一種新型細胞色素cyp3a4酶特異性探針反應及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種木脂素類化合物戈米辛A，其可作為細胞色 素CYP3A4酶的特異性探針底物，用于定量檢測不同來源生物樣本及體內細胞色素CYP3A4 酶活性。
【背景技術】
[0002] 細胞色素P450酶（CytochromeP450,CYP)為一類亞鐵血紅素一硫醇鹽蛋白的超 家族，是人體內最重要的I相藥物代謝酶，催化多種內源和外源物質的代謝。該超家族包 含多個亞家族，如CYP1A2,CYP2D6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2E1,CYP3A4 和CYP3A5 等， 參與約80%以上的上市藥物的代謝轉化，其中經CYP3A亞家族代謝的藥物約占50%(Nat RevDrugDiscov. 2005, 4 (10) : 825-833)。人體中主要表達四種CYP3A亞型，分別為CYP3A4、 CYP3A5、CYP3A7及CYP3A43。其中CYP3A4在成人體內總細胞色素CYP酶中含量最高，在體 內各組織器官廣泛的分布，相比于人群中表達量低、表達頻率低的CYP3A5, 一直被認為是成 年個體的最主要的CYP單酶。由于CYP3A5亞家族與CYP3A4具有83%的高度同源性[Curr DrugMetab. 2008,9:20 - 33]，CYP3A4和CYP3A5兩個亞家族通常具有相似的底物識別性， 即某一底物若被CYP3A4催化代謝，也極可能同時被CYP3A5亞型酶代謝。但已有研究發現 CYP3A代謝的底物在這兩種單酶的催化性質不盡相同。在人類肝臟中，CYP3A被認為是最 主要的CYP3亞型，且在女性中有更高的表達量。CYP3A5存在基因多態性，其在肝臟中表達 量的個體差異可從〇%到50% ;CYP3A5的表達還存在種族差異，僅三分之一的高加索人（白種 人）和一半以上的非洲裔美國人表達CYP3A5。由此可見，由于遺傳因素和非遺傳因素的影 響，CYP3A4和CYP3A5亞型酶，無論是其表達量、催化功能，還是代謝貢獻率都會存在很大的 個體差異性，這對于CYP3A介導代謝的藥物在體內的暴露水平會產生不可忽視的影響。
[0003] 目前，已經發現的或已在體外、體內研究中廣泛應用的CYP3A亞家族探針底物，如 咪達唑侖（midazolam)、硝苯地平（nifedipine)、睪酮（testosterone)等，都同時是CYP3A4 和CYP3A5的特異性底物，利用這些探針底物對細胞色素CYP酶進行的評估結果反映的就是 細胞色素CYP3A亞家族各單酶的催化能力的總和。然而，近期研究發現，細胞色素CYP3A5 在某些個體中顯現的催化能力甚至與細胞色素CYP3A4的催化能力相當（DrugMetab Dispos. 2002, 30:883-891)，此時利用目前已有的探針底物則會混淆細胞色素CYP3A4和 3A5的催化能力，從而無法清晰地分析細胞色素CYP3A4對特定藥物的代謝清除貢獻率。
[0004] 此外，在大鼠（細胞色素CYP3A1、細胞色素CYP3A2)、狗(細胞色素CYP3A12、細胞 色素CYP3A26)，兔（細胞色素CYP3A6)，豬（細胞色素CYP3A29)，猴（細胞色素CYP3A64)等 哺乳動物體內，也高表達細胞色素CYP3A4的同功酶，這些酶之間的底物有非常廣泛的重疊 性。利用細胞色素CYP3A4的高選擇性探針底物也可在體外活性測定方面實現對不同種屬 中細胞色素CYP3A4的同功酶的評價與考察。
[0005] 目前，CYP3A4酶活性的體外評價體系主要包括重組單酶、哺乳動物的亞細胞組分 、新鮮分離的肝細胞、肝切片、肝灌流等（ToxicologyinVitro2006, 135-153)，其中已經 商品化的重組細胞色素CYP3A4單酶主要來自于細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌 建立的克隆表達體系，而亞細胞組分主要包括微粒體、細胞漿及S9成分。采用這些標準化 的評價體系，結合相應的輔因子(如：NADPH等）和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清 除或產物生成速率，對上述各種體系中表達的CYP3A4酶活性進行表征。
