren)何熒(ying)光(guang)(guang)部分，通常(chang)為(wei)熒(ying)光(guang)(guang)有機染料(liao)。所述(shu)猝(cu)滅(mie)劑可以(yi)是使熒(ying)光(guang)(guang)團的(de)熒(ying)光(guang)(guang)猝(cu)滅(mie)的(de)任(ren)何部分，通常(chang)為(wei)發色分子(zi)，例(li)如有機染料(liao)。技術人員能夠(gou)根據公(gong)知常(chang)識來選擇(ze)適(shi)合寡核苷酸探針的(de)熒(ying)光(guang)(guang)團-猝(cu)滅(mie)劑對。適(shi)合的(de)配對論述(shu)于例(li)如以(yi)下(xia)文(wen)獻中：Marras SE：Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes.In：Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes.Edited by Didenko V，vol.335：Humana Press；2006：3-16；和Didenko VV：DNA probes using fluorescence resonance energy transfer(FRET)：designs and applications.Biotechniques 2001，31(5)：1106-1116，1118，1120-1101。

適合(he)的熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)團包括(kuo)(kuo)但不限于(yu)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)和熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)衍生(sheng)物，例如羧(suo)(suo)(suo)基(ji)(ji)(ji)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)(FAM，包括(kuo)(kuo)6-FAM、5-FAM、dT FAM)，VIC，六氯-6-羧(suo)(suo)(suo)基(ji)(ji)(ji)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)(HEX)和JOE，5-(2′-氨(an)乙基(ji)(ji)(ji))氨(an)基(ji)(ji)(ji)萘(nai)-1-磺酸(EDANS)，香豆素(su)(su)和香豆素(su)(su)衍生(sheng)物例如3-苯(ben)(ben)基(ji)(ji)(ji)-7-異氰酰基(ji)(ji)(ji)香豆素(su)(su)、熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)黃(huang)、NED、德(de)克薩斯紅、四甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)羅(luo)丹(dan)(dan)明(ming)(ming)、羧(suo)(suo)(suo)基(ji)(ji)(ji)四甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)羅(luo)丹(dan)(dan)明(ming)(ming)(TAMRA)、6-羧(suo)(suo)(suo)基(ji)(ji)(ji)-X-羅(luo)丹(dan)(dan)明(ming)(ming)(ROX)、5-羧(suo)(suo)(suo)基(ji)(ji)(ji)羅(luo)丹(dan)(dan)明(ming)(ming)、N-(對-2-苯(ben)(ben)并噁唑(zuo)基(ji)(ji)(ji))苯(ben)(ben)基(ji)(ji)(ji))馬來酰亞(ya)胺(an)，花青染料例如CY5，羅(luo)丹(dan)(dan)明(ming)(ming)染料，噸染料，萘(nai)胺(an)，吖啶類，苯(ben)(ben)并噁二唑(zuo)，芪類和芘類。適合(he)的猝(cu)滅劑(ji)包括(kuo)(kuo)但不限于(yu)DABSYL、4′-(4-二甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)苯(ben)(ben)基(ji)(ji)(ji)偶氮(dan))苯(ben)(ben)甲(jia)(jia)酸(DABCYL)、4-二甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)苯(ben)(ben)基(ji)(ji)(ji)偶氮(dan)苯(ben)(ben)基(ji)(ji)(ji)-4′-馬來酰亞(ya)胺(an)(DABMI)、四甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)羅(luo)丹(dan)(dan)明(ming)(ming)、羧(suo)(suo)(suo)基(ji)(ji)(ji)四甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)羅(luo)丹(dan)(dan)明(ming)(ming)(TAMRA)、黑洞猝(cu)滅劑(ji)1、黑洞猝(cu)滅劑(ji)2、暗猝(cu)滅劑(ji)1、暗猝(cu)滅劑(ji)2、Iowa Black RQ、Iowa Black FQ。

優選的熒光團/猝滅劑配(pei)對包括：

-TAMRA和黑洞猝滅劑2；

-ROX和黑洞猝滅劑(ji)2；

-ROX和DABCYL；

-FAM(例如dT-FAM)和Iowa Black FQ；

-FAM(例如dT-FAM)和DABCYL；

-ROX和Iowa Black FQ；

-CY5和(he)Iowa Black RQ。

熒(ying)光(guang)團(tuan)(tuan)和(he)猝滅劑通常與(yu)探(tan)針共價連接(jie)。所述熒(ying)光(guang)團(tuan)(tuan)和(he)猝滅劑可通過任(ren)何適合(he)的(de)接(jie)頭(tou)與(yu)探(tan)針序列中(zhong)存(cun)在的(de)一(yi)個(ge)或多個(ge)核苷酸連接(jie)。技術人員能夠根據公知常識來選(xuan)擇任(ren)何適合(he)的(de)接(jie)頭(tou)。適合(he)的(de)接(jie)頭(tou)論述于例如(ru)AgrawalS(ed.)：Protocols for Oligonucleotides and Analogs：Synthesis andProperties：Humana Press；1993中(zhong)。

本文提供的(de)特定的(de)寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)探(tan)針(zhen)與產毒艱(jian)難梭(suo)茵和(he)鼠傷(shang)寒沙(sha)(sha)門(men)氏茵中的(de)核(he)(he)酸(suan)(suan)靶序列互(hu)補(bu)。所述探(tan)針(zhen)的(de)優選實例為用于產毒艱(jian)難梭(suo)菌(jun)的(de)SEQID NO 24和(he)25，以及用于鼠傷(shang)寒沙(sha)(sha)門(men)氏茵的(de)SEQ ID NO：30。本發明還提供了SEQ ID NO 3至10、17至19、32、35至43和(he)48的(de)探(tan)針(zhen)和(he)探(tan)針(zhen)-引物。

還提供(gong)了(le)作(zuo)為本發明一(yi)部分的(de)(de)(de)SEQ ID NO 3至(zhi)10、17至(zhi)19、24、25、30、32、35至(zhi)43和(he)(he)48的(de)(de)(de)變體。SEQ ID NO 3至(zhi)10、17至(zhi)19、24、25、30、32、35至(zhi)43和(he)(he)48的(de)(de)(de)變體包(bao)括具有(you)與原始探針(zhen)的(de)(de)(de)序列相(xiang)應的(de)(de)(de)核苷酸序列但是包(bao)含(han)(han)替代熒(ying)光團和(he)(he)/或猝(cu)滅劑(ji)的(de)(de)(de)探針(zhen)。以上變體可包(bao)含(han)(han)來自(zi)本文所(suo)述(shu)的(de)(de)(de)熒(ying)光團和(he)(he)猝(cu)滅劑(ji)的(de)(de)(de)任何適(shi)合的(de)(de)(de)熒(ying)光團-猝(cu)滅劑(ji)對。

SEQ ID NO3至(zhi)(zhi)10、17至(zhi)(zhi)19、24、25、30、32、35至(zhi)(zhi)43和(he)(he)(he)48的(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)體(ti)也可具有與原始探針的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列相(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列，其(qi)(qi)由(you)不同模(mo)式的(de)(de)(de)(de)(de)天(tian)然(ran)(ran)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)、經(jing)(jing)修(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)。例(li)如，SEQ ID NO 24、25和(he)(he)(he)30的(de)(de)(de)(de)(de)原始探針由(you)2’-氟核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)。其(qi)(qi)變(bian)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列可包含(han)(han)(han)天(tian)然(ran)(ran)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)或(huo)僅(jin)(jin)由(you)天(tian)然(ran)(ran)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)。其(qi)(qi)其(qi)(qi)他(ta)變(bian)體(ti)可包含(han)(han)(han)替(ti)(ti)換2’-氟核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)替(ti)(ti)代的(de)(de)(de)(de)(de)經(jing)(jing)修(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)，或(huo)天(tian)然(ran)(ran)和(he)(he)(he)經(jing)(jing)修(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)混(hun)合物。優選的(de)(de)(de)(de)(de)替(ti)(ti)代的(de)(de)(de)(de)(de)經(jing)(jing)修(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)包括2’-O-甲(jia)基核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)和(he)(he)(he)LNA(鎖核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan))核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)。因此，例(li)如，SEQ ID NO 24、25和(he)(he)(he)30的(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)體(ti)可由(you)2’-氟核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)和(he)(he)(he)1至(zhi)(zhi)8、1至(zhi)(zhi)5或(huo)1至(zhi)(zhi)3個天(tian)然(ran)(ran)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)，或(huo)由(you)2’-氟核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)和(he)(he)(he)1至(zhi)(zhi)8、1至(zhi)(zhi)5或(huo)1至(zhi)(zhi)3個2’-O-甲(jia)基核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)。SEQ ID NO 24、25和(he)(he)(he)30的(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)體(ti)可包含(han)(han)(han)至(zhi)(zhi)少20％的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)LNA或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)，或(huo)僅(jin)(jin)由(you)相(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)LNA或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)組(zu)成(cheng)。

變體(ti)(ti)探(tan)針也可(ke)以(yi)是(shi)嵌合探(tan)針，其包含1至10、1至5或(huo)1至3個脫氧核糖核苷(gan)酸(suan)(suan)或(huo)經(jing)修飾的(de)(de)脫氧核糖核苷(gan)酸(suan)(suan)以(yi)替換SEQ ID NO 3至10、17至19、24、25、30、32和35至43的(de)(de)序列中(zhong)相應的(de)(de)核糖核苷(gan)酸(suan)(suan)或(huo)PNA核苷(gan)酸(suan)(suan)。本發明還提(ti)供(gong)了(le)SEQ ID NO：16的(de)(de)DNA探(tan)針的(de)(de)變體(ti)(ti)，其包含至少(shao)20％的(de)(de)RNA核苷(gan)酸(suan)(suan)、經(jing)修飾的(de)(de)RNA核苷(gan)酸(suan)(suan)和/或(huo)PNA核苷(gan)酸(suan)(suan)。

SEQ ID NO 3至(zhi)10、17至(zhi)19、24、25、30、32、35至(zhi)43和48的(de)(de)(de)(de)變(bian)體(ti)(ti)也(ye)可以是(shi)長度(du)小于25個(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)寡核(he)苷酸(suan)(suan)，其(qi)包含與(yu)(yu)相(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)(de)原始(shi)探針(zhen)序(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)8個(ge)(ge)(ge)連(lian)續核(he)苷酸(suan)(suan)部(bu)(bu)分(fen)或完全互(hu)補(bu)(bu)的(de)(de)(de)(de)區(qu)域(yu)。優選地，所述(shu)變(bian)體(ti)(ti)包含與(yu)(yu)相(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)(de)原始(shi)探針(zhen)序(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)9個(ge)(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)10個(ge)(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)12個(ge)(ge)(ge)或至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)14個(ge)(ge)(ge)連(lian)續核(he)苷酸(suan)(suan)部(bu)(bu)分(fen)或完全互(hu)補(bu)(bu)的(de)(de)(de)(de)區(qu)域(yu)。以上變(bian)體(ti)(ti)可包含與(yu)(yu)原始(shi)探針(zhen)序(xu)(xu)列(以及因此與(yu)(yu)靶序(xu)(xu)列)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)應(ying)區(qu)域(yu)具有1、2、3、4或5個(ge)(ge)(ge)錯(cuo)配(置換)的(de)(de)(de)(de)區(qu)域(yu)，因此與(yu)(yu)其(qi)部(bu)(bu)分(fen)互(hu)補(bu)(bu)。因此，例如(ru)，所述(shu)變(bian)體(ti)(ti)可包含長度(du)至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)為12個(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)區(qu)域(yu)，其(qi)與(yu)(yu)原始(shi)探針(zhen)序(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)12個(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)應(ying)區(qu)域(yu)具有1、2或3個(ge)(ge)(ge)錯(cuo)配。任何錯(cuo)配優選間隔至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)4個(ge)(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)5個(ge)(ge)(ge)或至(zhi)少(shao)(shao)(shao)(shao)8個(ge)(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)(suan)。

SEQ ID NO 3至(zhi)(zhi)10、17至(zhi)(zhi)19、24、25、30和32的(de)變體也可(ke)以是長(chang)度(du)小于(yu)25個(ge)核(he)苷酸(suan)的(de)寡(gua)核(he)苷酸(suan)，其與相應(ying)的(de)原始探針序(xu)列具有至(zhi)(zhi)少(shao)70％的(de)序(xu)列同一性，優選至(zhi)(zhi)少(shao)75％、至(zhi)(zhi)少(shao)80％，更優選至(zhi)(zhi)少(shao)85％、至(zhi)(zhi)少(shao)90％或至(zhi)(zhi)少(shao)95％的(de)序(xu)列同一性。

以上(shang)變體(ti)探針可(ke)包(bao)含(han)與(yu)原(yuan)始(shi)探針部(bu)分或完全互補的(de)(de)區(qu)(qu)域的(de)(de)5’和/或3’側翼區(qu)(qu)。所述5’和/或3’側翼區(qu)(qu)可(ke)包(bao)含(han)與(yu)靶核(he)酸序列(lie)(lie)不互補的(de)(de)序列(lie)(lie)，或與(yu)靶核(he)苷酸序列(lie)(lie)中(zhong)位于(yu)原(yuan)始(shi)探針結合(he)區(qu)(qu)的(de)(de)側翼的(de)(de)區(qu)(qu)域互補的(de)(de)序列(lie)(lie)。例如，在SEQ ID NO 24、25和30的(de)(de)變體(ti)中(zhong)，5’側翼區(qu)(qu)可(ke)包(bao)含(han)長度為1-10或1-5個(ge)核(he)苷酸的(de)(de)序列(lie)(lie)，其與(yu)SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：31的(de)(de)相關靶核(he)酸序列(lie)(lie)中(zhong)的(de)(de)探針結合(he)區(qu)(qu)5’端的(de)(de)1-10或1-5個(ge)核(he)苷酸互補。

信號的檢測

可(ke)通(tong)(tong)過任何(he)適合的檢(jian)(jian)測熒光(guang)的方法進行來自(zi)探針(zhen)(zhen)(zhen)的信(xin)(xin)號的檢(jian)(jian)測。所述(shu)探針(zhen)(zhen)(zhen)可(ke)用(yong)于(yu)檢(jian)(jian)測靶(ba)核(he)酸序列，之(zhi)前不(bu)用(yong)進行任何(he)DNA擴(kuo)(kuo)增(zeng)。更通(tong)(tong)常地，所述(shu)探針(zhen)(zhen)(zhen)可(ke)用(yong)于(yu)在(zai)靶(ba)核(he)酸序列擴(kuo)(kuo)增(zeng)之(zhi)后或擴(kuo)(kuo)增(zeng)過程中(zhong)檢(jian)(jian)測靶(ba)核(he)酸序列。優選地，在(zai)擴(kuo)(kuo)增(zeng)所述(shu)靶(ba)核(he)酸序列的同時實時監(jian)測來自(zi)探針(zhen)(zhen)(zhen)的信(xin)(xin)號。

可(ke)檢測來自針(zhen)對單(dan)一(yi)靶序列(lie)的一(yi)個(ge)探針(zhen)的單(dan)一(yi)信(xin)(xin)號。或(huo)(huo)者，可(ke)使(shi)用檢測不(bu)(bu)同(tong)(tong)的靶序列(lie)的探針(zhen)，其中在不(bu)(bu)同(tong)(tong)的熒光波長(chang)處的各信(xin)(xin)號提供多(duo)重(zhong)檢測。可(ke)使(shi)用兩(liang)種或(huo)(huo)更多(duo)種(例如，3、4、5、6、8、10或(huo)(huo)更多(duo)種)不(bu)(bu)同(tong)(tong)的探針(zhen)用于在單(dan)一(yi)反應(ying)中多(duo)重(zhong)檢測若干(gan)不(bu)(bu)同(tong)(tong)的靶序列(lie)。

