一組用于口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量pcr檢測的特異性引物和探針的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測方法技術領域，具體涉及一組用于口腔中幽門螺桿菌的實 時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探針。
【背景技術】
[0002] 1983年，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，簡稱Hp)被澳大利亞的Warren和 Warshail發現，引起了大量學者的關注。Krajden于1989年首次從胃炎患者牙菌斑中分 離培養出Hp，幽門螺桿菌感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃腺癌、胃粘膜相關性淋巴瘤有著密切 的聯系。大量學者研究發現患有消化性疾病患者口腔Hp與其胃粘膜內的形態學和生物學 特征相似，具有同源性。
[0003]以前大量的研究都集中在胃部的幽門螺桿菌。但是唾液、口腔潰瘍、舌背、口腔腫 瘤中也存在大量的Hp，口腔是Hp胃外重要的儲存場所，口腔有可能是胃內Hp感染和復發的 來源。因此研究口腔中Hp的感染情況具有重要的臨床意義。Song等認為，Hp作為條件致 病菌，可存在于健康人和消化道疾病患者的口腔內，當環境改變時會導致疾病的發生。同時 我們可以推測，如果口腔內Hp可以根除、口腔健康可以很好改善，胃內Hp感染可能更容 易預防、徹底根除。
[0004]流行病學調查顯示，Hp感染在世界各地均較為常見，具有很高的發病率，因此迫切 需要一種快速、特異的檢測方法。目前診斷Hp感染的方法很多，包括尿素酶檢測、細菌培 養、組織學染色、血清Hp抗體檢測等，而針對口腔Hp的診斷檢測方法并不多。Hp可產生大 量的尿素酶，利用尿素酶試驗可檢測口腔內Hp，口腔內有多種細菌尿素酶陽性，如唾液鏈球 菌等，容易產生假陽性，特異性低，因此此種方法的應用難以讓人信服。細菌的分離培養是 檢測Hp的金標準，且可進行藥敏試驗，指導臨床用藥，但是口腔內Hp的數量較少且口腔菌 群復雜，微生物種類多，檢測敏感性低，陽性檢出率低。PCR技術作為一種分子生物學工具， 可以選擇性體外擴增DNA或RNA片段，特異性強、敏感性高，用于牙菌斑、唾液Hp的檢測，不 受菌量少、是否為活菌的因素影響，已廣泛應用于臨床和科研。近年來發展起來的實時熒光 定量PCR(Fluorescence quantitativePCR)技術從常規PCR定性檢測邁上量化的臺階， 實現了PCR技術從定性到定量的飛躍，避免了傳統PCR定量鑒定中交叉污染的問題，它相對 于常規PCR技術先進、操作簡便，實現了實時監測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有 靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點。

【發明內容】

[0005] 本發明目的在于設計一組用于定量測定口腔中幽門螺桿菌含量的特異性引物和 探針序列，建立一種能廣泛應用于幽門螺桿菌檢測的快速、靈敏、特異性好的熒光定量PCR 檢測的方法。本發明采用基因克隆技術，將幽門螺桿菌16S核糖體RNA基因（16srRNA)片 段插入到載體PMD18-T中，獲得含有16srRNA基因片段的重組質粒，以此作為標準品。根 據幽門螺桿菌16s rRNA的基因片段編碼基因序列設計并合成一組特異性引物和探針，優化 PCR反應條件，建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進 行評估。
[0006] 本發明提供一組用于口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物 和探針，所述特異性引物和探針的核苷酸序列為（1)_(3)中的一種： (1) 、上游引物：5'_ TGGCGCACGGGTGAGT-3' ； 下游引物：5' -CCAATGGCTATCCCAAACTAAGA-3'； 探針：5' - ACGCATAGGTCATGTGC-3' ； 所述引物和探針擴增的目標核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 2; (2) 、與（1)所述序列互補的序列； (3) 、將（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至數個堿基或刪減一至數個堿基得 到的序列。
[0007] 經實驗驗證，將（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至數個堿基或刪減一 至數個堿基得到的序列也能很好的擴增上述目標核苷酸序列。
[0008] 優選地，所述探針的5'端熒光報告基團是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3'端標記的 是熒光淬滅基團TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0009] 本發明還提供口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包 括權利要求1所述的引物和探針。
[0010] 本發明的第三個目的是提供上述特異性引物和探針、試劑盒在定量檢測口腔中幽 門螺桿菌含量中的應用。
