一種雙嵌段分子探針及其快速檢測核酸方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于核酸檢測領域，涉及一種雙嵌段分子探針及其快速檢測核酸方法。
【背景技術】
[0002]核酸快速檢測技術在醫療診斷，食品安全和環境監控領域有廣泛的應用前景。當前核酸檢測方法主要采用蛋白酶(例如核酸聚合酶、連接酶和外切酶)作為信號擴增工具。這些方法雖然能夠達到較低檢測限，但是這些方法操作較為復雜，耗時，耗力，成本相對較高。催化發夾組裝是一個無酶的信號放大策略，常被用于增強核酸雜交信號。催化發夾組裝利用亞穩態的發夾探針來組裝Y型核酸結構。它能夠將核酸的功能和結構的信息進行編碼，而且只有較低的背景信號，這些特點使得它在核酸檢測中具有更大的應用前景。實際上，催化發夾組裝已經常常與其他檢測手段相結合，例如化學發光電化學技術，電化學和熒光檢測技術。這些技術雖然具有較高的靈敏度，但是它們往往需要使用先進復雜的儀器，這些不足在一定很大程度上已經限制了它們的廣泛應用。
[0003]金納米粒比色檢測技術靈敏度高，只需要簡單的儀器，甚至可以直接用肉眼觀察。金比色測定法通過結合催化發夾組裝信號放大策略，可實現超靈敏的核酸快速檢測。這是因為這種結合可以將核酸識別可以簡單的轉化為顏色變化。這些快算檢測方法通常需要制備巰基修飾的核酸探針。然而，這種探針制備方法通常比較耗時(20-40小時)。此外，探針修飾巰基還增加了檢測成本。

【發明內容】

[0004]針對現有技術中所存在的不足，本發明的目的在于將基于polyA與發夾探針結合的雙嵌段探針的催化發夾組裝的信號放大作用與納米金比色檢測技術相結合，構建一種核酸的快速檢測方法。該方法具有特異性高，操作簡單，檢測迅速等優點。
[0005]本發明所采取的技術方案是:
[0006]一種用于快速檢測DNA的試劑盒，其包括至少3條雙嵌段分子探針:雙嵌段分子探針1、雙嵌段分子探針2和雙嵌段分子探針3 ;所述雙嵌段分子探針1從5’到3’依次包括:啟動區、發夾結構區和polyA區；其中，雙嵌段分子探針1的啟動區及發夾結構區5’莖區的部分序列與目標DNA的部分序列互補，雙嵌段分子探針2的啟動區與雙嵌段分子探針1的發夾結構區的部分序列互補，雙嵌段分子探針3的啟動區與雙嵌段分子探針2的發夾結構區的部分序列互補。
[0007]所述雙嵌段分子探針1的啟動區及發夾結構區5’莖區序列與雙嵌段分子探針3的發夾結構3’莖區及環區的部分序列互補；所述雙嵌段分子探針2的啟動區及發夾結構區5’莖區序列與雙嵌段分子探針1的發夾結構3’莖區及環區的部分序列互補；所述雙嵌段分子探針3的啟動區及發夾結構區5’莖區序列與雙嵌段分子探針2的發夾結構3’莖區及環區的部分序列互補。
[0008]所述三條雙嵌段分子探針的發夾結構區打開后，可將三條雙嵌段分子探針組裝成Y型核酸結構。
[0009]作為優選的，所述雙嵌段分子探針的啟動區至少含有4個堿基。
[0010]進一步優選的，所述雙嵌段分子探針的啟動區含有6?8個堿基。
[0011]作為優選的，所述雙嵌段分子探針的polyA區至少含有5個腺嘌呤。
[0012]進一步優選的，所述雙嵌段分子探針的polyA區含有15?20個腺嘌呤。
[0013]所述試劑盒中還含有納米金膠溶液、核酸雜交緩沖液。
[0014]一種快速檢測DNA的方法，包括以下步驟:
[0015]1)將雙嵌段探針加到樣品液中，室溫反應，使催化發夾探針組裝反應充分；