也可同時使(shi)用(yong)嵌入(ru)有擴增(zeng)的DNA的染(ran)料以及寡核苷酸探(tan)針以檢測DNA擴增(zeng)，所述染(ran)料例(li)如SYBR綠和噻唑(zuo)橙。

也可同時使用(yong)針(zhen)對相同或替代靶序列的DNA寡(gua)核苷酸(suan)探(tan)針(zhen)以(yi)及(ji)寡(gua)核苷酸(suan)探(tan)針(zhen)。

本發(fa)明也(ye)提供(gong)了(le)增強(qiang)來自探(tan)針的(de)(de)(de)信(xin)號的(de)(de)(de)方法(fa)。可使待進(jin)行(xing)靶核(he)酸序(xu)列檢測的(de)(de)(de)樣品與RNase H酶(例如RNase H2)接觸。優(you)選的(de)(de)(de)RNase H2酶是Thermococcus gammatolerans RNase H2。如由本發(fa)明人(ren)所表明的(de)(de)(de)，RNase H酶能夠增強(qiang)來自探(tan)針的(de)(de)(de)信(xin)號。認為RNase H酶切割寡(gua)核(he)苷酸探(tan)針與靶核(he)酸序(xu)列雜交(jiao)時(shi)形(xing)成的(de)(de)(de)雙(shuang)鏈體，從而使猝(cu)滅減少。

更通常地(di)，可使樣品(pin)與任何能夠特異性(xing)地(di)降(jiang)解寡(gua)核苷(gan)酸(suan)探針/靶核酸(suan)序(xu)列雙鏈(lian)體(ti)的核酸(suan)酶(mei)接觸。

靶核酸序列的擴增

當本(ben)發明(ming)的(de)(de)(de)(de)方法(fa)包(bao)括靶核酸(suan)序列的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)時(shi)，可使用任何適合(he)(he)(he)的(de)(de)(de)(de)DNA擴(kuo)增(zeng)方法(fa)。通(tong)常，在(zai)等溫條件下進行DNA擴(kuo)增(zeng)。所述(shu)DNA擴(kuo)增(zeng)方法(fa)可包(bao)括基(ji)于鏈(lian)(lian)侵(qin)(qin)入的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)、滾(gun)環擴(kuo)增(zeng)(RCA)、鏈(lian)(lian)置(zhi)換擴(kuo)增(zeng)(SDA)、重組酶(mei)聚合(he)(he)(he)酶(mei)擴(kuo)增(zeng)(RPA)。優選基(ji)于鏈(lian)(lian)侵(qin)(qin)入的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(SIBA)。以(yi)上擴(kuo)增(zeng)方法(fa)通(tong)常要求存在(zai)能夠結合(he)(he)(he)單鏈(lian)(lian)DNA的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白，因此本(ben)發明(ming)的(de)(de)(de)(de)寡核苷酸(suan)探針(zhen)便利地允許檢(jian)測所述(shu)方法(fa)中的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)。

因此，本(ben)發明(ming)提(ti)供了在至少一(yi)種(zhong)能夠與單鏈DNA結合的(de)蛋白的(de)存在下檢測樣(yang)品(pin)中靶核酸序(xu)列(lie)的(de)擴增的(de)方法(fa)，包括在促進(jin)所(suo)述靶核酸序(xu)列(lie)擴增的(de)條件(jian)下使所(suo)述樣(yang)品(pin)與本(ben)發明(ming)的(de)寡(gua)核苷酸探針接(jie)觸。

所述條(tiao)(tiao)件通常包括存在一種或(huo)多種引物和DNA聚(ju)合(he)酶。技術人員能(neng)夠根據待使用(yong)(yong)的(de)DNA聚(ju)合(he)酶的(de)類型選擇適用(yong)(yong)于特定靶(ba)序列的(de)引物。當所述DNA聚(ju)合(he)酶是RCA酶(例如phi29)時，可使用(yong)(yong)擴增(zeng)靶(ba)核(he)酸序列的(de)隨機(ji)引物或(huo)單一種類(species)的(de)引物。更通常地(di)，所述擴增(zeng)條(tiao)(tiao)件包括存在針對靶(ba)核(he)酸序列的(de)上游引物和下(xia)游引物。

如以(yi)上(shang)(shang)所討論的，所述(shu)寡(gua)(gua)核(he)苷酸探針(zhen)(zhen)可(ke)提供引(yin)(yin)(yin)物(wu)功能(neng)，因此擴增條件可(ke)包括存(cun)在作(zuo)為(wei)下(xia)游引(yin)(yin)(yin)物(wu)的寡(gua)(gua)核(he)苷酸探針(zhen)(zhen)和(he)單(dan)(dan)獨的上(shang)(shang)游引(yin)(yin)(yin)物(wu)(以(yi)及任選的無其(qi)他下(xia)游引(yin)(yin)(yin)物(wu))，或(huo)存(cun)在作(zuo)為(wei)上(shang)(shang)游引(yin)(yin)(yin)物(wu)的寡(gua)(gua)核(he)苷酸探針(zhen)(zhen)和(he)單(dan)(dan)獨的下(xia)游引(yin)(yin)(yin)物(wu)(以(yi)及任選的無其(qi)他上(shang)(shang)游引(yin)(yin)(yin)物(wu))。

當使(shi)用(yong)SIBA時(shi)，所述條件(jian)通常(chang)還包括存在(zai)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)(he)苷酸(suan)。SIBA擴增的(de)優選的(de)引(yin)物和鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)(he)苷酸(suan)的(de)特征在(zai)下文中更詳細地描述。

用(yong)于擴(kuo)增靶核(he)酸序列的(de)適(shi)合(he)的(de)條(tiao)件(jian)(jian)(jian)還包括本領域已(yi)知的(de)用(yong)于提(ti)供聚(ju)合(he)酶(mei)(mei)活性(xing)(xing)的(de)任(ren)何條(tiao)件(jian)(jian)(jian)。所(suo)述條(tiao)件(jian)(jian)(jian)通(tong)常包括存在全部四種(zhong)dNTP——dATP、dTTP、dCTP和(he)dGTP或其類似物，適(shi)合(he)的(de)緩沖劑(ji)(ji)(ji)/pH，以及(ji)酶(mei)(mei)性(xing)(xing)能或穩定性(xing)(xing)所(suo)需(xu)的(de)其他(ta)(ta)因素。所(suo)述條(tiao)件(jian)(jian)(jian)可(ke)包括存在洗滌劑(ji)(ji)(ji)和(he)穩定劑(ji)(ji)(ji)。所(suo)使用(yong)的(de)溫(wen)度通(tong)常是等(deng)溫(wen)，即在整(zheng)個(ge)擴(kuo)增過程中是恒定的(de)。所(suo)使用(yong)的(de)溫(wen)度通(tong)常取決于聚(ju)合(he)酶(mei)(mei)和(he)其他(ta)(ta)酶(mei)(mei)組(zu)分的(de)性(xing)(xing)質，也反映(ying)引物和(he)鏈侵(qin)入寡核(he)苷酸所(suo)需(xu)的(de)雜交溫(wen)度。

所使用(yong)的聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)(he)(he)酶通常具有鏈(lian)置換(huan)活性。本文(wen)使用(yong)術語“鏈(lian)置換(huan)”來描述DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)(he)(he)酶(任選地與(yu)輔助蛋(dan)白聯合(he)(he)(he))在DNA合(he)(he)(he)成過程中(zhong)在遇(yu)到雙鏈(lian)DNA區域時置換(huan)互補(bu)鏈(lian)的能(neng)力。適(shi)合(he)(he)(he)的DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)(he)(he)酶包(bao)括(kuo)來自大腸桿(gan)菌(E.coli)、枯草芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(B.subtilis)或嗜熱脂肪芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(B.stearothermophilus)的polI及其功(gong)能(neng)性片(pian)(pian)段(duan)或變(bian)體(ti)，以(yi)及T4和T7DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)(he)(he)酶及其功(gong)能(neng)性片(pian)(pian)段(duan)或變(bian)體(ti)。優選的聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)(he)(he)酶為(wei)Bsu DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)(he)(he)酶或其功(gong)能(neng)性片(pian)(pian)段(duan)或變(bian)體(ti)。

所(suo)(suo)述(shu)(shu)擴(kuo)增條件包括存在能(neng)(neng)(neng)夠結(jie)(jie)(jie)合單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)蛋白(bai)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)能(neng)(neng)(neng)夠結(jie)(jie)(jie)合單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)蛋白(bai)可(ke)(ke)以(yi)是(shi)在不存在互補模板的(de)(de)情況下引起標記有熒(ying)光團和猝滅劑(ji)的(de)(de)寡核苷(gan)酸探(tan)針的(de)(de)熒(ying)光信(xin)號改變并(bing)且能(neng)(neng)(neng)夠結(jie)(jie)(jie)合于單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)任何(he)(he)蛋白(bai)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)蛋白(bai)可(ke)(ke)以(yi)是(shi)任何(he)(he)單(dan)鏈(lian)結(jie)(jie)(jie)合蛋白(bai)(SSB)或(huo)任何(he)(he)能(neng)(neng)(neng)夠結(jie)(jie)(jie)合單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)蛋白(bai)，并(bing)且也具有另一(yi)種功能(neng)(neng)(neng)活(huo)性。所(suo)(suo)述(shu)(shu)能(neng)(neng)(neng)夠結(jie)(jie)(jie)合單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)蛋白(bai)可(ke)(ke)以(yi)是(shi)重組(zu)酶(mei)或(huo)重組(zu)酶(mei)輔(fu)助蛋白(bai)或(huo)輔(fu)因子(zi)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)能(neng)(neng)(neng)夠結(jie)(jie)(jie)合單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)蛋白(bai)可(ke)(ke)以(yi)是(shi)嗜溫的(de)(de)或(huo)嗜熱的(de)(de)。

所(suo)(suo)(suo)述(shu)擴增(zeng)條件優(you)選(xuan)(xuan)包括(kuo)存在(zai)重(zhong)組(zu)酶(mei)。任(ren)何重(zhong)組(zu)酶(mei)系統(tong)可(ke)用(yong)(yong)于本發明的(de)方(fang)法中。所(suo)(suo)(suo)述(shu)重(zhong)組(zu)酶(mei)系統(tong)可(ke)以(yi)是(shi)原核(he)生物(wu)(wu)來源或真核(he)生物(wu)(wu)來源的(de)，并且可(ke)以(yi)是(shi)細菌、酵(jiao)母、噬(shi)(shi)菌體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)或哺乳動(dong)物(wu)(wu)來源的(de)。所(suo)(suo)(suo)述(shu)重(zhong)組(zu)酶(mei)可(ke)以(yi)5’-3’方(fang)向或3’-5’方(fang)向聚合到單鏈寡核(he)苷酸上。所(suo)(suo)(suo)述(shu)重(zhong)組(zu)酶(mei)可(ke)獲(huo)自肌病毒(du)科(myoviridae)噬(shi)(shi)菌體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40，不動(dong)桿菌屬(shu)(Acinetobacter)噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)133，氣單胞茵(yin)(yin)(yin)屬(shu)(Aeromonas)噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)65，噬(shi)(shi)藍藻(zao)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(cyanophage)P-SSM2，噬(shi)(shi)藍藻(zao)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)PSSM4，噬(shi)(shi)藍藻(zao)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)S-PM2、Rbl4、Rb32，氣單胞茵(yin)(yin)(yin)屬(shu)噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)25，弧茵(yin)(yin)(yin)屬(shu)(Vibrio)噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)nt-1、phi-1、Rbl6、Rb43，噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)31，噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)44RR2.8t，Rb49，噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)Rb3或噬(shi)(shi)茵(yin)(yin)(yin)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)LZ2。在(zai)一(yi)個優(you)選(xuan)(xuan)的(de)實施(shi)方(fang)案中，使(shi)用(yong)(yong)T4重(zhong)組(zu)酶(mei)UvsX(登(deng)錄號(hao)：P04529)或其(qi)功能變體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)或片段。也可(ke)使(shi)用(yong)(yong)真核(he)生物(wu)(wu)的(de)Rad系統(tong)或大腸(chang)桿菌的(de)recA-Reco系統(tong)或其(qi)他原核(he)生物(wu)(wu)系統(tong)。所(suo)(suo)(suo)述(shu)重(zhong)組(zu)酶(mei)可(ke)以(yi)是(shi)大腸(chang)桿菌RecA。

所述(shu)(shu)條件還可包括(kuo)存(cun)在重(zhong)組(zu)酶(mei)(mei)輔(fu)助蛋(dan)白，例如(ru)(ru)(ru)單鏈(lian)結(jie)合蛋(dan)白(例如(ru)(ru)(ru)，T4gp32，登錄號P03695)和(he)重(zhong)組(zu)酶(mei)(mei)載劑(loading agent)(例如(ru)(ru)(ru)，UvsY，登錄號NP_049799.2)。在一個優選的實施(shi)方案中，所述(shu)(shu)條件包括(kuo)存(cun)在T4gp32、UvsX和(he)UvsY蛋(dan)白。所述(shu)(shu)重(zhong)組(zu)酶(mei)(mei)(例如(ru)(ru)(ru)UvsX)，以(yi)及(如(ru)(ru)(ru)果使用的話)重(zhong)組(zu)酶(mei)(mei)載劑(例如(ru)(ru)(ru)UvsY)和(he)單鏈(lian)DNA結(jie)合蛋(dan)白(例如(ru)(ru)(ru)gp32)，均可來(lai)自相同或不同的肌病毒(du)科(ke)噬茵體來(lai)源的天然(ran)、雜合或突變(bian)蛋(dan)白。天然(ran)蛋(dan)白可以(yi)是蛋(dan)白的野(ye)生(sheng)型或天然(ran)變(bian)體。

或者，能夠結(jie)合(he)(he)單(dan)(dan)鏈(lian)DNA的蛋(dan)白(bai)可以(yi)是用于在DNA擴(kuo)(kuo)增方法中提供單(dan)(dan)鏈(lian)結(jie)合(he)(he)活性的任何(he)蛋(dan)白(bai)。所述擴(kuo)(kuo)增方法可以(yi)是PCR。所述能夠結(jie)合(he)(he)單(dan)(dan)鏈(lian)DNA的蛋(dan)白(bai)可以(yi)是極高熱穩(wen)定性單(dan)(dan)鏈(lian)DNA結(jie)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)(ET-SSB)，其可獲自新英格蘭Biolabs。

所述條(tiao)件還可包(bao)括(kuo)用(yong)于增強(qiang)(qiang)重組酶(mei)效率(lv)的其他因子，例如用(yong)于調控DNA相互作(zuo)用(yong)的化合物，例如，脯氨酸(suan)、DMSO或已(yi)知增強(qiang)(qiang)重組酶(mei)加載到DNA上(shang)的擁擠(ji)試劑(crowding agent)(Lavery P.et al.J.Biol.Chem.1992，267，(13)，9307-9314)。

