專利名稱：檢測核酸的等長雙鏈特異性探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測核酸的等長雙鏈特異性探針。
(2)背景技術自1985年MuLlis等發明了聚合酶鏈式反應(PCR)以來，PCR技術已經廣泛地應用于核酸研究的各個領域，在臨床診斷方面的應用也日益增多。但是PCR產物容易造成交叉污染，從而可能導致假陽性結果，而且不能進行基因定量檢測。1995年出現的實時熒光PCR技術很好地解決了PCR的定量問題，閉管操作簡化了步驟，很好地避免了PCR產物的交叉污染，提高了檢測的特異性。
目前的實時熒光PCR檢測技術，可分為加入熒光染料嵌入DNA雙鏈和加入熒光標記的探針兩種。前者無法區分特異和非特異PCR擴增，PCR擴增中引物二聚體的形成極大地降低了檢測的靈敏度，這些缺點限制了非探針型實時熒光PCR技術的實際應用。目前常用的探針包括分子信標、TaqMan探針、蝎子引物等。由于存在探針識別，因此增加了實驗的可靠性，但是存在探針設計復雜，制造成本高等缺點。
(3)發明內容本發明的目的在于提供一種實驗設計簡單、操作方便，能有效地保證實驗特異性和靈敏度的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針。
檢測核酸的等長雙鏈特異性探針包括兩條堿基數目相等且反向互補配對的寡核苷酸鏈，其一端有2～6個堿基完全不匹配，兩條鏈中的一條鏈上標記熒光劑，另一條鏈上標記淬滅劑。
所說的等長雙鏈特異性探針的兩條鏈等長，一般設計為15～30個堿基，一般不超過30個堿基。標記熒光劑的鏈與靶序列100％匹配。兩條鏈的一個末端存在堿基完全不配對，完全不匹配的堿基長度最好在2～10堿基之間。探針的退火溫度一般在50～70℃之間。另外，熒光劑和淬滅劑可以標記于探針的頂端，也可以標記在探針的中間位置，但是最好標記在同一對互補的堿基上，只有這樣才能達到最佳的淬滅效果。設計的探針內盡量避免DNA折疊和二級結構。如果探針標記在探針的頂端，要避免在5’端使用G，如果熒光劑和淬滅劑標記于探針的頂端，則其另一端的堿基設計為完全不配對。
兩條寡核苷酸的反向互補使熒光劑和淬滅劑靠近，兩者發生能量傳遞，熒光被淬滅，此時探針不發熒光，在PCR反應過程中，變性的高溫使探針兩條鏈分開而發出熒光；退火階段若沒有靶序列存在，探針重新形成雙鏈結構而不發熒光。此時若有互補的靶序列擴增時，由于探針的兩條鏈末端有部分堿基完全不匹配，而靶序列與熒光劑標記鏈互補的堿基相對較多，形成的結構更加穩定，因而探針的兩條鏈分開，與靶序列形成更穩定的結構，熒光劑發出熒光，沒有結合的多余探針仍然保持雙鏈結構。在延伸階段由于溫度升高，探針從靶序列上解離，引物得以繼續延伸，PCR反應繼續進行。
等長雙鏈特異性探針存在以下優點1.探針設計簡單，幾乎與普通PCR引物設計相同，實驗成功率高；2.探針制備簡單，單條鏈上是單一熒光物質的修飾，相對比較簡單，為防止PCR過程中探針的延伸，必須在3’端進行磷酸化封閉；3.特異性高，因為只有當靶序列與熒光劑標記鏈互補的堿基數大于熒光劑、淬滅劑分別標記的雙鏈的互補堿基數時，熒光劑標記鏈與靶序列結合才較穩定，從而提高核酸雜交分析的反應特異性。如果靶序列發生突變或PCR產生了非特異擴增產物，等長雙鏈特異性探針將恢復雙鏈狀態，因而不發熒光。
(4)


圖1為等長雙鏈特異性探針在不同溫度條件下熒光信號的變化。在圖1中，橫坐標為溫度T/℃，縱坐標為熒光強度F。
圖2為O型口蹄疫等長雙鏈熒光特異性探針實時熒光PCR檢測。在圖2中，橫坐標為循環數Cycle，縱坐標為熒光強度F。曲線1O型口蹄役陽性；曲線2陰性對照。
圖3為兩條探針結合時熒光信號的變化。在圖3中，橫坐標為時間t/min，縱坐標為熒光強度F。曲線1加與Fam標記探針不互補的3’端經淬滅劑Dabcyl標記的探針；曲線2加3’端經淬滅劑Dabcyl標記的與Fam標記探針反向互補的探針。
(5)具體實施方式
1.等長雙鏈特異性探針在不同溫度條件下的熒光信號的變化室溫下，等長雙鏈特異性探針形成穩定的雙鏈結構，不發熒光，在50℃之前，熒光強度基本保持不變，兩條鏈沒有變性，當溫度高于50℃，熒光逐漸增強，說明兩條鏈逐漸解鏈，在60～70℃，熒光值迅速上升，說明解鏈加速，達到最大值后熒光趨于平緩，之后溫度過高會使熒光強度下降(參見圖1)。
2.用等長雙鏈特異性探針進行實時PCR反應監測等長雙鏈特異性探針用于監測PCR反應，兩條鏈的3’端都必須用磷酸基團進行封閉，使其不能作為引物延伸。如果PCR反應過程中沒有擴增序列，探針保持雙鏈結構，不發熒光；如果有擴增序列，由于熒光劑標記鏈與靶序列是100％匹配，PCR退火階段探針的兩條鏈分開，熒光劑遠離淬滅劑，探針發出熒光。隨著延伸階段溫度的升高，探針從擴增片段上解離出來，引物得以延伸，保證了PCR反應的順利進行。通過在PCR反應過程的復性階段檢測熒光的變化，可以在PCR的每個循環動態地檢測目的片段的有無，并進行定量(參見圖2)。