[0006] 此外，采用靜脈注射或口服的方式，使待測人或動物服用一定劑量的探針底物，在 一定時間內，搜集血漿和尿液樣本，測定其中原型化合物或其代謝產物的含量，以此來作為 整體水平細胞色素CYP3A活性的評價指標。Lin(Pharmacogenetics2001, 11 (9) :781-791) 等人使用咪達唑侖作為體內探針，給健康成年人靜脈注射或口服一定劑量之后，發現服藥4 小時后的血漿中咪達唑侖濃度與血藥濃度曲線下面積（AUC)存在較好的相關性，可以用來 對機體對細胞色素CYP3A介導藥物代謝的清除能力進行判斷。Furuta(US6905839B2)等人 采用內源性皮質醇作為細胞色素CYP3A的內源性體內探針，通過測定志愿者血漿樣品中皮 質醇的濃度和尿液樣品中代謝產物6P-羥基皮質醇的濃度，采用尿中6P-羥基皮質醇的 累積量與血漿皮質醇AUC的比值反映體內CYP3A活性大小，發現該指標可以很好的表征體 內細胞色素CYP3A的活性，進而用于不同人體的CYP3A活性標定，對于作為CYP3A底物的已 上市藥物，可作為指導該類藥物的個體給藥劑量調整的重要依據。
[0007] 綜上所述，特異性地評估體內外細胞色素CYP3A4代謝酶活性及CYP3A4對特定藥 物代謝清除的貢獻率的關鍵在于選擇高特異性的探針藥物。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供一類木脂素類化合物以及其在檢測CYP3A4酶活性中的用 途及其檢測方法，具體為戈米辛A可作為CYP3A4酶的高特異性探針底物，用于定量測定不 同來源生物樣本及體內CYP3A4的酶活。與目前已報道的CYP3A探針/標準底物不同，戈米 辛A具有高特異性表征CYP3A4酶活性的能力，CYP3A5催化活性極微弱可忽略不計。因此 能夠高特異性的評價機體或組織中CYP3A4酶對藥物的代謝處置能力，對體內外藥物代謝 研究具有重要意義。
[0009] 本發明具體提供了一種新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物，其特征在于：該 探針底物為戈米辛A(GomisinA)，是一種天然木脂素類成分，該化合物的結構如圖1所示。
[0010] 本發明還提供了所述新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的應用，其特征在 于：采用所述新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物檢測CYPP3A4酶活性：通過定量定時 測定相應代謝產物的生成速率或底物的減少速率實現CYP3A4酶活性的檢測。
[0011] 戈米辛A僅能被CYP3A4選擇性代謝并生成一個主要代謝產物8-羥基戈米辛A，其 余代謝酶包括CYP3A5均難以催化其代謝，8-羥基化反應符合米氏動力學，其單位時間內的 轉化速率可用于定量測定不同生物體系(包括重組單酶體系、人及動物細胞/組織制備液 等）中細胞色素CYP3A4酶的活性。
[0012] 采用重組細胞色素CYP單酶，肝微粒體孵育體系進行考察，通過相關性分析，特異 性抑制實驗，重組單酶代謝反應，以及酶反應動力學幾方面的證據，證明戈米辛A可特異性 的經CYP3A4酶代謝(如圖2所示)，生成8-羥基戈米辛A，高效液相圖譜見圖3,原形及代謝 產物的質譜圖見圖4,代謝通路與代謝產物結構見圖5。進一步采用各種哺乳動物的新鮮提 取的肝微粒體、原代培養肝細胞、肝切片、肝灌流等代謝評價體系進行考察，發現該代謝 反應具有非常良好的特異性。