所述條(tiao)件也可(ke)(ke)包(bao)括(kuo)(kuo)存在ATP再生(sheng)系統(tong)。多(duo)種ATP再生(sheng)系統(tong)是本領域(yu)技(ji)術人員已(yi)知的，包(bao)括(kuo)(kuo)糖(tang)酵解酶(mei)。ATP再生(sheng)系統(tong)的適合組分可(ke)(ke)包(bao)括(kuo)(kuo)磷(lin)酸(suan)(suan)肌(ji)酸(suan)(suan)、肌(ji)酸(suan)(suan)激(ji)酶(mei)、肌(ji)激(ji)酶(mei)、焦(jiao)磷(lin)酸(suan)(suan)酶(mei)、蔗糖(tang)和蔗糖(tang)磷(lin)酸(suan)(suan)化(hua)酶(mei)中的一(yi)種或(huo)多(duo)種。所述條(tiao)件可(ke)(ke)還(huan)包(bao)括(kuo)(kuo)存在ATP。

也可包括其他組分，例如鎂離子(zi)、DTT或其他還原劑、鹽類、BSA/PEG或其他擁(yong)擠試劑。

可(ke)以(yi)不同(tong)的(de)濃(nong)度(du)提(ti)供上(shang)述各種(zhong)組分(fen)以(yi)進行DNA擴增。技術人員(yuan)能夠在實(shi)踐中(zhong)選擇(ze)所述各種(zhong)組分(fen)的(de)適合的(de)工作濃(nong)度(du)。當(dang)寡(gua)核(he)苷酸(suan)探(tan)(tan)針(zhen)與上(shang)游(you)或下游(you)引物(wu)的(de)序列重疊時，通過(guo)使(shi)用更(geng)低濃(nong)度(du)的(de)探(tan)(tan)針(zhen)或重疊區減小的(de)探(tan)(tan)針(zhen)(例如，從3’端比較，長度(du)比反(fan)向引物(wu)更(geng)短的(de)探(tan)(tan)針(zhen))可(ke)使(shi)在引物(wu)的(de)結合和探(tan)(tan)針(zhen)的(de)結合之間觀察到的(de)任何競爭最小化(hua)。

基(ji)于鏈侵入的擴增(SIBA)

用于(yu)擴(kuo)增靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)列的(de)(de)優選方(fang)法(fa)SIBA的(de)(de)特征(zheng)在下(xia)(xia)文中討(tao)論。本發明提(ti)(ti)供了(le)在至(zhi)少一種(zhong)能夠與單(dan)(dan)鏈(lian)DNA結(jie)(jie)合的(de)(de)蛋白的(de)(de)存在下(xia)(xia)檢測樣(yang)品中靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)列的(de)(de)擴(kuo)增的(de)(de)方(fang)法(fa)，包括(kuo)在促進所(suo)(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)列擴(kuo)增的(de)(de)條件下(xia)(xia)使所(suo)(suo)述(shu)(shu)樣(yang)品與至(zhi)少一種(zhong)本發明的(de)(de)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探針(zhen)、至(zhi)少一種(zhong)上(shang)游(you)(you)(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)、至(zhi)少一種(zhong)下(xia)(xia)游(you)(you)(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)和(he)(he)至(zhi)少一種(zhong)鏈(lian)侵(qin)入(ru)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)接觸(chu)。如以(yi)上(shang)所(suo)(suo)討(tao)論的(de)(de)，所(suo)(suo)述(shu)(shu)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探針(zhen)自(zi)身可作為上(shang)游(you)(you)(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)或下(xia)(xia)游(you)(you)(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)，或者提(ti)(ti)供單(dan)(dan)獨的(de)(de)上(shang)游(you)(you)(you)和(he)(he)下(xia)(xia)游(you)(you)(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)以(yi)及寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探針(zhen)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)引(yin)(yin)(yin)物(wu)、所(suo)(suo)述(shu)(shu)探針(zhen)和(he)(he)所(suo)(suo)述(shu)(shu)鏈(lian)侵(qin)入(ru)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)均包含與所(suo)(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)列互補(bu)的(de)(de)區域。所(suo)(suo)述(shu)(shu)鏈(lian)侵(qin)入(ru)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)使至(zhi)少一部分靶(ba)核(he)(he)(he)酸(suan)序(xu)列成為單(dan)(dan)鏈(lian)以(yi)允許(xu)結(jie)(jie)合各所(suo)(suo)述(shu)(shu)引(yin)(yin)(yin)物(wu)和(he)(he)所(suo)(suo)述(shu)(shu)探針(zhen)。

針對SIBA的引物

根據目的(de)(de)靶核(he)酸序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)，以(yi)及考慮鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸的(de)(de)結(jie)合位點，選擇(ze)適(shi)合的(de)(de)上(shang)游(you)和(he)(he)(he)下(xia)游(you)引(yin)(yin)物，所(suo)(suo)述(shu)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸使(shi)至(zhi)(zhi)少一部(bu)(bu)分靶核(he)酸序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)成(cheng)為(wei)單鏈(lian)以(yi)允(yun)許結(jie)合上(shang)游(you)引(yin)(yin)物和(he)(he)(he)下(xia)游(you)引(yin)(yin)物。所(suo)(suo)述(shu)上(shang)游(you)和(he)(he)(he)下(xia)游(you)引(yin)(yin)物包含與靶序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)部(bu)(bu)分或完(wan)全(quan)互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)，以(yi)及任(ren)選的(de)(de)5’和(he)(he)(he)/或3’側(ce)翼非互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)。或者(zhe)，所(suo)(suo)述(shu)上(shang)游(you)和(he)(he)(he)下(xia)游(you)引(yin)(yin)物可(ke)全(quan)部(bu)(bu)由與靶序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)部(bu)(bu)分或完(wan)全(quan)互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)組成(cheng)。與所(suo)(suo)述(shu)靶序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)的(de)(de)引(yin)(yin)物序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)長(chang)度足以(yi)提(ti)供與所(suo)(suo)述(shu)靶核(he)酸序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)特異性雜交(jiao)。互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)長(chang)度通常為(wei)至(zhi)(zhi)少10個核(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸，更優選至(zhi)(zhi)少15、至(zhi)(zhi)少16或至(zhi)(zhi)少17個核(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸。互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)長(chang)度可(ke)以(yi)為(wei)10-25、15-25、10-30或15-30個核(he)苷(gan)(gan)(gan)(gan)酸。

應理(li)解(jie)，以上(shang)序(xu)列(lie)(lie)長度是(shi)指部分(fen)(fen)或完全(quan)與靶核(he)酸序(xu)列(lie)(lie)互補(bu)的引(yin)物(wu)的部分(fen)(fen)。在特(te)定的位置可存在引(yin)物(wu)和靶序(xu)列(lie)(lie)之(zhi)間(jian)的錯配，而(er)仍允(yun)許(xu)靶序(xu)列(lie)(lie)的特(te)異性擴增(zeng)和檢測，特(te)別是(shi)考慮到為實現(xian)擴增(zeng)而(er)組合使用上(shang)游和下(xia)游引(yin)物(wu)以及鏈侵(qin)入寡核(he)苷酸的情況。在引(yin)物(wu)的互補(bu)區(qu)(qu)域(yu)和靶序(xu)列(lie)(lie)的對應區(qu)(qu)域(yu)之(zhi)間(jian)可存在1、2、3、4或5個(ge)錯配。

通常上游和下(xia)游引物的(de)(de)總長(chang)(chang)度少于30個(ge)(ge)核苷(gan)酸，更優選長(chang)(chang)度少于25個(ge)(ge)核苷(gan)酸，例如長(chang)(chang)度為(wei)15至(zhi)25或(huo)15至(zhi)23個(ge)(ge)核苷(gan)酸。當重組酶用(yong)(yong)于鏈(lian)侵(qin)入時，特別優選使用(yong)(yong)長(chang)(chang)度少于30個(ge)(ge)核苷(gan)酸的(de)(de)引物。這樣的(de)(de)引物不能作為(wei)重組酶的(de)(de)底(di)物。

所述(shu)上(shang)游(或正(zheng)向)引物在靠近(jin)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)侵(qin)入寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)的5’結合(he)(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)或與該(gai)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)侵(qin)入寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)的5’結合(he)(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)重疊(die)的位(wei)(wei)(wei)(wei)置結合(he)(he)于雙(shuang)(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)體(ti)靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列中的一條鏈(lian)(lian)(lian)(lian)的5’區。所述(shu)下游(或反向)引物在靠近(jin)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)侵(qin)入寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)的3’結合(he)(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)或與該(gai)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)侵(qin)入寡(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)的3’結合(he)(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)重疊(die)的位(wei)(wei)(wei)(wei)置結合(he)(he)于雙(shuang)(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)體(ti)靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列中的相對鏈(lian)(lian)(lian)(lian)的5’區。所述(shu)上(shang)游和(he)下游引物的5’結合(he)(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)在雙(shuang)(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)體(ti)靶(ba)(ba)序(xu)(xu)列上(shang)通常間隔至少45個(ge)(ge)(ge)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)，更優選至少50個(ge)(ge)(ge)、至少55個(ge)(ge)(ge)或至少60個(ge)(ge)(ge)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)。

所(suo)述(shu)上游和/或(huo)(huo)下游引物(wu)可具(ju)(ju)有與所(suo)述(shu)鏈(lian)侵入(ru)(ru)寡核苷(gan)(gan)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)的(de)序(xu)(xu)列(lie)重(zhong)(zhong)(zhong)疊(die)區。所(suo)述(shu)序(xu)(xu)列(lie)重(zhong)(zhong)(zhong)疊(die)區的(de)長度通常(chang)為1-8個核苷(gan)(gan)酸(suan)，長度可以是至(zhi)少5個或(huo)(huo)至(zhi)少6個核苷(gan)(gan)酸(suan)。所(suo)述(shu)下游引物(wu)也(ye)可具(ju)(ju)有與鏈(lian)侵入(ru)(ru)寡核苷(gan)(gan)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)重(zhong)(zhong)(zhong)疊(die)長度為1-8個核苷(gan)(gan)酸(suan)的(de)序(xu)(xu)列(lie)區。或(huo)(huo)者，所(suo)述(shu)上游和/或(huo)(huo)下游引物(wu)和所(suo)述(shu)鏈(lian)侵入(ru)(ru)寡核苷(gan)(gan)酸(suan)之間可沒有序(xu)(xu)列(lie)重(zhong)(zhong)(zhong)疊(die)，引物(wu)轉而結合(he)于靶序(xu)(xu)列(lie)中靠近(jin)鏈(lian)侵入(ru)(ru)寡核苷(gan)(gan)酸(suan)的(de)結合(he)位點的(de)位置(zhi)。

當引(yin)物(wu)(wu)結合(he)于(yu)鏈侵入寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)附近(jin)時，鏈侵入寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)的相關結合(he)位點和引(yin)物(wu)(wu)的5’端之間通(tong)常有(you)25個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)或(huo)更少(shao)(shao)，更優選20個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)或(huo)更少(shao)(shao)、15個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)或(huo)更少(shao)(shao)，或(huo)10個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)或(huo)更少(shao)(shao)。這(zhe)確保所述引(yin)物(wu)(wu)能夠(gou)與(yu)通(tong)過鏈侵入寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)的結合(he)而產生的單鏈區(qu)雜交。

優選地，設計(ji)各(ge)引物(wu)(wu)以允許特(te)(te)異(yi)(yi)性檢測特(te)(te)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)靶(ba)(ba)核(he)酸(suan)序(xu)列(lie)，例如(ru)存(cun)在(zai)于特(te)(te)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)靶(ba)(ba)標(例如(ru)特(te)(te)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)生物(wu)(wu)體或(huo)(huo)(huo)特(te)(te)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)原體)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)(te)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)型或(huo)(huo)(huo)核(he)酸(suan)序(xu)列(lie)。因(yin)此，各(ge)引物(wu)(wu)通(tong)常(chang)與僅存(cun)在(zai)于靶(ba)(ba)標中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)互補序(xu)列(lie)特(te)(te)異(yi)(yi)性或(huo)(huo)(huo)選擇性地雜交(jiao)。但是，各(ge)引物(wu)(wu)也可與其(qi)他序(xu)列(lie)(例如(ru)存(cun)在(zai)于其(qi)他物(wu)(wu)種中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列(lie))雜交(jiao)，條件是當各(ge)引物(wu)(wu)與第二引物(wu)(wu)、鏈侵入寡核(he)苷酸(suan)和寡核(he)苷酸(suan)探(tan)針組合使用時獲得所述靶(ba)(ba)核(he)酸(suan)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)(te)異(yi)(yi)性檢測。

本文提(ti)供(gong)(gong)了(le)用(yong)于(yu)擴(kuo)(kuo)增(zeng)產(chan)毒艱(jian)難梭茵和(he)鼠傷(shang)寒(han)沙門(men)氏(shi)茵中(zhong)的(de)(de)靶(ba)核(he)苷酸(suan)序列(lie)的(de)(de)適合的(de)(de)上游(you)和(he)下游(you)引(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)具體實例。本發(fa)明提(ti)供(gong)(gong)了(le)SEQ ID NO 21和(he)22或其變體的(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)用(yong)于(yu)擴(kuo)(kuo)增(zeng)產(chan)毒艱(jian)難梭菌的(de)(de)靶(ba)核(he)酸(suan)序列(lie)(例如SEQ ID NO：26)，以及SEQ ID NO 27和(he)28或其變體的(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)用(yong)于(yu)擴(kuo)(kuo)增(zeng)鼠傷(shang)寒(han)沙門(men)氏(shi)茵的(de)(de)靶(ba)核(he)酸(suan)序列(lie)(例如SEQ ID NO：31)。

SEQ ID NO 21、22、27和(he)28的(de)變體(ti)可以(yi)是長度最多達(da)30個核(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)的(de)寡核(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)，其包含與SEQ ID NO：21、22、27和(he)28的(de)相應原(yuan)始(shi)引物(wu)序列的(de)至少10個連(lian)續核(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)部分或(huo)完(wan)全(quan)互補的(de)區(qu)域(yu)。優選地(di)，所(suo)述變體(ti)包含與SEQ ID NO：21、22、27和(he)28的(de)相應原(yuan)始(shi)引物(wu)序列的(de)至少11、12、13、14或(huo)15個連(lian)續核(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)部分或(huo)完(wan)全(quan)互補的(de)區(qu)域(yu)。當所(suo)述原(yuan)始(shi)引物(wu)序列的(de)長度大于16個核(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(例如長度最多達(da)21個核(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(例如SEQ ID NO：21))時，所(suo)述變體(ti)可相應地(di)包含與其16、17、18、19或(huo)20個連(lian)續核(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)部分或(huo)完(wan)全(quan)互補的(de)區(qu)域(yu)。

