p53R175H特異性核酸適配體及其篩選方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物醫學領域，具體地，設及一種RNA適配體的篩選及應用，尤其設及 突變蛋白的特異RNA適配體篩選方法和應用。
【背景技術】
[0002] p53蛋白是已知的重要腫瘤抑制蛋白。p53蛋白存在有多個功能結構域，在p53蛋 白中間的核屯、區域，約為100-300位氨基酸處，有DNA結合結構域。該個結構域依據序列特 異性結合實現DNA與之結合。該個結構域被認為是實現p53功能最重要的結構域，因為之 后的研究進一步證實，多數與p53突變相關的腫瘤均是由于p53在該個核屯、結構域中發生 無義突變所致，而有超過一半的人類腫瘤與p53蛋白的突變有關。隨著測序技術的發展，在 所有已知的人類癌癥中的p53的突變種類就超過了 10000個。其中的95%W上的突變是發 生在上述的DNA結合結構域中。75%的突變是單個位點無義突變，而不是缺失、插入或者是 移位。所W我們一般認為在大多數的癌癥中，P53主要是在核屯、結構域中W單個位點突變 的形式而存在。
[0003] p53的突變體P53R17甜已知在小鼠胚胎成纖維（ME巧細胞和胸腺細胞中不行使 p53野生型蛋白的功能，并且在肺癌細胞中存在抗調亡的獲得性功能。同時，P53R175H比其 他的任何一種p53蛋白的突變體具有更強的細胞群落形成能力，且發現在前列腺細胞中的 遷移能力也得到進一步加強。在臨床研究當中，因為P53R17甜突變而造成的癌癥患者中， 其臨床治療效果也是最不理想的。
[0004] 目前對于p53突變蛋白的治療手段有限，效果較差。并且藥物用量高，毒副作用 大。而解決方法除了開發新藥外，祀向治療成為了最主要的方法。此外，對于治療后復發的 病人，目前缺乏有效的祀向診斷措施，難W判斷腫瘤復發的部位和位置，使臨床醫生選擇合 理的治療方案非常困難。目前，缺乏高度特異的祀向介質，是制約針對p53蛋白突變的祀向 診斷和治療發展的瓶頸。
[0005] 核酸適配體，是與抗體功能類似的單鏈寡核巧酸分子，可特異性識別包括金屬離 子、有機小分子、多膚、蛋白質、細胞等多種祀標。它具有親和力與抗體相當甚至更高、分子 量小、無免疫原性、合成方便且批次差異小、化學性質穩定等優點。因此核酸適配體在生物 監測、疾病診斷和祀向治療方面具有廣闊的前景。目前，世界上尚無能夠特異性針對突變蛋 白的特異RNA適配體的報道。

【發明內容】

[0006] 為了克服現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種具有高度特異性，分 子量小，化學性質穩定，易于保存和標記的可用于識別突變蛋白的核酸適配體及其衍生物。 本發明還相應地提供所述核酸適配體的篩選方法與應用。
[0007] 為了解決上述技術問題，一方面，本發明提供了一種核酸適配體（在本文中也被 稱為P53R175H-APT)，所述核酸適配體的核巧酸序列包含W下RNA序列：
[000引 5 ' -GCAAUGGUACGGUACUUCCAUUAGCGCAUUUUAACAUAGGGUGCCAAAAGUGCACGCUACUUUG-3 '(SEQIDNO. 1)
[0009] 在本發明的另一個方面中，作為對上述技術方案的改進，可選擇地，對上述核酸適 配體的核巧酸序列上的某一位置進行磯酸化、甲基化、氨基化、琉基化或同位素化。
[0010] 在本發明的另一個方面中，作為對上述技術方案的改進，可選擇地，在上述核酸適 配體的核巧酸序列上連接巧光物質，放射性物質、治療性物質、生物素、地高辛、納米發光材 料或酶標記。
[0011] W上所述的經部分取代或經過修飾后的所述核巧酸序列，都具有原核酸適配體基 本相同或類似的分子結構、理化性質和功能，都可應用于識別P53R17甜蛋白并部分回復其 野生型功能。
[0012] 作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種核酸適配體，所述核酸適配體的核 巧酸序列包括W下S種序列中的任意一種：
[0013] (1)與前述所有技術方案中所述核酸適配體的核巧酸序列的同源性在60%W上 的序列（例如可將前述核酸適配體序列刪除或增加部分互補的核巧酸）；
[0014] (2)與前述所有技術方案中所述核酸適配體的核巧酸序列能夠進行雜交的序列；
[0015] (3)由前述所有技術方案中所述核酸適配體的核巧酸序列反轉錄的DNA序列。
[0016] 作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種核酸適配體衍生物，所述衍生物是 前述所有技術方案中所述核酸適配體的核巧酸序列的骨架衍生出的硫代磯酸醋骨架，或者 是前述所有技術方案中所述核酸適配體改造成的相應膚核酸。
[0017]W上不論是衍生出的核酸適配體還是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸適配體 基本相同或類似的分子結構，理化性質和功能，即都可應用于識別P53R17甜蛋白并部分回 復其野生型功能。
[0018] 另一方面，本發明還提供了一種如前述核酸適配體的篩選方法，包括W下驟：
[0019] (1)合成W下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物：
[0020] 隨機單鏈DNA文庫；TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(N25) CAAAAGTGCACGCTACTTTG
[0021] 5,端引物；5' -TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(沈QIDNO. 2)