[0013] 作為高特異性的細胞色素CYP3A4的探針底物，戈米辛A可以用來檢測細胞色素 CYP3A4酶活性，尤其適合用于對細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌克隆表達體系生 產的CYP3A4重組酶、多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、S-9等制備物中CYP3A4的活性 標定，以及體內CYP3A4活性的標定。
[0014] 本發明還提供了戈米辛A與已有CYP3A4探針底物睪酮、硝苯地平、咪達唑侖在代 謝酶選擇性上的優勢比較：戈米辛A作為特異性探針底物，在CYP3A4和CYP3A5兩種重組 單酶孵育體系中，通過相應代謝產物的酶反應動力學分析(如圖6所示)，證明戈米辛A在 CYP3A4與CYP3A5中的最大反應速度（Vm)之比顯著高于睪酮、硝苯地平和咪達唑侖(如圖7 所示)，表明CYP3A4對戈米辛A的催化效能遠遠高于CYP3A5的催化效能，即高選擇性的被 CYP3A4代謝，而CYP3A5的催化貢獻極微弱可忽略不計。
[0015] 本發明所述新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的應用，其特征在于，采用所 述新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物在體外檢測生物樣本中細胞色素CYP3A4酶活 性，其優選的測定方法及條件為：
[0016] --體系中以戈米辛A中作為探針底物；底物濃度范圍為1-500iiM;
[0017] -在pH7. 4且具有輔因子NADPH或其生成體系的孵育體系中，反應溫度為 10-60°C之間，優選37°C為最優反應時間；
[0018]--反應時間為5-60min;確保獲得相應羥化代謝產物達到定量限且底物轉化率 低于20%時終止反應；
[0019] -通過檢測單位時間內底物減少量或產物生成量，即底物減少速率或產物生成 速率，作為CYP3A4酶活性的評價指標，實現細胞色素CYP3A4酶活性的檢測。
[0020] 其中檢測底物減少量或其對應羥化產物生成量的定量檢測方法為紫外吸收光譜、 質譜、放射性同位素示蹤技術、熒光激發光譜、蒸發光散射或電化學光譜檢測。所有檢測器 包括紫外吸收光譜檢測器、質譜、放射性同位素示蹤技術、蒸發光散射或電化學光譜檢測器 中的一種或多種串聯。
[0021] 本發明所述新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物還可以檢測體內細胞色素 CYP3A4酶活性，其優選的測定方法及條件為：
[0022] --通過靜脈注射或口服的方式，使得待測的哺乳動物服用0. 1至500mg/kg體重 的戈米辛A或其藥物制劑；
[0023]--在〇至24小時內選取時間點，收集待測動物的血漿樣本；
[0024] -測定底物減少速率或產物生成速率，作為細胞色素CYP3A4酶活的評價指標。
[0025] 本發明還提供了含有所述新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的藥物制劑， 其特征在于：所述藥物制劑含有戈米辛A。
[0026] 本發明還提供了含有所述新型細胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的藥物組合 物，其特征在于：所述藥物組合物由戈米辛A與任何可藥用載體/成分所組成。
[0027] 選用本發明所述CYP3A4酶的特異性探針底物檢測CYP3A4酶活性具有以下突出優 勢：
[0028] (1)高特異性：戈米辛A可被目標CYP3A4高特異性地代謝成為相應的羥化產物。
[0029] (2)高安全性：戈米辛A的毒性極低，大鼠口服半數致死量（LD5tl)為980mg/kg，在 使用劑量下底物及其代謝產物均安全無毒，適合開發成為體內探針藥物。
[0030] (3)易于制備：底物戈米辛A是五味子科植物莖葉及果實中富含的一種天然化學 成分，來源簡單且易于分離純化。
[0031] (4)檢測靈敏：該化合物為具有聯苯環辛烯母核結構的化合物，有良好的紫外吸 收特性（230~280nm)及質譜離子化效果，可通過常規分析手段（如LC-UV、LC-ESI-MS等） 對其定量分析。