以(yi)上(shang)變(bian)體可(ke)(ke)(ke)包含與(yu)所(suo)(suo)述原始引(yin)(yin)物(wu)序列(lie)(以(yi)及(ji)因(yin)(yin)此(ci)與(yu)靶序列(lie))的(de)(de)(de)相(xiang)應區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)具(ju)(ju)有1、2、3、4或(huo)(huo)5個(ge)錯(cuo)(cuo)(cuo)配(pei)(置換(huan))的(de)(de)(de)區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)，因(yin)(yin)此(ci)與(yu)其(qi)部分互補(bu)。因(yin)(yin)此(ci)，例如(ru)，所(suo)(suo)述變(bian)體可(ke)(ke)(ke)包含長度(du)(du)為(wei)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)10個(ge)核苷酸(suan)的(de)(de)(de)區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)，所(suo)(suo)述區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)與(yu)所(suo)(suo)述相(xiang)應原始引(yin)(yin)物(wu)序列(lie)的(de)(de)(de)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)10個(ge)連(lian)續核苷酸(suan)的(de)(de)(de)相(xiang)應區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)具(ju)(ju)有1、2或(huo)(huo)3個(ge)錯(cuo)(cuo)(cuo)配(pei)，例如(ru)1或(huo)(huo)2個(ge)錯(cuo)(cuo)(cuo)配(pei)。所(suo)(suo)述變(bian)體可(ke)(ke)(ke)包含長度(du)(du)為(wei)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)13、14或(huo)(huo)15個(ge)核苷酸(suan)的(de)(de)(de)區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)，所(suo)(suo)述區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)與(yu)所(suo)(suo)述相(xiang)應原始引(yin)(yin)物(wu)序列(lie)中等效長度(du)(du)的(de)(de)(de)相(xiang)應區(qu)(qu)(qu)域(yu)(yu)(yu)具(ju)(ju)有1、2、3、4或(huo)(huo)5個(ge)錯(cuo)(cuo)(cuo)配(pei)，例如(ru)1-3個(ge)錯(cuo)(cuo)(cuo)配(pei)。所(suo)(suo)述變(bian)體引(yin)(yin)物(wu)序列(lie)中的(de)(de)(de)任何錯(cuo)(cuo)(cuo)配(pei)可(ke)(ke)(ke)間隔至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)2個(ge)、至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)4個(ge)、至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)5個(ge)或(huo)(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)(shao)10個(ge)核苷酸(suan)。

或者，所(suo)(suo)述變(bian)體可包含(han)長度至(zhi)少(shao)為10、11、12、13、14或15個(ge)核苷酸(suan)的區域，其(qi)與所(suo)(suo)述原(yuan)始引物(wu)序列(lie)完全互(hu)補。

SEQ ID NO 21、22、27和28的(de)變體也(ye)可以是長度最多(duo)達30個核苷(gan)酸的(de)寡核苷(gan)酸，其與所(suo)述相(xiang)應原始引(yin)物序列(lie)具有(you)至(zhi)少(shao)70％的(de)序列(lie)同一性，優選至(zhi)少(shao)75％、至(zhi)少(shao)80％，更優選至(zhi)少(shao)85％、至(zhi)少(shao)90％、至(zhi)少(shao)95％的(de)序列(lie)同一性。

此(ci)外，所述(shu)(shu)變體引物(wu)可(ke)(ke)包含部分(fen)或完全與所述(shu)(shu)原(yuan)始引物(wu)序(xu)(xu)列(lie)互補(bu)(bu)的區域的5’和(he)(he)/或3’側翼核苷酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)。所述(shu)(shu)5’和(he)(he)/或3’側翼序(xu)(xu)列(lie)可(ke)(ke)以是與靶核酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)非互補(bu)(bu)的，或可(ke)(ke)與位于(yu)所述(shu)(shu)靶核酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)中(zhong)原(yuan)始引物(wu)的結合區側翼的區域(例如所述(shu)(shu)靶核酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)中(zhong)原(yuan)始引物(wu)的結合區的5’和(he)(he)/或3’端的5-10個核苷酸(suan))序(xu)(xu)列(lie)互補(bu)(bu)。

用于SIBA的鏈侵入寡(gua)核苷酸

基于(yu)目的(de)(de)靶(ba)核(he)酸(suan)序列(lie)(lie)，并且(qie)考(kao)慮上游(you)和(he)下游(you)引(yin)物的(de)(de)結合位(wei)點(dian)以及鏈侵入寡核(he)苷酸(suan)使靶(ba)核(he)酸(suan)序列(lie)(lie)在(zai)相關區域成為單鏈以允(yun)許(xu)結合上游(you)引(yin)物和(he)下游(you)引(yin)物的(de)(de)需(xu)要(yao)，選擇適合的(de)(de)鏈侵入寡核(he)苷酸(suan)。

所(suo)述鏈侵(qin)入(ru)寡核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)包含與(yu)靶(ba)標互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)(bu)(bu)的(de)序(xu)列(lie)(lie)和任(ren)選的(de)其他側翼(yi)非互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)(bu)(bu)序(xu)列(lie)(lie)。與(yu)所(suo)述靶(ba)標互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)(bu)(bu)的(de)序(xu)列(lie)(lie)的(de)長(chang)度(du)(du)可(ke)由技術人員根據經(jing)(jing)驗確(que)定，并且其足以提供對所(suo)述靶(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)的(de)有效鏈侵(qin)入(ru)，任(ren)選地在等溫條件下。所(suo)述互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)(bu)(bu)序(xu)列(lie)(lie)可(ke)包含RNA-DNA互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)(bu)(bu)堿(jian)基(ji)配對和經(jing)(jing)修(xiu)飾的(de)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)。通常，互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)(bu)(bu)序(xu)列(lie)(lie)的(de)長(chang)度(du)(du)為至(zhi)少(shao)(shao)25或(huo)(huo)至(zhi)少(shao)(shao)27個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)，通常至(zhi)少(shao)(shao)30個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)，例如至(zhi)少(shao)(shao)32個(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)(shao)33個(ge)(ge)或(huo)(huo)至(zhi)少(shao)(shao)35個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)，更優選長(chang)度(du)(du)為至(zhi)少(shao)(shao)36、37、38、39或(huo)(huo)40個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)或(huo)(huo)更多。互(hu)(hu)(hu)補(bu)(bu)(bu)(bu)序(xu)列(lie)(lie)的(de)長(chang)度(du)(du)可(ke)以是30-50、32-50、35-50、40-50、35-48、35-46、38-45或(huo)(huo)40-45個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)。

應(ying)理解(jie)，以(yi)上序(xu)列(lie)(lie)長度(du)是指(zhi)可(ke)部分(fen)或(huo)完(wan)全(quan)與靶核(he)酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)互補的(de)(de)鏈(lian)(lian)入(ru)(ru)侵(qin)寡核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)(de)一部分(fen)。在特(te)定的(de)(de)位置可(ke)在鏈(lian)(lian)侵(qin)入(ru)(ru)寡核(he)苷(gan)酸(suan)和(he)靶序(xu)列(lie)(lie)之(zhi)間(jian)存在錯配，而仍(reng)允(yun)許靶序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)特(te)異性(xing)擴(kuo)增和(he)檢測，特(te)別是考(kao)慮到為實現擴(kuo)增而組合使用上游和(he)下(xia)游引物以(yi)及(ji)鏈(lian)(lian)侵(qin)入(ru)(ru)寡核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)(de)情(qing)況。鏈(lian)(lian)侵(qin)入(ru)(ru)寡核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)(de)互補區域(yu)和(he)靶序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)相應(ying)區域(yu)之(zhi)間(jian)可(ke)存在1、2、3、4、5、6、7或(huo)8個錯配，這取決于互補序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)總長度(du)。

所(suo)述(shu)鏈侵入寡核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)互(hu)補(bu)序(xu)(xu)列與靶(ba)(ba)序(xu)(xu)列插入上(shang)(shang)游(you)和(he)(he)下(xia)游(you)引物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)合區之間(并且通常(chang)與上(shang)(shang)游(you)和(he)(he)下(xia)游(you)引物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)種或(huo)更(geng)(geng)多種重(zhong)疊(die))的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)部分雜交。所(suo)述(shu)鏈侵入寡核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)與上(shang)(shang)游(you)和(he)(he)/或(huo)下(xia)游(you)引物可具有(you)長度為1-8個核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)疊(die)區，例如(ru)長度為至少(shao)5個或(huo)至少(shao)6個核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)區域。所(suo)述(shu)鏈侵入寡核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)互(hu)補(bu)序(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)5’部分通常(chang)在距離待熔解的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)雙鏈體靶(ba)(ba)核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列(擴(kuo)增子(zi))的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)5’邊(bian)界(jie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)25個核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)或(huo)更(geng)(geng)少(shao)核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)、更(geng)(geng)優選20個核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)或(huo)更(geng)(geng)少(shao)核(he)(he)苷(gan)(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)以內(nei)結(jie)合。

所(suo)述鏈侵入寡核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)任(ren)選地(di)還包含(han)所(suo)述靶標的非(fei)(fei)(fei)互(hu)(hu)補(bu)序(xu)(xu)列(lie)區，所(suo)述非(fei)(fei)(fei)互(hu)(hu)補(bu)序(xu)(xu)列(lie)區位于互(hu)(hu)補(bu)序(xu)(xu)列(lie)區域側翼。所(suo)述鏈侵入寡核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)可包含(han)非(fei)(fei)(fei)互(hu)(hu)補(bu)5’區，其可以具有(you)任(ren)何(he)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)。所(suo)述5’非(fei)(fei)(fei)互(hu)(hu)補(bu)區的長度通常(chang)為(wei)(wei)至少(shao)3個(ge)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)，更通常(chang)的長度為(wei)(wei)至少(shao)6個(ge)、至少(shao)8個(ge)、優(you)選至少(shao)10個(ge)、至少(shao)12個(ge)或至少(shao)14個(ge)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)。所(suo)述5’非(fei)(fei)(fei)互(hu)(hu)補(bu)區可輔(fu)助重(zhong)組酶(mei)的結合。所(suo)述鏈侵入寡核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)可包含(han)長度通常(chang)為(wei)(wei)1-3個(ge)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)的3’非(fei)(fei)(fei)互(hu)(hu)補(bu)區，其包含(han)阻(zu)斷聚(ju)合酶(mei)延伸(shen)的核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(例如invdT)。

當重組酶與寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)聯合使用時(shi)，所(suo)述鏈侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)的長(chang)度通常為(wei)(wei)至(zhi)(zhi)少(shao)30個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)。所(suo)述鏈侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)的長(chang)度優選為(wei)(wei)至(zhi)(zhi)少(shao)35個(ge)(ge)、至(zhi)(zhi)少(shao)40個(ge)(ge)或(huo)至(zhi)(zhi)少(shao)45個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)，更優選為(wei)(wei)至(zhi)(zhi)少(shao)50個(ge)(ge)，并(bing)且長(chang)度可(ke)以為(wei)(wei)至(zhi)(zhi)少(shao)55個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)或(huo)更多。所(suo)述鏈侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)的長(chang)度可(ke)以是40-70、45-70、45-70、50-70、55-70、45-65、50-65、50-60或(huo)55-65個(ge)(ge)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)。

通常，所(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)鏈侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)具有不(bu)可(ke)延伸的3’末(mo)端，使(shi)得其(qi)不(bu)能(neng)充當DNA擴增的底(di)物(wu)，然后僅在(zai)(zai)特(te)異(yi)(yi)性的上游和(he)下(xia)游引物(wu)進一(yi)步結合時才擴增所(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)靶序列。這避免了(le)非特(te)異(yi)(yi)性擴增產物(wu)的形成(cheng)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)鏈侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)在(zai)(zai)其(qi)3’區(例如在(zai)(zai)距離3’末(mo)端10-15或(huo)10-20個核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)內)可(ke)包含(han)(han)1、2、3、4、5、6、7、8或(huo)更多個經修飾的核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)鏈侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)可(ke)包含(han)(han)對3’末(mo)端核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)的3’修飾，并且(qie)可(ke)以(yi)是雙脫氧核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)，或(huo)可(ke)包含(han)(han)3’氨基-烯丙(bing)基、3’碳間(jian)隔(ge)基(spacer)、3’磷酸(suan)(suan)(suan)、3’生物(wu)素、3’唾液(ye)酰基或(huo)3’巰基。所(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)3’核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)可(ke)以(yi)是通過(guo)3’-3’鍵反向摻入(ru)的核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)。可(ke)選(xuan)地(di)(di)或(huo)另外地(di)(di)，所(suo)(suo)述(shu)(shu)(shu)鏈侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)的3’區可(ke)包含(han)(han)具有差(cha)的DNA聚合酶底(di)物(wu)能(neng)力(li)的核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)，例如PNA(肽核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan))核(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)、LNA(鎖(suo)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan))、2’-5’連接的DNA或(huo)2’-O-甲(jia)基RNA，或(huo)其(qi)組合。

當(dang)所述鏈侵(qin)(qin)入寡(gua)核(he)苷酸(suan)是完全由PNA組成的(de)PNA寡(gua)聚體(ti)時，這樣的(de)寡(gua)核(he)苷酸(suan)在不存(cun)在重組酶時可使雙鏈體(ti)DNA不穩定并侵(qin)(qin)入。因此，當(dang)使用(yong)PNA寡(gua)核(he)苷酸(suan)時，可在不存(cun)在重組酶的(de)情況下進(jin)行本(ben)發明的(de)方法。

本(ben)文(wen)提供了用于產(chan)毒艱難(nan)梭茵和鼠傷寒(han)沙門(men)氏茵中靶(ba)核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列的(de)(de)適合的(de)(de)鏈侵入寡核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)具體實例(li)。本(ben)發明(ming)提供了SEQ ID NO：23或(huo)其經(jing)修飾的(de)(de)衍生物或(huo)變(bian)體的(de)(de)鏈侵入寡核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)，用于擴增產(chan)毒艱難(nan)梭茵的(de)(de)靶(ba)核酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列(例(li)如(ru)SEQ ID NO：26)；以及SEQ ID NO 29或(huo)其經(jing)修飾的(de)(de)衍生物或(huo)變(bian)體的(de)(de)鏈侵入寡核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)，用于擴增鼠傷寒(han)沙門(men)氏茵的(de)(de)靶(ba)核酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列(例(li)如(ru)SEQ ID NO：31)。

如以(yi)(yi)上所(suo)討(tao)論(lun)的(de)(de)(de)，優選(xuan)本發明中所(suo)使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)鏈(lian)侵(qin)入寡(gua)核(he)苷(gan)酸在其(qi)3’區(qu)包(bao)含一個或(huo)(huo)多(duo)個經修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)寡(gua)核(he)苷(gan)酸以(yi)(yi)阻止其(qi)用(yong)作聚(ju)合(he)酶底物。因此，SEQ ID NO：23或(huo)(huo)29的(de)(de)(de)經修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)衍(yan)生物在其(qi)3’區(qu)(通常在距離3’末端10-15或(huo)(huo)10-20個核(he)苷(gan)酸內(nei))可(ke)包(bao)含1、2、3、4、5、6、7、8或(huo)(huo)更多(duo)個經修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)核(he)苷(gan)酸。所(suo)述(shu)修(xiu)飾(shi)可(ke)選(xuan)自以(yi)(yi)上討(tao)論(lun)的(de)(de)(de)那些中的(de)(de)(de)任(ren)一種。所(suo)述(shu)經修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)衍(yan)生物可(ke)以(yi)(yi)是SEQ ID NO：23或(huo)(huo)29的(de)(de)(de)相(xiang)應序(xu)列的(de)(de)(de)PNA寡(gua)聚(ju)體。

SEQ ID NO 23和(he)29的(de)變(bian)體通常是長度大于30個(ge)核(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)，更優(you)選至(zhi)少(shao)35個(ge)、至(zhi)少(shao)40個(ge)或(huo)(huo)至(zhi)少(shao)45個(ge)核(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)寡(gua)核(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)，其包(bao)含(han)與(yu)(yu)SEQ ID NO：23或(huo)(huo)29中存(cun)在的(de)相(xiang)應原始靶互(hu)補序(xu)(xu)列的(de)至(zhi)少(shao)30個(ge)連續核(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)部分或(huo)(huo)完(wan)全互(hu)補的(de)區(qu)域。優(you)選地，所述(shu)變(bian)體包(bao)含(han)與(yu)(yu)SEQ ID NO：23或(huo)(huo)29中存(cun)在的(de)靶互(hu)補序(xu)(xu)列的(de)至(zhi)少(shao)32、35、37、40、42或(huo)(huo)45個(ge)連續核(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)部分或(huo)(huo)完(wan)全互(hu)補的(de)區(qu)域。

