專利名稱：用maoC基因制備聚羥基鏈烷酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及一種用maoC基因制備聚羥基鏈烷酸酯(以下所述的PHA)的方法。更具體而言，本發明涉及一種maoC基因，一種具有烯酰-CoA水合酶活性的蛋白質，以及一種采用含有maoC基因的重組載體和含有PHA合成基因的重組載體轉化的微生物制備PHA的方法。
背景技術：
PHA是一種聚酯型化合物，當微生物體內存在過量的碳而缺少其它營養物質，如磷、氮、鎂和氧時，PHA在微生物體內積聚以充當碳源。由于PHA具有與源自汽油的合成聚合物相似的物理性質，并且具有完全的生物降解性，因此其被認為可作為從前所使用的合成塑料的替代物。
通常，將PHA分成含幾個碳原子的短鏈PHA(SCL-PHA)和含較多碳原子的中鏈PHA(MCL-PHA)。與SCL-PHA相比，MCL-PHA的物理性質更接近于合成的聚合物，于是對MCL-PHA的研究就積極地展開了。在微生物體內形成PHA需要多種酶能夠將微生物代謝物轉變成PHA單體的酶以及能夠從PHA單體合成PHA聚合物的PHA合成酶。已知的能提供PHA單體的酶包括發現于Aeromonas sp.微生物和Pseudomonas sp.微生物的(R)-特定的烯酰-CoA水合酶，和在E.coli和Pseudomonas sp.微生物中發現的3-酮酯酰-ACP還原酶(Fukui et al.，J. Bacteriol.，180667-73，1998；Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184193-8，2000；Taguchi et al.，FEMS Microbiol.Lett.，176183-90，1999；Ren et al.，J. Bacteriol.，1822978-81，2000；and Park et al.，FEMS Microbiol.Lett.，214217-22，2002)。
同時，有報道說MCL-PHA合成酶基因是從Pseudomonas sp.微生物克隆得到的，而且MCL-PHA能夠用該基因轉化的重組微生物合成得到(Qi etal.，FEMS Microbiol.Lett.，157155-62，1997；Qi et al.，FEMS Microbiol.Lett.，16789-94，1998；Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150303-9，1997；WO 01/55436；USP 6,143,952；WO 98/54329；and WO 99/61624).而且還有報道，即利用一種重組的E.coli也能夠產生MCL-PHA，該重組的E.coli缺失脂肪酸降解途徑中的酶FadB(Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150303-9，1997)。
另一方面，由于有報道說當采用缺失fadB基因的重組E.coli時，FadB的同源酶YfcX也能夠提供PHA單體(Snell et al.，J. Bacteriol.，1845696-5705，2002)，還預言了除YfcX以外還存在能提供PHA單體的酶系。由于采用缺失fadB基因的重組E.coli能夠有效得制備MCL-PHA，因此仍然繼續努力去發現在缺失fadB基因的重組E.coli中提供PHA單體的酶，但至今未見具體的結果。
因此，仍需要在E.coli中找到新的能提供PHA單體的酶。

發明內容
為了在E.coli中找到了提供PHA單體的新酶，本發明人進行了深入細致的研究，結果發現，一種由E.coli基因maoC表達的蛋白質能夠作為在缺失fadB基因的重組E.coli中提供PHA單體的酶，該蛋白質的其它功能還不清楚。本發明即建立在這一基礎上。
本發明的目的是提供一種maoC基因、一種maoC蛋白質、一種含有maoC基因的重組載體和一種用重組載體轉化的微生物。
本發明的另一個目的是提供用maoC基因制備中鏈PHA的方法。
為達到上述目的，本發明的一個方案是提供一種maoC基因，其編碼由SEQ ID NO1表示的MaoC蛋白。
本發明的另一個方案提供了一種maoC基因，其具有DNA序列為SEQID NO2，并編碼能提供合成MCL-PHA的單體的蛋白質。
本發明又一個方案提供了含有maoC基因的重組載體。
本發明的再一個方案提供了一種MaoC蛋白，其具有氨基酸序列SEQID NO1，并顯示烯酰-CoA水合酶活性。
本發明的進一步方案提供了用重組載體轉化的微生物。
本發明中的微生物優選缺失fadB基因并含有PHA合成酶基因。并且，微生物優選用含有PHA合成酶基因的重組載體轉化，或含有插入染色體的PHA合成酶的微生物。
本發明的PHA合成酶優選為phaC。
本發明的另一個方案提供了一種制備中鏈PHA(MCL-PHA)的方法，其包含的步驟為在含有C6-10的碳源培養基中培養轉化的微生物，并得到含有6-10個碳原子單體的MCO-PHA。
本發明還提供了MCL-PHA，其通過如上所述的方法制備而得，以使3-羥基辛酸酯(3HO)和3-羥基癸酸酯(3HD)的每一種在MCL-PHA總單體中的含量都超過30％。