[0011] 本發明的第四個目的是提供口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，步 驟如下： (1)制備標準品：將幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段插入到載體pMD18-T中，獲得含 有幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段的重組質粒，以此作為標準品；所述幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段參見序列表中SEQ ID No. 1的第6-353位核苷酸序列； (2 )標準曲線繪制； (3) 使用權利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標準品采用相同的反應體 系進行實時熒光PCR擴增； (4) 通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行干酪乳桿菌的快速定量檢測。
[0012] 優選地，所述幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段是通過以下引物擴增得到的： 上游引物為 5'- TGGCGGCGTGCCTAATACA-3' ； 下游引物為 5' - GTTGCTGCTTCAGGGITT-3'。
[0013] 優選地，步驟（3)中所述引物和探針的用量均為1.6 iil。
[0014] 優選地，步驟（3)中所述實時熒光PCR擴增的反應條件為：94°C預變性2分鐘， 94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號，40個循環。
[0015] 本發明提供用于對幽門螺桿菌進行定性、定量檢測的引物和探針，通過提取待檢 測樣品的RNA反轉錄得到的cDNA，也可以通過提取幽門螺桿菌的基因組DNA，結合實時熒光 定量PCR檢測技術，可達到準確定量待測標本中幽門螺桿菌含量的目的。本發明所提供的 引物和探針可對口腔中的幽門螺桿菌含量進行定性、定量分析，對判斷口腔中幽門螺桿菌 活性菌的含量以至于后續研究胃內Hp感染具有重要意義，本發明將在微生物臨床檢測領 域發揮重要作用。應用本發明的引物和探針能夠快速、準確、靈敏、特異性好的定量檢測待 測標本中幽門螺桿菌的含量。
【附圖說明】
[0016] 附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。下面結合附圖以及具體實施方案對 本發明做更詳細闡述。在附圖中： 圖1為引物和探針體系優化實驗結果；其中，a代表引物為1. 6 y 1，探針為1. 6 y 1 ;b 代表引物為l.〇y 1，探針為1.6y 1 ;c代表引物為l.Oy 1，探針為0. 8y 1 ;d代表引物為 2. 0 y 1，探針為0. 8 y 1 ;e代表引物為1. 6 y 1，探針為0. 8 y 1 ;f代表引物為2. 0 y 1，探針為 1. 〇 y 1 ;g代表引物為1. 〇 y 1，探針為〇. 8 y 1 ;h代表引物為1. 0 y 1，探針為1. 0 y 1 ;i代表 引物為2. 0 y 1，探針為1. 6 y 1 ; 圖2為靈敏度實驗結果；其中，a代表質粒濃度分別為1. 00X 108coPies/ml、b代表 質粒濃度為l.〇〇X107copies/ml、c代表質粒濃度為1.00X 106copies/ml、d代表質粒濃 度為1.00X 105COpies/ml、e代表質粒濃度為1.00X 104COpies/ml、f代表質粒濃度為 1. 00X 103copies/ml、g代表質粒濃度為1. 00X 102copies/ml和陰性對照； 圖3為特異性實驗結果；其中出現標準擴增曲線的為幽門螺桿菌質粒，未出現標準擴 增曲線的大腸埃希菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡 萄球菌、糞腸球菌、乙型溶血性鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、福氏志賀菌、腦膜炎 奈瑟菌、陰性對照； 圖4為幽門螺桿菌標準曲線。
【具體實施方式】
[0017] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工 程(上海）股份有限公司合成和完成。
[0018] 實施例1 16s rRNA基因標準品的制備 要建立實時熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應包含 高度保守、特異的序列，要保證反應的高特異性。16S rRNA基因廣泛存在于原核生物中， 具有很高的保守性。本發明采用幽門螺桿菌16S rRNA基因作為靶序列。本實施例主要 采用PCR技術擴增幽門螺桿菌的16S rRNA基因，利用基因重組技術將其連接到質粒載體 PMD18-T中，構建出重組質粒pMD18-T-HP16S，并進行相應的PCR鑒定和測序鑒定，最后經定 量作為待建立方法的標準品，為下一步的方法及評估奠定基礎。
[0019] -、模板DNA的制備 提取幽門螺桿菌(標準菌株）基因組DNA，用作16S rRNA基因PCR擴增的模板： (1) 取lml菌懸液，8000r/min離心5分鐘，棄上清液； (2) 加入10%蔗糖的TE緩沖液400 y 1懸浮菌液沉淀，混勻后加入20mg/ml的溶菌酶 20 y 1，37°C作用 45min ; (3) 加入30yl 10%SDS和 3yl lOmg/ml 蛋白酶 K，55°C 水浴 lh; (4) 加入500 y 1的酸/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1)混勾，12000r/min離心10min ; (5) 取上清，加入500 y 1的氯仿/異戊醇(體積比24:1)混勾，12000r/min離心10min ; (6) 取上清，加入50 y 1 3M NaAc和800 y 1的無水乙醇，-20°C靜置30min，離心去上 清； (7) 沉淀用70%的乙醇洗滌，干燥； (8) 溶于50 y 1雙蒸水中，-20°C保存。
[0020] 二、16S rRNA基因片段的PCR擴增 1、引物的設計與合成 本發明通過對NCBI數據庫中幽門螺桿菌16S rRNA基因全序列進行生物信息學比對分 析，選取適合設計引物和探針的保守片段序列(序列表SEQ ID No. 1中第6-353位核苷酸序 列）為革G目標，應用P