以上(shang)變體可包含(han)(han)與(yu)SEQ ID NO：23或(huo)29的(de)(de)(de)原(yuan)始(shi)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)的(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)應靶(ba)互補區(qu)(qu)(qu)(以及(ji)因此(ci)與(yu)靶(ba)序列)具有1、2、3、4、5、6、7或(huo)8個(ge)(ge)錯(cuo)(cuo)配(pei)(置換)的(de)(de)(de)區(qu)(qu)(qu)域(yu)，因此(ci)與(yu)其部分(fen)互補。因此(ci)，例(li)如，所述(shu)變體可包含(han)(han)長(chang)(chang)度(du)為至(zhi)少(shao)30個(ge)(ge)核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)的(de)(de)(de)區(qu)(qu)(qu)域(yu)，其與(yu)相(xiang)(xiang)應的(de)(de)(de)原(yuan)始(shi)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)的(de)(de)(de)至(zhi)少(shao)40個(ge)(ge)連續核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)的(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)應區(qu)(qu)(qu)域(yu)具有1、2、3或(huo)4個(ge)(ge)(例(li)如1-4或(huo)1-3個(ge)(ge))錯(cuo)(cuo)配(pei)。所述(shu)變體可包含(han)(han)長(chang)(chang)度(du)為至(zhi)少(shao)35、40、42或(huo)45個(ge)(ge)核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)的(de)(de)(de)區(qu)(qu)(qu)域(yu)，其與(yu)相(xiang)(xiang)應的(de)(de)(de)原(yuan)始(shi)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)中等效長(chang)(chang)度(du)的(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)應區(qu)(qu)(qu)域(yu)具有1、2、3、4、5或(huo)6個(ge)(ge)(例(li)如1-5或(huo)1-3個(ge)(ge))錯(cuo)(cuo)配(pei)。所述(shu)變體鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)序列中的(de)(de)(de)任(ren)何錯(cuo)(cuo)配(pei)可間(jian)隔至(zhi)少(shao)2個(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)4個(ge)(ge)、至(zhi)少(shao)5個(ge)(ge)或(huo)至(zhi)少(shao)10個(ge)(ge)核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)。

或者(zhe)，所述變(bian)體可包含長度為至少32、35、37、40、42或45個核苷酸的(de)區域，其與原始鏈侵入(ru)寡核苷酸的(de)靶互補區完全互補。

SEQ ID NO 23和29的(de)變體也可(ke)以是包含靶互補區域(yu)的(de)長度大于(yu)30個核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)寡(gua)核(he)苷(gan)酸(suan)，所述靶互補區域(yu)與相應的(de)原始鏈侵入(ru)寡(gua)核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)靶互補序(xu)列具(ju)有至少(shao)(shao)70％的(de)序(xu)列同一性，優選(xuan)(xuan)至少(shao)(shao)75％、至少(shao)(shao)80％，更優選(xuan)(xuan)至少(shao)(shao)85％、至少(shao)(shao)90％、至少(shao)(shao)95％的(de)序(xu)列同一性。

所(suo)述(shu)(shu)變體鏈侵入寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)可包含(han)與所(suo)述(shu)(shu)原始(shi)鏈侵入寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)部分(fen)或(huo)完全互補的(de)(de)(de)區(qu)(qu)域(yu)的(de)(de)(de)5’和(he)/或(huo)3’側翼核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)。所(suo)述(shu)(shu)5’和(he)/或(huo)3’側翼序(xu)列(lie)可以是與靶(ba)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)非互補的(de)(de)(de)，或(huo)可與位于(yu)所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)中原始(shi)鏈侵入寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)結合(he)區(qu)(qu)側翼的(de)(de)(de)區(qu)(qu)域(yu)(例如，所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)中原始(shi)鏈侵入寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)結合(he)區(qu)(qu)的(de)(de)(de)5’和(he)/或(huo)3’端的(de)(de)(de)5-10或(huo)5-15個核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan))的(de)(de)(de)序(xu)列(lie)互補。

所述變體鏈侵入(ru)寡(gua)核苷(gan)(gan)酸的(de)其余序(xu)(xu)列通(tong)常與(yu)靶序(xu)(xu)列無(wu)關，并(bing)且也通(tong)常與(yu)原始鏈侵入(ru)寡(gua)核苷(gan)(gan)酸無(wu)關。

所述(shu)(shu)變體鏈侵入(ru)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)酸在(zai)其3’區還(huan)包含一(yi)(yi)個或(huo)多個經(jing)修(xiu)飾的(de)(de)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)酸，例如2、3、4、5、6、7、8或(huo)更多個經(jing)修(xiu)飾的(de)(de)寡(gua)核(he)(he)(he)苷(gan)酸，其可在(zai)距離3’末端的(de)(de)10-15或(huo)10-20個核(he)(he)(he)苷(gan)酸內。所述(shu)(shu)修(xiu)飾可選(xuan)自以(yi)上討論的(de)(de)那些中的(de)(de)任一(yi)(yi)種。

靶核苷酸序列的檢測

本發明(ming)提(ti)供(gong)了用于檢測靶核(he)(he)苷(gan)(gan)酸序列的(de)(de)上(shang)游和下(xia)游引(yin)物(wu)、寡核(he)(he)苷(gan)(gan)酸探針(zhen)和鏈(lian)(lian)侵入寡核(he)(he)苷(gan)(gan)酸的(de)(de)特定組合(he)。因此，本發明(ming)提(ti)供(gong)了在(zai)至少一種單鏈(lian)(lian)DNA結合(he)蛋白的(de)(de)存在(zai)下(xia)檢測樣品(pin)中產(chan)毒艱(jian)難梭茵的(de)(de)靶核(he)(he)酸序列的(de)(de)方法，包(bao)括在(zai)促進所述(shu)(shu)靶核(he)(he)酸序列擴增的(de)(de)條件下(xia)，使(shi)所述(shu)(shu)樣品(pin)與上(shang)述(shu)(shu)SEQ ID NO：24或25或其任一種的(de)(de)變體(ti)的(de)(de)寡核(he)(he)苷(gan)(gan)酸探針(zhen)、上(shang)述(shu)(shu)SEQ ID NO：21或其變體(ti)的(de)(de)上(shang)游引(yin)物(wu)、上(shang)述(shu)(shu)SEQ ID NO：22或其變體(ti)的(de)(de)下(xia)游引(yin)物(wu)，以及(ji)上(shang)述(shu)(shu)SEQ ID NO：23或其經修(xiu)飾的(de)(de)衍生物(wu)或變體(ti)的(de)(de)鏈(lian)(lian)侵入寡核(he)(he)苷(gan)(gan)酸接觸。所述(shu)(shu)方法可包(bao)括檢測SEQ ID NO：26的(de)(de)靶核(he)(he)酸序列。

本發(fa)明(ming)還提供了(le)在(zai)至(zhi)(zhi)少一(yi)種單鏈(lian)DNA結(jie)合蛋白的(de)(de)(de)存在(zai)下(xia)檢測樣品(pin)中鼠傷寒沙門氏菌的(de)(de)(de)靶核(he)酸(suan)序(xu)列的(de)(de)(de)方法，包(bao)括(kuo)(kuo)在(zai)促進所述(shu)靶核(he)酸(suan)序(xu)列擴增的(de)(de)(de)條件下(xia)，使所述(shu)樣品(pin)與(yu)上(shang)述(shu)SEQ ID NO：30或(huo)其變體(ti)的(de)(de)(de)寡(gua)核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探針、上(shang)述(shu)SEQ ID NO：27或(huo)其變體(ti)的(de)(de)(de)上(shang)游引物、上(shang)述(shu)SEQ ID NO：28或(huo)其變體(ti)的(de)(de)(de)下(xia)游引物，以及上(shang)述(shu)SEQ ID NO：29或(huo)其經修飾的(de)(de)(de)衍生物或(huo)變體(ti)的(de)(de)(de)至(zhi)(zhi)少一(yi)種鏈(lian)侵入寡(gua)核(he)苷(gan)(gan)酸(suan)接觸(chu)。所述(shu)方法可包(bao)括(kuo)(kuo)檢測SEQ ID NO：31的(de)(de)(de)靶核(he)酸(suan)序(xu)列。

本發明還提供了在至少一種(zhong)單(dan)鏈DNA結合蛋(dan)白的(de)存在下(xia)檢測(ce)樣品中(zhong)SEQ ID NO：20的(de)靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序列(lie)的(de)方法，包括(kuo)在促進所(suo)述靶(ba)(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)序列(lie)擴增的(de)條件下(xia)，使所(suo)述樣品與上(shang)述SEQ ID NO：13或(huo)(huo)14或(huo)(huo)其變體(ti)(ti)(ti)的(de)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)探針、SEQ ID NO：11或(huo)(huo)其變體(ti)(ti)(ti)的(de)上(shang)游引(yin)物(wu)、SEQ ID NO：12或(huo)(huo)其變體(ti)(ti)(ti)的(de)下(xia)游引(yin)物(wu)，以及(ji)SEQ ID NO：15或(huo)(huo)其經修(xiu)飾的(de)衍生物(wu)或(huo)(huo)變體(ti)(ti)(ti)的(de)至少一種(zhong)鏈侵入寡(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)接觸。可(ke)根(gen)據上(shang)述用于SEQ ID NO 21、22、27和(he)(he)28的(de)變體(ti)(ti)(ti)的(de)相同標(biao)準(zhun)，選擇SEQ ID NO 11和(he)(he)12的(de)變體(ti)(ti)(ti)。可(ke)根(gen)據上(shang)述用于SEQ ID NO 23和(he)(he)29的(de)變體(ti)(ti)(ti)的(de)相同標(biao)準(zhun)，選擇SEQ ID NO 15的(de)變體(ti)(ti)(ti)和(he)(he)經修(xiu)飾的(de)衍生物(wu)。

本發明也提(ti)供了在(zai)至(zhi)少一(yi)種單鏈DNA結合蛋白(bai)的(de)存(cun)在(zai)下檢(jian)測樣品(pin)中SEQ ID No：34的(de)靶(ba)核酸序(xu)列的(de)方(fang)法，包括使(shi)所述(shu)樣品(pin)與SEQ ID NO 3至(zhi)10或其變體中任一(yi)種的(de)寡核苷(gan)酸探針接觸。

本發明的產品

核酸

本(ben)發明還提供了作為產品本(ben)身的(de)(de)寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針，其(qi)包含熒光團、猝滅劑(ji)和與靶(ba)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)序列互補的(de)(de)區域。所(suo)述寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針的(de)(de)序列包含至少20％的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、經修飾的(de)(de)RNA核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和/或(huo)PNA核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。本(ben)發明的(de)(de)寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針產品可以是(shi)用于(yu)本(ben)發明方法的(de)(de)上述任(ren)何寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針。本(ben)發明也具體提供了上述SEQ ID NO：3至10、13、14、24、25或(huo)30或(huo)其(qi)任(ren)一種的(de)(de)變體的(de)(de)寡(gua)核(he)(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)探(tan)針。

組合物

本發(fa)明也提供了包(bao)含本發(fa)明的(de)(de)寡(gua)(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)探針(zhen)的(de)(de)組(zu)合(he)物(wu)和制(zhi)劑。所述(shu)(shu)組(zu)合(he)物(wu)可以是，例如，溶液(ye)(ye)、凍干物(wu)、懸浮液(ye)(ye)或(huo)(huo)在(zai)油性(xing)(xing)或(huo)(huo)水性(xing)(xing)載體中的(de)(de)乳液(ye)(ye)。所述(shu)(shu)組(zu)合(he)物(wu)還可包(bao)含一種(zhong)或(huo)(huo)多種(zhong)選自(zi)(zi)上游引物(wu)、下游引物(wu)和鏈(lian)侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)的(de)(de)寡(gua)(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)組(zu)分(fen)。所述(shu)(shu)組(zu)合(he)物(wu)還可包(bao)含一種(zhong)或(huo)(huo)多種(zhong)選自(zi)(zi)DNA聚(ju)合(he)酶、能夠結合(he)單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)蛋(dan)白、重(zhong)(zhong)組(zu)酶和重(zhong)(zhong)組(zu)酶輔助蛋(dan)白的(de)(de)蛋(dan)白。所述(shu)(shu)組(zu)合(he)物(wu)優選包(bao)含寡(gua)(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)探針(zhen)以及(i)包(bao)含與靶(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)序列(lie)(lie)互補(bu)的(de)(de)區域的(de)(de)鏈(lian)侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)和/或(huo)(huo)(ii)至少(shao)一種(zhong)能夠結合(he)單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)蛋(dan)白。分(fen)別設計所述(shu)(shu)組(zu)合(he)物(wu)的(de)(de)探針(zhen)、引物(wu)和鏈(lian)侵(qin)(qin)入(ru)寡(gua)(gua)(gua)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)組(zu)分(fen)，用于(yu)檢測靶(ba)核(he)(he)酸(suan)(suan)序列(lie)(lie)。

所(suo)述(shu)組合物(wu)(wu)可包含(han)SEQ ID NO：24或(huo)(huo)25或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)寡核(he)(he)苷酸(suan)(suan)探(tan)針，以及(ji)(ji)(i)SEQ ID NO：21或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)上(shang)游(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)，(ii)SEQ ID NO：22或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)下游(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)和(he)(he)(he)/或(huo)(huo)(iii)SEQ ID NO：23或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)(he)苷酸(suan)(suan)。另外(wai)地(di)或(huo)(huo)可選(xuan)地(di)，所(suo)述(shu)組合物(wu)(wu)可包含(han)SEQ ID NO：30或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)寡核(he)(he)苷酸(suan)(suan)探(tan)針，以及(ji)(ji)(i)SEQ ID NO：27或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)上(shang)游(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)，(ii)SEQ ID NO：28或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)下游(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)和(he)(he)(he)/或(huo)(huo)(iii)SEQ ID NO：29或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)(he)苷酸(suan)(suan)。另外(wai)地(di)或(huo)(huo)可選(xuan)地(di)，所(suo)述(shu)組合物(wu)(wu)可包含(han)SEQ ID NO 17至19和(he)(he)(he)32或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體中任一(yi)種的(de)(de)寡核(he)(he)苷酸(suan)(suan)探(tan)針，以及(ji)(ji)(i)SEQ ID NO：11或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)上(shang)游(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)，(ii)SEQ ID NO：12或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)下游(you)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)和(he)(he)(he)/或(huo)(huo)(iii)SEQ ID NO：15或(huo)(huo)其(qi)(qi)(qi)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)(de)鏈(lian)侵(qin)入寡核(he)(he)苷酸(suan)(suan)。

試劑盒

本(ben)(ben)發明(ming)還提供(gong)了(le)包括(kuo)(kuo)本(ben)(ben)發明(ming)的(de)(de)(de)至少(shao)一種寡核苷酸(suan)(suan)探針的(de)(de)(de)試劑(ji)盒(he)(he)(he)。所述試劑(ji)盒(he)(he)(he)任選地還包括(kuo)(kuo)用于(yu)本(ben)(ben)發明(ming)的(de)(de)(de)方法的(de)(de)(de)使用說明(ming)。所述試劑(ji)盒(he)(he)(he)可(ke)包括(kuo)(kuo)檢測(ce)所擴增(zeng)的(de)(de)(de)DNA的(de)(de)(de)工具。所述試劑(ji)盒(he)(he)(he)可(ke)包括(kuo)(kuo)上游引物(wu)和/或下游引物(wu)。所述試劑(ji)盒(he)(he)(he)可(ke)包括(kuo)(kuo)鏈侵入寡核苷酸(suan)(suan)。可(ke)在所述試劑(ji)盒(he)(he)(he)中以混合物(wu)的(de)(de)(de)形式或在分開(kai)的(de)(de)(de)容器(qi)中提供(gong)以上各寡核苷酸(suan)(suan)。