[0016]2)步驟1)中反應完成后，取反應液與納米金溶液混合，靜置，待顯色反應完全；
[0017]3)根據顏色反應結果判斷樣品是否含有目標核酸。
[0018]步驟3)的判斷方法為:(1)當納米金溶液由紅色變成藍色，表明樣品液中含有目標DNA ;或者用顯色反應液在650納米和524nm處的0D值比值表示，若比值在0.26以上，說明此樣品中含有目標核酸，檢測得到0D值比值與核酸濃度正相關。
[0019]下面以某一特定目標DNA序列的檢測為例，對本發明的技術方案作進一步的說明:
[0020]目標DNA，從5’至3’依次含有y*、b*、x*、a*區段，根據該目標DNA設計三條雙嵌段分子探針DHP1，DHP2和DHP3，其中:
[0021]DHP1 從 5’ -3’ 依次包括 a、x、b、y、z*、c*、y*、b*、x* 區段和 polyA 結構區，其中a區段為啟動區，x至x*區段為發夾結構區。目標DNA的a*、x*、b*、y*區分別與DHP1的
a、x、b、y區段互補。
[0022]DHP2 從 5’ _3，依次包括 b、y、c、z、x*、a*、z*、c*、y* 區段和 polyA 結構區，其中b區段為啟動區，y至y*區段為發夾結構區。b、y、c、z區分別與DHP1的b*、y*、c*、z*區段互補。
[0023]DHP3 從 5’ _3，依次包括 c、z、a、x、y*、b*、x*、a*、z* 區段和 polyA 結構區，其中c區段為啟動區，z至z*區段為發夾結構區。c、z、a、X區分別與DHP1的c*、z*、a*、x*區段互補。
[0024]當樣品中含有目標DNA時，目標DNA的a*區與DHP1的a區結合，觸發了啟動區介導的鏈置換反應，依次打開雙嵌段分子探針2、雙嵌段分子探針3的頸環結構并且與之結合，最終產生大量的帶有三個polyA尾巴的Y型核酸構造物。在鹽的作用下，該核酸構造物的polyA能夠與多個納米金結合使之聚集，并且最終使得納米金由紅色變成藍色。
[0025]本發明的有益效果是:
[0026](1)本發明所述的雙嵌段探針具有發夾結構和polyA，無需修飾，制備成本低；
[0027](2)在目標核酸序列存在時，目標序列通過級聯的鏈置換反應依次與三條雙嵌段探針(DHP1，DHP2和DHP3)結合，生成大量的Y型核酸結構，該Y型核酸帶有3個單鏈polyA尾巴，多聚腺嘌呤(polyA)序列對金納米粒子具有高親和力，在鹽存在下，該Y型核酸結構能夠與納米金結合，使得納米金溶液由紅色變成藍色，從而達到快速檢測的目的；
[0028](3)本發明所述的核酸檢測方法具有較高的靈敏度，對核酸的檢測限為0.0lfM，檢測過程方便、迅速，可用于實地現場檢測；
[0029](4)本發明所述的核酸檢測方法具有很好的特異性，能夠識別單堿基突變的核酸序列。
【附圖說明】
[0030]圖1為雙嵌段分子探針示意圖；
[0031]圖2為快速檢測核酸的示意圖；
[0032]圖3為探針濃度對檢測的影響；
[0033]圖4為反應時間對檢測的影響；
[0034]圖5鹽濃度對檢測核酸的影響；
[0035]圖6為核酸檢測的回歸曲線；
[0036]圖7為特異性實驗結果圖；
[0037]圖8為細菌DNA檢測結果。
【具體實施方式】
[0038]一、雙嵌段探針的制備
[0039](1)雙嵌段探針的設計、合成與純化:
[0040]設計3條雙嵌段分子探針:雙嵌段分子探針1、雙嵌段分子探針2和雙嵌段分子探針3 ;所述雙嵌段分子探針1從5’到3’依次包括:啟動區、發夾結構區和polyA區；其中，雙嵌段分子探針1的啟動區與目標DNA的部分序列互補，雙嵌段分子探針2的啟動區與雙嵌段分子探針1的發夾結構區的部分序列互補，雙嵌段分子探針3的啟動區與雙嵌段分子探針2的發夾結構區的部分序列互補，三條雙嵌段分子探針的發夾結構區打開后，可將三條雙嵌段分子探針組裝成Y型核酸結構。所述雙嵌段探針的結構如圖1所示，采用固相法合成，高效液相法進行純化；
[0041](2)雙嵌段探針溶液配制:所述雙嵌段探針采用超純水溶解制成濃縮貯備液，然后用磷酸鹽緩沖液(50mM Na2HP04, 1M NaCl, pH 6.8)稀釋到合適濃度；
[0042](3)探針退火:所述探針溶液于95°C溫育5min，然后緩慢冷卻室溫，置于4°C保存；
[0043]二、快速檢測核酸的方法
[0044]1)將上述制備的三條雙嵌段分子探針加到核酸樣品液中，室溫(18?27°C )反應120min，使催化發夾組裝反應充分；
[0045]2)取15-25 μ L的上述反應液與250-350 μ L的納米金溶液混合，靜置3min，待顯色反應完全；
[0046]3)將2)中得到顯色反應液加入石英比色皿，掃描200-800納米處紫外可見光吸收；
[0047]4)計算650納米與524納米處吸收值的比值，若比值在0.26以上，說明此樣品中含有目標核酸。
[0048]快速檢測核酸的方法的示意圖如圖2所示。
[0049]下面舉例介紹一下本發明方法的技術原理:
[0050]在有目標核酸序列存在下，目標序列與雙嵌段分子探針1的5’端單鏈啟動區結合，觸發了啟動區介導的鏈置換反應，依次打開雙嵌段分子探針2、雙嵌段分子探針3的頸環結構并且與之結合，最終產生大量的帶有三個polyA尾巴的Y型核酸構造物。在鹽的作用下，該核酸構造物的polyA能夠與多個納米金結合使之聚集，并且最終使得納米金由紅色變成藍色。該顏色的變化程度可以直接肉眼觀察，也可以用650納米和524nm處0D值比值表示。檢測得到0D值比值與核酸濃度在一定范圍正相關。
[0051]下面以特異性目標DNA的檢測為例，對本發明作進一步的說明。
[0052]實施例1
[0053]一、雙嵌段探針的制備
[0054](1)雙嵌段探針的設計與合成
[0055]根據目標DNA序列設計雙嵌段探針，目標DNA的核酸序列如下所示:
[0056]y* b* x* a*
[0057]5’ -GCACTA-CTCCCT-AACATC-TCAAGC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0058]設計好的雙嵌段探針，用NUPACK軟件分析其二維結構的自由能，若自由能為負值則說明探針可行。將設計好的雙嵌段探針交由核酸合成公司進行合成，合成好的探針用高效液相法純化，并且用質譜檢測合成的探針是否與設計的一致。合成成功的探針凍干后保存于-20°C。具體序列如下:
[0059]DHP1:
[0060]a X b y z* c* y* b* x*
[0061 ] 5’-GCTTGA-GATGTT-AGGGAG-TAGTGC-TCCAAT-CACAAC-GCACTA-CTCCCT-AACATC-AAAAAAAAAAAAAAA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0062]DHP1 從 5’ _3，依次包括 a、x、b、y、z*、c*、y*、b*、x* 區段和 polyA 結構區，其中a區段為啟動區，x至x*區段為發夾結構區。目標DNA的a*、x*、b*、y*區