Tsuge et al.報道了烯酰-CoA水合酶與Pseudomonas sp.中的PHA合成有關(Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184193-8，2000)。為了在E.coli中找到提供PHA單體的新酶，本發明進行了尋找在E.coli中被表達且具有的氨基酸序列與報道的烯酰-CoA水合酶具有高度同源性的蛋白質的研究。結果發現了具有SEQ ID NO1的MaoC蛋白顯示了34％的同源性，并發現具SEQID NO2的基因編碼該蛋白。直到目前，MaoC蛋白的確切功能還不清楚，只是報道了每一個maoC和maoA基因含有一個操縱子(operon)(Steinebach etal.，Eur.J. Biochem.，237584-91，1996)。
本發明人預言發現的蛋白質將顯示PHA合成中烯酰-CoA水合酶的活性。為了確認該預言，克隆了編碼maoC蛋白的MaoC基因。換言之，用E.coli染色體為模板，利用基于E.coli的基因序列合成的寡核苷酸作引物進行PCR，而將maoCEc基因放大(Blattner et al.，Science 2771453-14，1997)。用SacI/XbaI消化放大的maoCEc基因并將其克隆至p10499A的重組載體中，從而構建p10499MaoC載體。將EcoRV/ScaI消化p10499MaoC的基因片段插入PvuII/DraI消化的pACYC184中，由此建立構建了用于表達maoC基因的pACYC104MaoC重組載體。
用EcoRV/SspI消化能夠表達PHA合成酶基因的p10499613C2載體，然后插入EcoRV消化的pBBR1MCS中，由此構建了含有PHA合成酶基因的pMCS104613C2重組載體。
根據Jeong and Lee的方法，即將缺失fadB基因的突變體E.coli WB101中的maoC基因去除，由此得到既缺失fadB基因又缺失maoC基因的突變體E.coli WB 106(Jeong and Lee.，Appl. Environ.Microbiol.，684979-85，2002)。
只缺失fabB基因的突變體E.coli WB101能夠從具有10個碳原子的癸酸酯制備MCL-PHA，甚至該突變體是用含有PHA合成酶基因的pMCS104613C2轉化的，而當fadB基因和maoC基因都缺失的突變體E.coliWB106，僅用pMCS104613C2轉化，則不能從具有10個碳原子的癸酸酯制備MCL-PHA。然而，用pMCS104613C2和pACYC104MaoC轉化至E.coliWB106而得到的E.coli W3110能夠從具有10個碳原子的癸酸酯制備MCL-PHA。
盡管對于培養E.coli的培養基不作特別限制，但優選使用Luria-Bertani(LB)培養基(酵母提取液5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)，該培養基通常被用于培養E.coli.。根據本發明制備的PHA，其得率比用從前的方法高，而且得到了單體3-羥基己酸酯(3HHx)，3-羥基辛酸酯(3HO)和3-羥基癸酸酯(3HD)，尤其是3HO和3HD占單體的大多數。因此，根據本發明制備的PHA比以前方法制備的PHA質量高。
為了測定maoC基因表達的蛋白質的酶活性，構件了表達MaoC蛋白的重組載體pTac99MaoCH，該MaoC蛋白用6個組氨酸作標記，并通過重組載體pTac99MaoCH得到了MaoC-His6-Tag。以巴豆酰-CoA作為底物，測定MaoC-His6-Tag的烯酰-CoA水合酶活性為47.6U/mg。如這里所用，“1U”的定義為每分鐘轉移1μmol巴豆酰-CoA的酶活性的一個單位。


圖1是含有maoC基因的重組載體p10499MaoC的基因圖譜；圖2是含有maoC基因的重組載體pACYC104MaoC的基因圖譜；圖3是含有PHA合成酶基因的重組載體pMCS104613C2的基因圖譜；圖4是含有maoC基因的重組載體pTac99MaoCH的基因圖譜。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明進行詳細闡述。然而，對于本領域技術人員而言，這些實施例只是用于舉例說明，本發明的范圍并不受限于此。
實施例1用maoC基因制備產生PHA的重組E.coli
構建缺失fadB基因和maoC基因的突變體E.coli，一種含有E.colimaoC基因的重組載體，和含有MCL-PHA合成酶基因的重組載體。用這些重組載體制得用于制備MCL-PHA的重組E.coli。
實施例1-1缺失fadB基因和maoC基因的突變體E.coli的制備根據常規的方法，用λ噬菌體的紅色操縱子將maoC基因從E.coli中去除(Jeong and Lee，Appl.Environ.Microbiol.，684979-85，2002)。
換言之，缺失fadB基因的突變體E.coli WB101是用含有λ噬菌體的紅色操縱子的載體pTrcEBG轉化的(Jeong and Lee，Appl.Environ.Microbiol.，684979-85，2002)，并加入1mM IPTG以誘導用pTrcEBG轉化的E.coliWB101中的紅色操縱子的表達，并用該E.coli制備有電穿孔能力的細胞。E.coli WB101是通過將fadB基因從E.coli W3110(KCTC 2223)中去除而得到的(Park et al.，Enzyme Micro.Technol.，3362-70，2003)。