所(suo)(suo)述試劑(ji)盒或(huo)(huo)組(zu)(zu)(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)任(ren)選地包(bao)括DNA聚合(he)(he)酶(mei)、重組(zu)(zu)(zu)(zu)酶(mei)和重組(zu)(zu)(zu)(zu)酶(mei)輔(fu)助蛋白(bai)中的(de)一種或(huo)(huo)多種。優選地，所(suo)(suo)述DNA聚合(he)(he)酶(mei)是Bsu聚合(he)(he)酶(mei)。優選地，所(suo)(suo)述重組(zu)(zu)(zu)(zu)酶(mei)是細茵(yin)噬(shi)茵(yin)體T4UvsX，其任(ren)選地與重組(zu)(zu)(zu)(zu)酶(mei)輔(fu)助蛋白(bai)UvsY和gp32組(zu)(zu)(zu)(zu)合(he)(he)。所(suo)(suo)述試劑(ji)盒或(huo)(huo)組(zu)(zu)(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)可還包(bao)括dNTP、適(shi)合(he)(he)的(de)緩沖液和上述本(ben)發明方法(fa)中的(de)DNA擴增所(suo)(suo)需的(de)其他(ta)要素。

所述(shu)試(shi)劑盒可包括與本發明(ming)的(de)方(fang)法(fa)和組合物有(you)關(guan)的(de)上述(shu)寡核(he)苷酸(suan)探針、上游引(yin)物、下游引(yin)物和/或鏈侵入寡核(he)苷酸(suan)的(de)任何(he)組合。

用于檢測靶核酸序列的應用

本發明的方(fang)法可(ke)用(yong)于需要(yao)檢(jian)測靶核酸序列的任何應用(yong)。

診斷方法

本(ben)發(fa)(fa)明在醫學環境下(xia)是特別有(you)利的(de)。本(ben)發(fa)(fa)明的(de)檢(jian)測(ce)方法提供高度(du)特異性(xing)的(de)檢(jian)測(ce)以允許確(que)定臨床(chuang)樣品是否包含靶(ba)核酸(suan)(suan)序列。所(suo)述方法可應用于一系列疾(ji)病(bing)環境中。本(ben)發(fa)(fa)明提供了在受(shou)(shou)試者中診斷疾(ji)病(bing)的(de)方法，包括在來自(zi)所(suo)述受(shou)(shou)試者的(de)樣品中實施(shi)本(ben)發(fa)(fa)明的(de)檢(jian)測(ce)靶(ba)核酸(suan)(suan)序列的(de)方法以檢(jian)測(ce)與所(suo)述疾(ji)病(bing)相關的(de)靶(ba)核酸(suan)(suan)序列。

所述(shu)方(fang)法(fa)可(ke)(ke)用于在(zai)(zai)(zai)受試者中診斷病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)感染，包括檢(jian)測來自(zi)所述(shu)病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)的(de)(de)靶核酸序(xu)列。可(ke)(ke)以在(zai)(zai)(zai)患(huan)者中存在(zai)(zai)(zai)或(huo)(huo)疑似存在(zai)(zai)(zai)任何疾(ji)(ji)病(bing)(bing)或(huo)(huo)病(bing)(bing)痛(tong)的(de)(de)背景下確定是否存在(zai)(zai)(zai)病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)。所述(shu)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)可(ke)(ke)包括由病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)存在(zai)(zai)(zai)引起的(de)(de)、與其存在(zai)(zai)(zai)相關(guan)或(huo)(huo)因(yin)(yin)其存在(zai)(zai)(zai)而惡化的(de)(de)那些疾(ji)(ji)病(bing)(bing)。因(yin)(yin)此，患(huan)者可(ke)(ke)表現(xian)出(chu)指示病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)存在(zai)(zai)(zai)的(de)(de)癥(zheng)狀，并且可(ke)(ke)從所述(shu)患(huan)者中獲得樣品以通過上(shang)述(shu)方(fang)法(fa)確定病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)的(de)(de)存在(zai)(zai)(zai)。

可檢測任何病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)。所述(shu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)可以是病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)或細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)或寄(ji)生蟲(chong)。所述(shu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)例如(ru)，但(dan)不限于，真菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)；病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)，包(bao)(bao)(bao)括人(ren)乳頭瘤(liu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、流感病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(A型(xing)(xing)(xing)、B型(xing)(xing)(xing)和(he)C型(xing)(xing)(xing))、脊髓灰質炎(yan)(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、RSV病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、鼻病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、輪(lun)狀病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、甲型(xing)(xing)(xing)肝炎(yan)(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、諾(nuo)沃克病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)類(lei)、腸病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、星狀病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、麻疹(zhen)(zhen)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、副流感病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、腮腺炎(yan)(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、水痘帶狀皰疹(zhen)(zhen)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、巨細(xi)胞病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、EB病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、腺病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、風疹(zhen)(zhen)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、人(ren)T細(xi)胞淋(lin)巴(ba)(ba)瘤(liu)I型(xing)(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(HTLV-I)、乙型(xing)(xing)(xing)肝炎(yan)(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(HBV)、丙型(xing)(xing)(xing)肝炎(yan)(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(HCV)、丁型(xing)(xing)(xing)肝炎(yan)(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、痘病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、馬爾(er)堡病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)和(he)埃博拉(la)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)；細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)，包(bao)(bao)(bao)括結核分枝桿(gan)茵(yin)(yin)(Mycobacterium tuberculosis)、衣原(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)屬(shu)(Chlamydia)、淋(lin)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)奈瑟氏(shi)(shi)球菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(Neisseria gonorrhoeae)、志賀茵(yin)(yin)屬(shu)(Shigella)、沙門氏(shi)(shi)茵(yin)(yin)屬(shu)(Salmonella)、霍亂弧茵(yin)(yin)(Vibrio cholerae)、蒼白密(mi)螺(luo)旋體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(Treponema pallidum)、假單胞茵(yin)(yin)屬(shu)(Pseudomonas)、百(bai)日咳博德特氏(shi)(shi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(Bordetella pertussis)、布(bu)魯桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)屬(shu)(Brucella)、土拉(la)弗(fu)氏(shi)(shi)茵(yin)(yin)(Franciscella tularensis)、幽門螺(luo)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(Helicobacter pylori)、腎臟鉤端螺(luo)旋體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(Leptospira interrogans)、嗜(shi)肺軍團病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(Legionellapneumophila)、鼠(shu)疫耶(ye)爾(er)森氏(shi)(shi)茵(yin)(yin)(Yersinia pestis)、鏈球菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)屬(shu)(Streptococcus)(A型(xing)(xing)(xing)和(he)B型(xing)(xing)(xing))、肺炎(yan)(yan)球菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(Pneumococcus)、腦膜(mo)炎(yan)(yan)球菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(Meningococcus)、流感嗜(shi)血桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(Haemophilus influenza)(b型(xing)(xing)(xing))、鼠(shu)弓形(xing)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(Toxoplasma gondii)、彎曲(qu)茵(yin)(yin)(Campylobacteriosis)、粘膜(mo)炎(yan)(yan)莫(mo)拉(la)茵(yin)(yin)(Moraxella catarrhalis)、腹(fu)股溝肉芽腫(Donovanosis)和(he)放線茵(yin)(yin)(Actinomycosis)；真菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，包(bao)(bao)(bao)括念珠茵(yin)(yin)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(Candidiasis)和(he)曲(qu)霉(mei)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(Aspergillosis)；寄(ji)生病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，包(bao)(bao)(bao)括絳蟲(chong)屬(shu)(Taenia)、吸蟲(chong)(Flukes)、蛔蟲(chong)(Roundworms)、阿米巴(ba)(ba)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(Amoebiasis)、賈(jia)第蟲(chong)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(Giardiasis)、隱(yin)孢子蟲(chong)屬(shu)(Cryptosporidium)、血吸蟲(chong)屬(shu)(Schistosoma)、卡氏(shi)(shi)肺囊蟲(chong)(Pneumocystis carinii)、滴蟲(chong)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(Trichomoniasis)和(he)旋毛蟲(chong)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(Trichinosis)。

特(te)定(ding)的(de)目的(de)病原體包括產毒艱難梭茵和(he)鼠傷寒沙門氏(shi)茵，適于診斷這些病原體感染的(de)方法和(he)寡(gua)核苷酸(suan)的(de)組合在上文中描述。

本發明的一個特別優選的實施方案是鑒定具(ju)有胃腸道感染(特別是具(ju)有腹(fu)瀉癥狀)的患者(zhe)中存在的產毒(du)艱難梭(suo)茵(yin)。

因此，本發明提供了(le)胃(wei)腸道疾(ji)病(例如，由(you)產毒艱難梭茵和鼠傷寒沙(sha)門氏菌引起的(de)(de)腹瀉)的(de)(de)診斷方法。所述(shu)(shu)診斷方法還(huan)可包括檢測(ce)抗生素抗性(xing)標記物和毒力標記物。所述(shu)(shu)方法顯著(zhu)改善了(le)患者的(de)(de)胃(wei)腸道疾(ji)病管理，因為它允許對(dui)給定患者進行最佳治療學治療。因此，所述(shu)(shu)測(ce)試將縮短住院時(shi)長、降低再入院的(de)(de)頻率并(bing)降低費(fei)用。

基于(yu)(yu)(yu)獲自患(huan)者(zhe)樣品(pin)的核酸可(ke)便(bian)利(li)地進(jin)行所述診斷(duan)方(fang)法(fa)，為臨床醫生(sheng)(sheng)提(ti)供關于(yu)(yu)(yu)胃(wei)腸道疾病是否(fou)可(ke)歸(gui)因于(yu)(yu)(yu)產毒艱難(nan)梭(suo)茵(yin)(yin)或鼠傷寒沙(sha)門氏茵(yin)(yin)感染的指(zhi)示。例(li)(li)如(ru)，所述診斷(duan)方(fang)法(fa)可(ke)提(ti)供關于(yu)(yu)(yu)艱難(nan)梭(suo)茵(yin)(yin)的毒素(su)型和毒力(li)以及(ji)艱難(nan)梭(suo)茵(yin)(yin)是否(fou)對任何抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)具(ju)有抗(kang)性的指(zhi)示。然后根據所述測試的結果可(ke)優化醫學治療，例(li)(li)如(ru)通過使用(yong)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)。

鼠(shu)傷(shang)寒沙門(men)氏(shi)茵的檢測

在更(geng)廣泛的(de)方(fang)面，本發明提(ti)供用于檢測樣品的(de)鼠傷寒沙門(men)氏茵的(de)方(fang)法，所(suo)述(shu)(shu)方(fang)法包括在促進擴增包含SEQ ID NO：31的(de)靶(ba)核酸(suan)序(xu)列的(de)條件下(xia)，使所(suo)述(shu)(shu)樣品與至少(shao)(shao)一(yi)種(zhong)上游(you)引物、至少(shao)(shao)一(yi)種(zhong)下(xia)游(you)引物和(he)至少(shao)(shao)一(yi)種(zhong)鏈(lian)侵(qin)(qin)入(ru)(ru)寡核苷酸(suan)接觸，其中(zhong)(zhong)各所(suo)述(shu)(shu)引物和(he)所(suo)述(shu)(shu)鏈(lian)侵(qin)(qin)入(ru)(ru)寡核苷酸(suan)包含與所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核酸(suan)序(xu)列互補的(de)區(qu)域；并且其中(zhong)(zhong)所(suo)述(shu)(shu)鏈(lian)侵(qin)(qin)入(ru)(ru)寡核苷酸(suan)使所(suo)述(shu)(shu)靶(ba)核酸(suan)序(xu)列的(de)至少(shao)(shao)一(yi)部分成為單鏈(lian)以允許結合(he)所(suo)述(shu)(shu)上游(you)引物和(he)下(xia)游(you)引物。

優選地，所(suo)(suo)(suo)述(shu)方法(fa)還包括使所(suo)(suo)(suo)述(shu)樣品(pin)與(yu)至(zhi)(zhi)(zhi)少一種(zhong)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)接(jie)觸(chu)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)包含(han)熒光團、猝滅劑和與(yu)所(suo)(suo)(suo)述(shu)靶核(he)(he)酸(suan)序列互補的(de)區域。通常(chang)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)包含(han)至(zhi)(zhi)(zhi)少20％的(de)RNA核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)、經(jing)修飾的(de)RNA核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)和/或PNA核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)，因此是上述(shu)本(ben)發明的(de)寡(gua)(gua)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)。通常(chang)，在至(zhi)(zhi)(zhi)少一種(zhong)能(neng)夠(gou)與(yu)單鏈(lian)DNA結合(he)的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)存(cun)在下實施所(suo)(suo)(suo)述(shu)檢(jian)測鼠(shu)傷寒(han)沙門(men)氏茵的(de)方法(fa)。通常(chang)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)能(neng)夠(gou)結合(he)單鏈(lian)DNA的(de)蛋(dan)白(bai)是重組酶。

優選地，所(suo)述上游引(yin)物包(bao)含(han)(han)SEQ ID NO：27或其變體(ti)的序列(lie)(lie)，所(suo)述下(xia)游引(yin)物包(bao)含(han)(han)SEQ ID NO：28或其變體(ti)的序列(lie)(lie)，所(suo)述鏈侵入寡(gua)核苷酸包(bao)含(han)(han)SEQ ID NO：29或其變體(ti)的序列(lie)(lie)。

以下實施例舉例說明本發(fa)明。

實施例

實施例1——不同的寡核苷酸對單鏈DNA結合蛋白的親和力

研究了能夠結合單(dan)鏈(lian)DNA的(de)(de)(de)蛋(dan)白對包含(han)熒(ying)光團和(he)(he)猝滅劑的(de)(de)(de)單(dan)鏈(lian)寡核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)探(tan)針(zhen)產(chan)生的(de)(de)(de)信號(hao)的(de)(de)(de)影響(xiang)。所述寡核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)探(tan)針(zhen)由(you)(you)天然DNA或RNA或經修飾的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(例如(ru)，2’-氟RNA、2’-O-甲(jia)基(ji)RNA)、PNA或LNA組(zu)成(cheng)。與(yu)其(qi)他(ta)探(tan)針(zhen)(長度為16-21個(ge)堿基(ji))相比，LNA和(he)(he)PNA探(tan)針(zhen)的(de)(de)(de)長度分(fen)別為12和(he)(he)14個(ge)堿基(ji)。使用(yong)更短的(de)(de)(de)LNA和(he)(he)PNA探(tan)針(zhen)，這是由(you)(you)于(yu)它們的(de)(de)(de)熔(rong)解溫度更高。親和(he)(he)測(ce)定(ding)中寡核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)探(tan)針(zhen)的(de)(de)(de)濃度為100nM，PNA除外，其(qi)為800nM。

在包含20mM Tris-乙酸(suan)鹽pH 8.0、10mM乙酸(suan)鎂(mei)、2mM ATP、60mM Tris-磷酸(suan)肌酸(suan)和0.025U/μl肌酸(suan)激酶(mei)的(de)緩沖液中(zhong)，在存(cun)在或不存(cun)在200nM互補模板(對于(yu)具(ju)有SEQ ID NO 1-8的(de)探(tan)針(zhen)，為SEQ IDNO：34；或者(zhe)對于(yu)具(ju)有SEQ ID NO 9或10的(de)探(tan)針(zhen)，為SEQ ID NO：44)和5μM UvsX的(de)情況下，孵育寡核苷酸(suan)探(tan)針(zhen)。在40℃孵育20分鐘后，測量熒光。