以下實施例將對本發明作進一步的說明實施例1兩條探針結合時熒光信號的變化在20μL的反應體系中，加入2.5mM MgCl2，10×PCR緩沖液和5’端經Fam標記的探針0.8μM，在室溫下測定熒光強度2min，加3’端經淬滅劑Dabcyl標記的與上述Fam標記探針反向互補的探針，另一管中加與Fam標記探針不互補的3’端經淬滅劑Dabcyl標記的探針各1.0μM，每10s測定一次熒光強度(參見圖3)。兩探針由上海博亞公司合成，序列為Fam-5’CCCTTCTCAGATCCCGAGTGTC3’；5’CTGTGTCGGGATCTGAGAAGGGG3’-Dabcyl；5’AACGCTGAAGGGCATCCTTAG 3’-Dubcyl。結果表明在含標記熒光劑的體系中，只有加入了堿基序列互補的標記淬滅劑的寡核苷酸鏈時，兩條鏈才會發生復性反應，熒光被淬滅，而末端有2～6個堿基完全不匹配不影響復性反應。加入無關序列，由于兩條鏈不能結合發生復性反應，因而熒光無法被淬滅。
實施例2等長雙鏈熒光特異性探針在不同溫度下熒光強度的變化在20μL的反應體系中，加入2.5mM MgCl2，10×PCR緩沖液和5‘端經Fam標記的探針0.2μM，3’端經淬滅劑Dabcyl標記的與上述Fam標記探針反向互補的探針0.25μM，兩探針由上海博亞公司合成，序列為Fam-5’CCCTTCTCAGATCCCGAGTGT C3’；5’CTGTGTCGGGATCTGAGAAGGGG 3’-Dabcyl；混合均勻后室溫放置5min，待兩條鏈充分復性后置于實時熒光PCR儀上，從40℃開始，每隔5s升高1℃，每度均采集熒光信號。如圖1所示，室溫下，等長雙鏈特異性探針形成穩定的雙鏈結構，不發熒光，在50℃之前，熒光強度基本保持不變，兩條鏈沒有變性，當溫度高于50℃，熒光逐漸增強，說明兩條鏈逐漸解鏈，在60～70℃，熒光值迅速上升，說明解鏈加速，達到最大值后熒光趨于平緩，之后溫度過高使熒光強度下降。
實施例3等長雙鏈熒光特異性探針用于O型口蹄疫實時熒光PCR檢測
采用Trizol法提取口蹄疫病毒的RNA，反轉錄成cDNA。
實時熒光PCR檢測所用引物和探針均由上海博亞公司合成。引物序列為5’ACCAATCCAACGGCGTACCACAA3’；5’GTGGCTTTGATGGCACCGTAGTT3’所用探針為等長雙鏈熒光特異性探針，序列為FAM-5’ACTGTTTACAACGGGAACTGCAA 3’；5’AACGTGTTCCCGTTGTAAACAGT 3’-DABCYL。
PCR反應總體積為20μL，內含2.5mM MgCl2，10×PCR緩沖液，1.8U Taq酶，250μMdNTP，引物總濃度均為0.4μM，Fam標記探針0.2μM，Dabcyl標記探針0.25μM，經94℃預變性10min，再94℃變性30s，50℃ 30s，72℃ 30s，45個循環。熒光信號強度在退火階段采集。結果如圖2所示。
權利要求
1.檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于包括兩條堿基數目相等且反向互補配對的寡核苷酸鏈，所說的兩條鏈等長，末端有2～6個堿基完全不匹配，在其中的一條鏈上標記熒光劑，另一條鏈上標記淬滅劑。
2.如權利要求1所述的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于所說的等長雙鏈特異性探針的兩條鏈設計應超過15個堿基。
3.如權利要求1所述的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于標記熒光劑的鏈與靶序列100％匹配。
4.如權利要求1所述的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于兩條鏈在末端存在堿基完全不配對，完全不匹配的堿基長度為2～10個堿基。
5.如權利要求1所述的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于熒光劑和淬滅劑標記于探針的頂端，或標記在探針的中間位置。
6.如權利要求1所述的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于熒光劑和淬滅劑標記于兩條鏈互補堿基附近的幾個堿基上。
7.如權利要求6所述的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于熒光劑和淬滅劑標記在同一對互補的堿基上。
8.如權利要求1所述的檢測核酸的等長雙鏈特異性探針，其特征在于探針的兩條鏈3’端用化學基團封閉，使其不能作為引物延伸。
全文摘要
涉及一種檢測核酸的等長雙鏈特異性探針。包括兩條堿基數目相等且反向互補配對的寡核苷酸鏈，兩條鏈等長，末端有2～6個堿基完全不匹配，兩條鏈上分別標記熒光劑和淬滅劑。其優點是設計簡單，幾乎與普通PCR引物設計相同，實驗成功率高；制備簡單，單條鏈上是單一熒光物質的修飾，為防止PCR過程中探針的延伸，必須在3’端進行磷酸化封閉；特異性高，因為只有當靶序列與熒光劑標記鏈互補的堿基數大于熒光劑、淬滅劑分別標記的雙鏈的互補堿基數時，熒光劑標記鏈與靶序列結合才較穩定，提高核酸雜交分析的反應特異性。如果靶序列發生突變或PCR產生了非特異擴增產物，探針將恢復雙鏈狀態，不發熒光。
文檔編號C12P19/00GK1570137SQ0313293
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月22日 優先權日2003年7月22日
發明者陳亮, 邵寒娟, 王宇, 林濤, 郭小玲 申請人:廈門大學