[0022] 3,端引物；5, -CAAAGTAGCGTGCACTTTTG(SEQIDNO. 3)
[002引 似體外轉錄；W單鏈DM文庫為模板，進行PCR擴增制備體外轉錄模板。將W上 PCR產物投入體外轉錄體系中，經過一段時間解育，純化步驟，得到用于篩選的RNA適配體 文庫；
[0024] (3)固相偶聯蛋白：將p53野生型蛋白偶聯在N服活化的瓊脂糖珠子上。將 P53R17甜蛋白偶聯在N服活化的磁珠上，用于下步差別競爭SELEX篩選步驟；
[00巧](4)差別競爭SELEX篩選；將步驟（3)中得到的偶聯有特定蛋白的珠子加入步驟 似中得到的RNA適配體文庫，經過37°C2小時解育，通過磁性分離只保留磁珠，并將依舊 結合在磁珠上的RNA適配體純化、反轉錄，制備下一輪差別競爭SELEX篩選的文庫；
[0026] (5)多輪篩選；將步驟4中得到的文庫替代步驟（1)中的隨機文庫，并重復上述步 驟（2)~（4)的過程；每一輪篩選后通過化ISA方法檢測文庫分子對P53R17甜結合能力， 直至出現與祀標分子有高親和力的RNA適配體后，將所得RNA適配體投入下游功能研究。
[0027] 第=方面，本發明還提供了一種前述核酸適配體或者核酸適配體衍生物在制備檢 測含有P53R175H的腫瘤的試劑盒、分子探針或祀向介質中的應用。
[0028] 第四方面，本發明還提供了一種前述核酸適配體或者核酸適配體衍生物在設計和 制備治療含有P53R17甜的腫瘤的藥物中的用途
[0029] 與現有技術相比，本發明的優點在于；本發明的篩選方法可W用于篩選突變蛋白 特異的核酸適配體。將蛋白野生型與突變型分別偶聯于不同的固相介質，讓兩種蛋白競爭 性地與文庫中適配體結合，在結合過程中使得野生型與突變型的差別得W放大，進而篩選 出與突變蛋白親和力更強的核酸適配體。本方法解決了微小差異祀標特異性低的問題，避 免了單一篩選方法帶來的非特異性結合的不斷積累，篩選效率更高；通過篩選得到的核酸 適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性且能夠合成，分子量小，可W對不同部位進 行修飾和取代，且更穩定，易于保存。
[0030] 采用本發明的核酸適配體經實驗驗證，其對含有p53野生型的細胞無親和力， 對P53R17甜有較高親和力，并可W通過與祀標的結合，部分回復P53野生型功能，降低 P53R17甜細胞的生長速率、促進調亡、減慢遷移速率，具有一定的治療效果。
[0031] 更具體地，本發明提供W下各項：
[0032] 1.特異性結合p53突變體蛋白P53R175H的核酸適配體，所述核酸適配體包含如 SEQIDNO. 1所示的序列。
[0033] 2.根據1所述的核酸適配體，其在SEQ ID NO. 1的某一位置處被修飾，如磯酸化、 甲基化、氨基化、琉基化或同位素化。
[0034] 3.根據1所述的核酸適配體，其還連接有巧光標記物、放射性物質、治療性物質、 生物素、地高辛、納米發光材料或酶標記。
[00巧]4.核酸適配體，其包含W下S種序列中的任意一種：
[0036] (1)與根據1-3中任一項所述的核酸適配體的序列的序列同源性在60%W上的序 列；
[0037] (2)能夠與根據1-3中任一項所述的核酸適配體的序列進行雜交的序列；或
[003引 （3)由根據1-3中任一項所述的核酸適配體的序列反轉錄的序列。
[0039] 5.根據1-3中任一項所述的核酸適配體的衍生物，所述衍生物具有由根據1-3中 任一項所述的核酸適配體的序列的骨架衍生出的硫代磯酸醋骨架，或者是由根據1-3中任 一項所述的核酸適配體改造成的相應的膚核酸。
[0040] 6.用于篩選特異性結合p53突變體蛋白P53R17甜的核酸適配體的方法，所述方法 包括W下步驟：
[0041] (1)提供隨機單鏈DNA文庫，所述DNA文庫包含由下式表示的隨機單鏈DNA; TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(N25)CAAAAGTGCACGCTACTTTG，其中N25 表示中 間的25個氨基酸的隨機序列，并且提供如SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3所示的一對引物； [004引 似W所述DNA文庫為模板，使用上述引物進行PCR擴增，W所述PCR的產物作為 體外轉錄模板進行體外轉錄，從而獲得用于篩選的RNA適配體文庫；
[0043] (3)將野生型p53蛋白偶聯在N服活化的瓊脂糖珠子上，并且將突變體蛋白 P53R17甜偶聯在N服活化的磁珠上；
[0044] (4)將步驟（3)中得到的偶聯有p53的珠子和偶聯有P53R17甜的磁珠加入步驟 (2)中得到的RNA適配體文庫中進行解育，解育后對磁珠進行磁性分離，對結合在所述磁珠 上的RNA適配體進行純化和反轉錄W制備用于進一步篩選的DNA文庫；
[004引 妨用步驟（4)中得到的DNA文庫代替步驟（1)中的文庫來作為步驟似中的模 板，并重復步驟（2)至（4)，在每一輪篩選后比較所篩選到的RNA適配體與p53和P53R17甜 的結合能力，直至獲得特異性結合P53R17甜的RNA適配體。
[0046] 7.根據6所述的方法，其中使用ELISA方法來比較所篩選到的RNA適配體對p53 和P53R17甜的結合能力。
[0047] 8.根據1-4中任一項所述的核酸適配體，或根據5所述的核酸適配體的衍生物，在 制備用于結合P53R17甜蛋白的試劑中的用途。
[0048] 9.根據1-4中任一項所述的核酸適配體，或根據5所述的核酸適配體的衍生物，在 制備藥物中的用途，所述藥物用于治療由p53突變體P53R17甜引起的腫瘤。
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