與(yu)不存在(zai)互(hu)補模板(ban)(ban)的(de)(de)(de)情(qing)況下產生的(de)(de)(de)信(xin)(xin)號(hao)相比(bi)，所(suo)有的(de)(de)(de)寡核苷酸(suan)探針(zhen)與(yu)其(qi)互(hu)補模板(ban)(ban)的(de)(de)(de)孵育導(dao)致熒光信(xin)(xin)號(hao)增(zeng)加(圖1a)。然而，在(zai)不存在(zai)互(hu)補模板(ban)(ban)的(de)(de)(de)情(qing)況下，細菌噬茵體T4UvsX的(de)(de)(de)存在(zai)也導(dao)致天然DNA寡核苷酸(suan)探針(zhen)(SEQ ID NO：1和2)的(de)(de)(de)熒光信(xin)(xin)號(hao)顯著(zhu)增(zeng)加，如(ru)圖1a所(suo)示。對這(zhe)一觀察(cha)的(de)(de)(de)可能的(de)(de)(de)解釋是(shi)，UvsX使(shi)DNA探針(zhen)的(de)(de)(de)二級構象不穩定，導(dao)致探針(zhen)和猝滅劑(ji)之間的(de)(de)(de)距離增(zeng)大，即使(shi)在(zai)不存在(zai)互(hu)補模板(ban)(ban)的(de)(de)(de)情(qing)況下探針(zhen)信(xin)(xin)號(hao)也增(zeng)加。當在(zai)包含UvsX的(de)(de)(de)反應中(zhong)監(jian)測DNA擴增(zeng)時，預期這(zhe)種探針(zhen)的(de)(de)(de)非特異性激活將導(dao)致差的(de)(de)(de)信(xin)(xin)號(hao)背景比(bi)。

相比之(zhi)下，在UvsX存在下，具(ju)有相同序列但是(shi)由RNA(SEQ IDNO：3和4)或經修(xiu)飾的RNA(SEQ ID NO：5、6、7、8)或LNA(SEQID NO：9)或PNA(SEQ ID NO：10)組成的寡核苷酸探針仍(reng)然被猝滅(mie)，僅(jin)在互(hu)補(bu)模板存在的情(qing)況下信號(hao)顯著增加。

也說明了(le)單鏈DNA結合蛋白(bai)——細菌噬茵(yin)體T4gp32(新英格(ge)蘭Biolabs)對(dui)與(yu)UvsX一起(qi)使(shi)用(yong)的(de)(de)相同寡(gua)核苷(gan)酸探針(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)信號的(de)(de)影響。在(zai)包(bao)含20mM Tris-乙酸鹽pH 7.9、50mM乙酸鉀、10mM乙酸鎂和1mM DTT的(de)(de)緩沖液中，在(zai)存(cun)在(zai)或不存(cun)在(zai)0.25mg/ml gp32和200nM互補模板(對(dui)于具有SEQ ID NO 1-8的(de)(de)探針(zhen)(zhen)(zhen)，為SEQ ID NO：34；或者對(dui)于具有SEQ ID NO 9或10的(de)(de)探針(zhen)(zhen)(zhen)，為SEQ ID NO：44)的(de)(de)情況下孵育寡(gua)核苷(gan)酸探針(zhen)(zhen)(zhen)，其濃(nong)度與(yu)和UvsX一起(qi)使(shi)用(yong)的(de)(de)那些寡(gua)核苷(gan)酸探針(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)濃(nong)度相似。

在(zai)不(bu)存(cun)(cun)(cun)在(zai)互(hu)補(bu)模板的(de)(de)情況下，gp32的(de)(de)存(cun)(cun)(cun)在(zai)再次(ci)導致DNA探(tan)針(SEQ ID NO：1和2)的(de)(de)信號顯著(zhu)增加(jia)，如圖1b所示。當存(cun)(cun)(cun)在(zai)gp32時，在(zai)存(cun)(cun)(cun)在(zai)或不(bu)存(cun)(cun)(cun)在(zai)互(hu)補(bu)模板的(de)(de)情況下DNA探(tan)針產生的(de)(de)信號之間也(ye)沒有顯著(zhu)差異。因此(ci)，在(zai)包含T4gp32的(de)(de)反應中，雙標(biao)記的(de)(de)天然(ran)DNA探(tan)針不(bu)適合用于靶標(biao)檢測。

相比之(zhi)下，在存在T4gp32的情況下，RNA(SEQ ID NO：3和4)或經修飾(shi)的RNA(SEQ ID NO：5、6、7、8)、LNA(SEQ ID NO：9)和PNA(SEQ ID NO：10)探針(zhen)表(biao)現(xian)出熒光的少(shao)許增加或無(wu)顯著增加。

采用(yong)在利用(yong)單鏈結合蛋白和重組酶(mei)二者用(yong)于(yu)擴(kuo)(kuo)增的(de)(de)等溫的(de)(de)基于(yu)鏈侵入的(de)(de)擴(kuo)(kuo)增方(fang)法中所(suo)使用(yong)的(de)(de)試劑條件(jian)來測試寡核苷(gan)酸(suan)探針。反應(ying)中的(de)(de)試劑組分(fen)為10mM Tris-乙(yi)酸(suan)鹽pH 8.0、10mM乙(yi)酸(suan)鎂、5％DMSO、5％PEG 1000、4mM DTT、0.5mM EDTA、0.1mg/ml BSA、150mM蔗(zhe)糖、2mM ATP、200μM DNTP’s、1∶100000SYBR Green I、60mMTris-磷酸(suan)肌酸(suan)。反應(ying)中的(de)(de)蛋白為250ng/μl gp32、5μM UvsX、0.0625U/μl BSU、0.0125U/μl蔗(zhe)糖磷酸(suan)化(hua)酶(mei)和0.025U/μl肌酸(suan)激酶(mei)(Sigma-Aldrich St.Louis，MO，U.S.A)。引物和鏈侵入寡核苷(gan)酸(suan)的(de)(de)濃(nong)度為200nM。除(chu)非另(ling)有說明，所(suo)使用(yong)的(de)(de)探針的(de)(de)濃(nong)度為200nM。

配(pei)制(zhi)所有反(fan)應(ying)物，而不含有靶DNA或乙(yi)酸鎂。然(ran)后，通過(guo)添加適量的(de)(de)在(zai)乙(yi)酸鎂中(zhong)配(pei)制(zhi)的(de)(de)靶DNA或僅使用乙(yi)酸鎂來開始(shi)反(fan)應(ying)。在(zai)40℃下在(zai)96孔板中(zhong)實時檢測反(fan)應(ying)中(zhong)產生(sheng)的(de)(de)熒光(guang)信號。

在以上試劑(ji)組(zu)合(he)(he)物(沒(mei)有引物和(he)(he)鏈(lian)侵入寡核苷酸)與DNA探針(SEQ ID NO 1和(he)(he)2)一起(qi)孵育時，在存(cun)在或不存(cun)在互補模板的(de)(de)(de)情況下產生的(de)(de)(de)信號(hao)沒(mei)有差異(圖1c)。因(yin)此(ci)，不希(xi)望將包含天(tian)然(ran)DNA的(de)(de)(de)探針用于使用單鏈(lian)結(jie)合(he)(he)蛋白和(he)(he)/或重組(zu)酶(mei)的(de)(de)(de)DNA擴增反應(ying)。相比(bi)之下，顯示RNA(SEQ ID NO：3和(he)(he)4)或經修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)RNA(SEQ ID NO：5、6、7、8)、LNA(SEQ ID NO：9)和(he)(he)PNA(SEQ ID NO：10)探針僅(jin)在存(cun)在互補模板時產生信號(hao)增加。因(yin)此(ci)，RNA、經修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)RNA、LNA和(he)(he)PNA探針適(shi)合(he)(he)于使用單鏈(lian)結(jie)合(he)(he)蛋白和(he)(he)/或重組(zu)酶(mei)的(de)(de)(de)DNA擴增反應(ying)。

也說明了大腸桿菌重組酶RecA(新英格蘭Biolabs)對來自寡核苷酸探針的信號的影響(圖1d)。在含有70mM Tris-HCl pH 7.6、10mM MgCl₂、5mM DTT和(he)10mM ATP的(de)(de)緩(huan)沖液中，在(zai)存在(zai)或不存在(zai)100μg/ml RecA的(de)(de)情況下(xia)孵育寡核苷酸探(tan)針(zhen)，其濃(nong)度與圖(tu)1a和(he)圖(tu)1b中所(suo)使用(yong)的(de)(de)探(tan)針(zhen)的(de)(de)濃(nong)度類似。RecA的(de)(de)存在(zai)也導致(zhi)包含天然DNA的(de)(de)探(tan)針(zhen)的(de)(de)信(xin)號(hao)增(zeng)加(圖(tu)1d，DNA21[SEQ ID NO：2])。但(dan)是，所(suo)述(shu)增(zeng)加并(bing)沒有像采(cai)用(yong)T4UvsX所(suo)觀(guan)察到的(de)(de)增(zeng)加那(nei)樣高。然而，如采(cai)用(yong)T4UvsX所(suo)觀(guan)察到的(de)(de)，采(cai)用(yong)包含RNA(RNA21SEQ ID NO：4)、2’-氟(fu)RNA(2-氟(fu)RNA21，SEQ ID NO：8)、2’-O-甲基RNA(2-O-甲基RNA21，SEQID NO：6)、LNA(SEQ ID NO：9)或PNA(SEQ ID NO：10)的(de)(de)探(tan)針(zhen)孵育RecA并(bing)不導致(zhi)信(xin)號(hao)的(de)(de)任何顯著增(zeng)加。

此(ci)外，說明了(le)極高熱穩定性單(dan)鏈DNA結合蛋白(bai)——ET-SSB(新英格蘭Biolabs)對這些寡核(he)苷酸探(tan)(tan)針的(de)(de)影響(圖1e)。與(yu)如(ru)(ru)果在(zai)(zai)50℃以上的(de)(de)溫度(du)下(xia)(xia)使(shi)用則喪(sang)失活(huo)性的(de)(de)T4-gp32不同，ET-SSB在(zai)(zai)95℃仍保持其(qi)活(huo)性。因此(ci)，如(ru)(ru)果在(zai)(zai)高溫下(xia)(xia)進(jin)行的(de)(de)反(fan)應(例如(ru)(ru)聚合酶(mei)鏈式(shi)反(fan)應(PCR)或(huo)DNA測序)中需要單(dan)鏈結合蛋白(bai)，則ET-SSB是適合的(de)(de)選擇(ze)。在(zai)(zai)含(han)有20mM Tris-乙酸鹽pH 7.9、50mM乙酸鉀、10mM乙酸鎂和(he)(he)1mM DTT的(de)(de)緩沖液中，在(zai)(zai)存在(zai)(zai)或(huo)不存在(zai)(zai)50μg/ml ET-SSB的(de)(de)情況下(xia)(xia)孵育寡核(he)苷酸探(tan)(tan)針，其(qi)濃度(du)與(yu)圖1a和(he)(he)圖1b中所使(shi)用的(de)(de)探(tan)(tan)針的(de)(de)濃度(du)類似。ET-SSB的(de)(de)存在(zai)(zai)也(ye)導(dao)致包(bao)含(han)天然(ran)DNA的(de)(de)探(tan)(tan)針的(de)(de)信(xin)號顯(xian)著增加(圖1e，DNA21SEQ ID NO：2)。因此(ci)，僅(jin)包(bao)含(han)天然(ran)DNA的(de)(de)雙標記探(tan)(tan)針不適于包(bao)含(han)ET-SSB的(de)(de)反(fan)應。相比之(zhi)下(xia)(xia)，包(bao)含(han)RNA(RNA21，SEQ ID NO：4)、2’-氟RNA(2-氟RNA21，SEQ ID NO：8)、2’-O-甲基RNA(2-O-甲基RNA21，SEQ ID NO：6)、LNA(SEQ ID NO：9)或(huo)PNA(SEQ ID NO：10)的(de)(de)探(tan)(tan)針對ET-SSB更(geng)具抗性。因此(ci)，這些經修飾的(de)(de)探(tan)(tan)針更(geng)適于在(zai)(zai)單(dan)鏈結合蛋白(bai)如(ru)(ru)ET-SSB的(de)(de)存在(zai)(zai)下(xia)(xia)進(jin)行的(de)(de)反(fan)應。

實施例2——使用不同的寡核苷酸探針檢測基于鏈侵入的擴增(SIBA^TM)

測(ce)試了(le)(le)由天然DNA(SEQ ID NO：16)、2’-氟(fu)DNA(SEQ ID NO：17)和(he)LNA(SEQ ID NO：18)組成三種探(tan)針(zhen)，它們(men)均標記有熒光團和(he)猝滅劑。圖2a中概述了(le)(le)正(zheng)向(xiang)引(yin)物(wu)(SEQ ID NO：11)、反(fan)向(xiang)引(yin)物(wu)(SEQ ID NO：12)、探(tan)針(zhen)、鏈侵入寡核(he)苷酸(suan)(suan)(SEQ ID NO：15)和(he)靶核(he)酸(suan)(suan)序列(lie)(SEQ ID NO：20)的(de)(de)構(gou)象。設計所(suo)(suo)述探(tan)針(zhen)以與所(suo)(suo)述反(fan)向(xiang)引(yin)物(wu)(SEQ ID NO：12)的(de)(de)下游區(qu)域(yu)部分重疊，因此(ci)所(suo)(suo)述探(tan)針(zhen)與所(suo)(suo)述反(fan)向(xiang)引(yin)物(wu)結合于靶模板上的(de)(de)相同區(qu)域(yu)。

在如(ru)實施例(li)1中(zhong)(zhong)所述，在基于(yu)鏈侵(qin)入的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)反(fan)應(ying)中(zhong)(zhong)，使(shi)用探(tan)針、引物和鏈侵(qin)入寡核苷酸實時擴(kuo)增(zeng)(zeng)并檢(jian)(jian)測了人(ren)工靶(ba)DNA(SEQ ID NO：20)。只有(you)在含有(you)靶(ba)DNA的(de)(de)(de)(de)反(fan)應(ying)中(zhong)(zhong)獲得靶(ba)DNA的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)，而(er)無模板對照(NTC)不產生擴(kuo)增(zeng)(zeng)，如(ru)在使(shi)用SYBR Green I染(ran)料(liao)檢(jian)(jian)測的(de)(de)(de)(de)反(fan)應(ying)中(zhong)(zhong)所顯示的(de)(de)(de)(de)(圖2b)。也觀察(cha)到(dao)對依賴(lai)于(yu)模板的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)的(de)(de)(de)(de)特異性檢(jian)(jian)測，其中(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)使(shi)用SEQ ID NO 17和18的(de)(de)(de)(de)2’-氟(fu)RNA或LNA探(tan)針(圖2c和2d)。由于(yu)反(fan)向引物和探(tan)針之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)競爭(zheng)，在采用含有(you)2’-氟(fu)RNA或LNA的(de)(de)(de)(de)探(tan)針檢(jian)(jian)測的(de)(de)(de)(de)樣品中(zhong)(zhong)觀察(cha)到(dao)擴(kuo)增(zeng)(zeng)開(kai)始(shi)的(de)(de)(de)(de)稍許延遲。通過降低探(tan)針的(de)(de)(de)(de)濃度可進一步使(shi)這種競爭(zheng)最(zui)小(xiao)化。

相比之下(xia)(xia)，DNA探針(zhen)(SEQ ID NO：16)不能在靶(ba)模(mo)板的(de)存(cun)在下(xia)(xia)檢測(ce)任何擴增(圖2e)。這(zhe)是由于反應中(zhong)(zhong)存(cun)在的(de)單鏈結合蛋(dan)(dan)白(bai)即使在不存(cun)在復制子的(de)情況下(xia)(xia)也(ye)導(dao)致探針(zhen)信號的(de)顯著增加(jia)。因此，發現(xian)DNA探針(zhen)不適(shi)合用于在其試劑(ji)方案中(zhong)(zhong)包含(han)DNA結合蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)方法(fa)。

實施例3——使用RNA寡核苷酸探針對SIBA的多重檢測

在實施(shi)例1中所述(shu)的(de)(de)鏈侵(qin)入擴增反應條件下，同時納入標記有(you)Cy5和Iowa black的(de)(de)2’-氟RNA探針(zhen)(SEQ ID NO：25)或標記有(you)ROX和BHQ2的(de)(de)2’-氟RNA探針(zhen)(SEQ ID NO：17)。平行(xing)檢(jian)測艱難梭茵靶(ba)序列(lie)(SEQ ID NO：26)和人(ren)工靶(ba)序列(lie)(SEQ ID NO：20)的(de)(de)擴增。

用于擴增艱難梭茵基因的所述靶序列的正向引物、反向引物和鏈侵入寡核苷酸分別為SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。用于擴增所述人工靶標的正向引物、反向引物和鏈侵入寡核苷酸分別為SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15。分別使用10,000和10⁷個拷貝(bei)的(de)(de)艱(jian)(jian)難(nan)梭茵基因組DNA和人工靶DNA來進行反(fan)應(ying)(ying)(ying)。圖3a示出通過使(shi)用(yong)包含2’-氟(fu)RNA堿基的(de)(de)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)同時實現對DNA靶標的(de)(de)擴增的(de)(de)實時監測。使(shi)用(yong)標記(ji)有Cy5和Iowa black的(de)(de)2’-氟(fu)RNA探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(SEQ ID NO：25)檢(jian)測來自艱(jian)(jian)難(nan)梭茵的(de)(de)靶序列(lie)(lie)，同時使(shi)用(yong)標記(ji)有ROX和BHQ2的(de)(de)2’-氟(fu)RNA探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(SEQ ID NO：17)檢(jian)測所述人工靶序列(lie)(lie)。使(shi)用(yong)SYBR Green I(圖3b)或2’-氟(fu)RNA探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(圖3c)的(de)(de)熔解(jie)分析(xi)進一步確認(ren)，兩個反(fan)應(ying)(ying)(ying)都是特異性的(de)(de)并且在相同的(de)(de)反(fan)應(ying)(ying)(ying)管中(zhong)發(fa)生。2’-氟(fu)RNA探(tan)(tan)(tan)針(zhen)也可代替SYBR Green充(chong)當熔解(jie)分析(xi)的(de)(de)工具(ju)，因為所述探(tan)(tan)(tan)針(zhen)在反(fan)應(ying)(ying)(ying)中(zhong)不水(shui)解(jie)。

實施例4——用于增強信號產生的RNA探針的RNase H切割

在(zai)實(shi)施(shi)例1中(zhong)所述(shu)的(de)(de)(de)(de)鏈侵入DNA擴增(zeng)反應條件(jian)下，在(zai)存在(zai)或(huo)不(bu)存在(zai)其互(hu)補靶模板的(de)(de)(de)(de)情況下將天(tian)然(ran)(ran)DNA、經修飾的(de)(de)(de)(de)RNA、LNA和PNA探針(zhen)用或(huo)不(bu)用10μg/ml Thermococcus gammatolerans RNase H2孵(fu)育。如之前(qian)實(shi)驗所顯示的(de)(de)(de)(de)，所有(you)的(de)(de)(de)(de)探針(zhen)(除了包(bao)含天(tian)然(ran)(ran)DNA的(de)(de)(de)(de)那些(xie))在(zai)其靶序(xu)列存在(zai)時產生(sheng)信號(hao)的(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)(圖(tu)4a)。但是，在(zai)RNase H2存在(zai)的(de)(de)(de)(de)反應條件(jian)中(zhong)，檢測到2’-氟RNA探針(zhen)(SEQ ID NO：17)的(de)(de)(de)(de)信號(hao)的(de)(de)(de)(de)進一步增(zeng)加(jia)，這是由來自RNA探針(zhen)和靶DNA的(de)(de)(de)(de)雙鏈體上的(de)(de)(de)(de)RNA堿基(ji)的(de)(de)(de)(de)切割(ge)造成的(de)(de)(de)(de)。其他(ta)探針(zhen)DNA(SEQ ID NO：16)、PNA(SEQ ID NO：10)、LNA(SEQ ID NO：9)和2’-O-甲基(ji)RNA(SEQ ID NO：32)不(bu)被RNase H2切割(ge)。

在以上反應條(tiao)件下(xia)，在存(cun)在或(huo)不存(cun)在RNase H2的情況下(xia)也使用SEQ ID NO：24的2’-氟RNA探針(zhen)檢測艱(jian)難梭茵的靶序列的擴增(zeng)。圖4b示出了(le)RNase H2對于(yu)從(cong)探針(zhen)產(chan)生信(xin)號而言(yan)不是(shi)必需的。但是(shi)，RNase H2的存(cun)在進(jin)一步增(zeng)強信(xin)號。

實施例5——通過基于鏈侵入的擴增和RNA寡核苷酸探針檢測鼠傷寒沙門氏菌

使用2’-氟(fu)RNA探針(SEQ ID NO：30)檢測低拷貝的(de)靶(ba)DNA。在檢測鼠傷寒沙(sha)門氏茵(yin)靶(ba)基因(yin)的(de)試驗中，在實施例1中所述的(de)基于鏈(lian)侵(qin)入(ru)的(de)擴(kuo)增(zeng)反(fan)應條(tiao)件下納(na)入(ru)2’-氟(fu)RNA探針。用于擴(kuo)增(zeng)的(de)正向引物、反(fan)向引物和(he)鏈(lian)侵(qin)入(ru)寡(gua)核苷酸(suan)分別為SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和(he)SEQ ID NO：29。

通過使用系列稀釋的10⁵到10個拷貝的鼠傷寒沙門氏茵基(ji)(ji)因組DNA來(lai)評估(gu)所(suo)述測(ce)試的靈(ling)敏(min)度。所(suo)述探(tan)針能夠檢測(ce)最(zui)小為10個拷貝的基(ji)(ji)因組DNA樣(yang)品(圖5)。無模(mo)板對照(NTC)未產生任何(he)可檢測(ce)的信號(hao)，證實了2’-氟RNA探(tan)針是高(gao)度特異性的。

實施例6——具有連接于3’端的猝滅劑的RNA寡核苷酸探針不作為聚合酶延伸的底物

設計(ji)上述(shu)RNA探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)以與(yu)反向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)下游區域重(zhong)疊，所(suo)(suo)述(shu)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)因(yin)此可與(yu)反向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)競爭結(jie)合(he)靶序列。使用(yong)實施例(li)2中(zhong)所(suo)(suo)述(shu)的(de)(de)人工系統來研究SEQ ID NO：17的(de)(de)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)是否能(neng)夠作(zuo)為引(yin)發(fa)(fa)DNA擴增(zeng)的(de)(de)底(di)物(wu)(wu)。圖(tu)6a示出了所(suo)(suo)述(shu)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)由(you)于(yu)存(cun)在(zai)(zai)連接于(yu)3’端的(de)(de)猝滅劑(ji)而不作(zuo)為引(yin)物(wu)(wu)。靶序列的(de)(de)擴增(zeng)僅在(zai)(zai)互補的(de)(de)反向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)(SEQ ID NO：12)的(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)下發(fa)(fa)生(sheng)。當單獨(du)使用(yong)所(suo)(suo)述(shu)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)而無同(tong)源(yuan)的(de)(de)反向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)，或與(yu)非同(tong)源(yuan)反向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)或假(jia)反向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)SPU R-引(yin)物(wu)(wu)(SEQ ID NO：33)一起使用(yong)所(suo)(suo)述(shu)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)時，未發(fa)(fa)生(sheng)擴增(zeng)。此外，在(zai)(zai)無反向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)樣品中(zhong)，在(zai)(zai)存(cun)在(zai)(zai)RNase H2的(de)(de)情(qing)況下，未觀(guan)察到擴增(zeng)(圖(tu)6b)。這表(biao)明所(suo)(suo)述(shu)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)在(zai)(zai)擴增(zeng)過程中(zhong)是惰性的(de)(de)并且僅參(can)與(yu)靶擴增(zeng)子(zi)的(de)(de)結(jie)合(he)。

實施例7——具有雙引物/探針功能的RNA寡核苷酸

使用實施(shi)例2中(zhong)所述的人工系(xi)統研(yan)究(jiu)了包含2’-氟RNA的寡核苷(gan)酸是否能(neng)夠同時(shi)充當探針和(he)引(yin)物(圖7a)。SEQ ID NO：12的反(fan)向引(yin)物中(zhong)的部分或全部天(tian)(tian)然DNA核苷(gan)酸被2’-氟RNA替換以(yi)產(chan)生SEQ ID NO：13和(he)14的寡核苷(gan)酸。這些2’-氟RNA引(yin)物能(neng)夠擴(kuo)增(zeng)人工靶DNA，其擴(kuo)增(zeng)效率與天(tian)(tian)然DNA反(fan)向引(yin)物一(yi)樣好(圖7b)。所述在3’端保留一(yi)些天(tian)(tian)然DNA堿基的2’-氟RNA引(yin)物(SEQ ID NO：14)的效率稍微更高一(yi)些。

然(ran)后，推斷(duan)熒光團(tuan)和(he)猝滅劑可被(bei)添加(jia)到2’-氟RNA引(yin)物中以提供探(tan)針功能，只要(yao)3’端是游(you)離的用于延伸靶(ba)序列。進一步(bu)假定這樣的構象(xiang)仍然(ran)對DNA結合蛋白對探(tan)針信號(hao)的干擾具有抗性，因此仍允許對擴增的特異性檢(jian)(jian)測。用內部(bu)熒光團(tuan)和(he)5’猝滅劑(SEQ ID NO 19)標記所述2’-氟RNA引(yin)物。圖7c示出了在基于鏈侵(qin)入的擴增反(fan)應中SEQ ID NO：19能夠擴增并檢(jian)(jian)測人(ren)工靶(ba)DNA(SEQ ID NO：20)。

實施例8——嵌合的DNA-RNA雙標記探針對DNA結合蛋白的親和力

研究了通過修飾(shi)天(tian)然DNA探(tan)針(zhen)(zhen)的序列以部(bu)分地摻入RNA或經修飾(shi)的RNA堿(jian)基而提(ti)供(gong)對DNA結合蛋白的抗性的能力。雙標記(ji)探(tan)針(zhen)(zhen)、UvsX和T4-gp32的濃度與實施(shi)例(li)1中所(suo)使用的那些相同。

圖8示出了包含DNA和(he)RNA(SEQ ID NO：35、36、37)堿(jian)基(ji)，或(huo)DNA和(he)2’-氟(fu)RNA(SEQ ID NO：38、39、40)堿(jian)基(ji)，或(huo)DNA和(he)2’-O-甲基(ji)RNA(SEQ ID NO：41、42、43)堿(jian)基(ji)的(de)(de)(de)混(hun)合物的(de)(de)(de)雙(shuang)(shuang)(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)針也表現(xian)出對(dui)DNA結(jie)合蛋白UvsX和(he)T4-gp32的(de)(de)(de)抗性(xing)。由于添加(jia)(jia)UvsX或(huo)T4-gp32，結(jie)果顯示為(wei)熒光增(zeng)加(jia)(jia)的(de)(de)(de)倍(bei)數。抗性(xing)的(de)(de)(de)程度主(zhu)要(yao)取決(jue)于存在于所述(shu)雙(shuang)(shuang)(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)針中的(de)(de)(de)RNA堿(jian)基(ji)的(de)(de)(de)量(liang)。雙(shuang)(shuang)(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)針對(dui)DNA結(jie)合蛋白的(de)(de)(de)抗性(xing)隨著探(tan)針中存在的(de)(de)(de)RNA堿(jian)基(ji)的(de)(de)(de)量(liang)的(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)(jia)而增(zeng)加(jia)(jia)。

用含(han)有不同比例(li)的(de)(de)(de)(de)DNA-RNA、DNA-2’-氟RNA和(he)2’-O-甲(jia)基(ji)(ji)RNA的(de)(de)(de)(de)21堿基(ji)(ji)雙(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)(tan)針(zhen)孵育(yu)UvsX(圖(tu)8a)。在(zai)所有的(de)(de)(de)(de)情況下，含(han)有5個(ge)RNA或(huo)2’-氟RNA或(huo)2’-O-甲(jia)基(ji)(ji)RNA堿基(ji)(ji)和(he)15個(ge)DNA堿基(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)21堿基(ji)(ji)雙(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)(tan)針(zhen)比僅含(han)有DNA堿基(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)20堿基(ji)(ji)雙(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)(tan)針(zhen)對UvsX的(de)(de)(de)(de)抗性(xing)(xing)更強。采用T4-細茵噬茵體gp32(單鏈(lian)結(jie)合蛋(dan)白(bai))進行了類似的(de)(de)(de)(de)實驗(圖(tu)8b)。同樣(yang)，對DNA結(jie)合蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)抗性(xing)(xing)主要取決(jue)于(yu)雙(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)(tan)針(zhen)中存在(zai)的(de)(de)(de)(de)RNA堿基(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)量。含(han)有5個(ge)RNA或(huo)2’-氟RNA或(huo)2’-O-甲(jia)基(ji)(ji)RNA堿基(ji)(ji)和(he)15個(ge)DNA堿基(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)21堿基(ji)(ji)雙(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)(tan)針(zhen)足以表現出對T4-gp32的(de)(de)(de)(de)抗性(xing)(xing)。因(yin)此，嵌(qian)合的(de)(de)(de)(de)DNA-RNA或(huo)DNA-2’-氟-RNA或(huo)DNA-2’-O-甲(jia)基(ji)(ji)RNA雙(shuang)標(biao)記(ji)探(tan)(tan)針(zhen)也適合用于(yu)包含(han)DNA結(jie)合蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)反應。

進一(yi)步研究了嵌合(he)(he)探(tan)(tan)針中(zhong)所包含的RNA堿基(ji)(ji)的數目與能夠結(jie)合(he)(he)單鏈DNA的蛋白對探(tan)(tan)針信號的破壞的抗性之間的關(guan)系。圖8c示(shi)出了采用(yong)包含不同比例的DNA-RNA的其他一(yi)系列21堿基(ji)(ji)雙標記(ji)探(tan)(tan)針孵育UvsX的結(jie)果(guo)。圖8d示(shi)出了采用(yong)相(xiang)同系列的探(tan)(tan)針以及(ji)采用(yong)gp32孵育的結(jie)果(guo)。如實施例1中(zhong)的描述進行測定。發現(xian)在(zai)DNA探(tan)(tan)針中(zhong)至少(shao)約(yue)20％的堿基(ji)(ji)被RNA堿基(ji)(ji)取代(dai)(參見，例如，探(tan)(tan)針DNA 17+RNA 4)的情況下觀察到對探(tan)(tan)針信號干擾的一(yi)致(zhi)減少(shao)。