同時，由于maoC基因5’端的60 bp和3’端的60 bp含有類似于抗氯霉素基因的5’端的60 bp和3’端的60 bp的DNA序列，用抗氯霉素基因替代maoC基因能夠產生缺失maoC基因的突變體。基于該目的，用pACYC184(New England Biolab，USA)作為模板，引物為MaoCdelf(SEQ ID NO3)和MaoCdelb(SEQ ID NO4)進行30次循環的PCR，其包括在94℃變性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸1分鐘，由此得到PCR產物。5’-atgcagcagttagccagtttcttatccggtacctggcagtctggccggggccgtagccgtagcacttcactgacaccctc-3’(SEQ ID NO3)5’-ttaatcgacaaaatcaccgtgctgcctggccaccagcgtcagaattgaataacttattcaggcgtagcacc-3’(SEQ ID NO4)將PCR片段克隆至如上所述制備的可被電穿孔的細胞中，由此得到缺失fadB基因和maoC基因的突變體E.coli WB106。
實施例1-2p10499A和p10499613C2的構建用含有PHA合成酶基因(Matsusaki et al.，J. Bacteriol.，1806459-67，1998)的Pseudomonas sp.61-3的染色體DNA(JCM 10015)作為模板，引物為phaC2Ps-1(SEQ ID NO5)和phaC2Ps-2(SEQ ID NO6)進行30次循環的PCR，其包括在94℃變性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸2分鐘，由此得到PCR產物。5’-cgcggatccaataaggagatatctagatgagagagaaaccaacgccg-3’(SEQ ID NO5)5’-cggatccccgggtaccgagctcgaattctcagcgcacgcgcacgtaggta-3’(SEQ ID NO6)通過瓊酯糖凝膠電泳分析PCR產物，1.7 kb基因片段對應于phaC2Ps基因。
然后，放大gntT104啟動子使PHA合成酶基因繼續被表達，用E.coliW3110(ATCC 39936)的染色體基因作為模板，引物為gntT104-1(SEQ ID NO7)和gntT104-2(SEQ ID NO8)，30次循環的PCR包括94℃變性50秒，52℃退火50秒，72℃延伸2分鐘(Peekhaus and Conway，J. Bacteriol.，1801777-85，1998)。5’-gactagttgaaaggtgtgcgcgatctcac-3’(SEQ ID NO7)5’-gcggatcccatttgttatgggcgacgtcaattt-3’(SEQ ID NO8)用瓊酯糖凝膠電泳對PCT產物進行分析，結果顯示400 bp的基因片段。
質粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)通過EcoRV/EcoRI進行消化，然后將相同酶消化的gntT104啟動子基因片段用T4DNA連接酶連接到pTrc99A質粒上，由此得到p10499A載體(Lee et al.，Biotechnol. Lett.，161247-52，1994)。然后，p10499A載體被EcoRI/HindIII消化，隨后將放大的phaC2Ps基因插入至p10499A載體的EcoRI/HindIII識別位點，由此構建了重組表達載體p10499613C2(Park et al.，FEMS Microbiol.Lett.，214217-22，2002)。
實施例1-3含有maoC基因的重組載體的構建首先，根據已知方法將E.coli W3110的染色體DNA分離并純化(Sambrook et al.，Molecular cloning，2nd ed，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，1989)。利用純化的E.coli基因序列作為模板，引物為maoC 1(SEQID NO9)和maoC2(SEQ ID NO10)，30次循環的PCR包括在94℃變性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸2分鐘，由此得到PCR產物。5’-tttcccgagctcatgcagcagttagccagtt-3’(SEQ ID NO9)5’-gctctagattaatcgacaaaatcaccgt-3’(SEQ ID NO10)同時，p10499A載體被SacI/XbaI消化，然后將PCR片段插入至其中，由此構建重組載體p10499MaoC。p10499MaoC重組載體被EcoRV/ScaI消化，并被克隆至PvuII/DraI消化的pACYC184中，由此構建重組載體pACYC104MaoC(見圖1和圖2)。圖1是含有maoC基因的重組載體p10499MaoC的基因圖譜，圖2是含有maoC基因的重組載體pACYC104MaoC的基因圖譜。
實施例1-4含有MCL-PHA合成酶基因的重組載體的構建為了表達MCL-PHA合成酶基因，用EcoRV/SspI消化p10499613C2得到的基因片段被克隆到用EcoRV消化的pBBR1MCS中(Kovach et al.，Gene，166175-6，1995)，由此構建了MCL-PHA合成酶基因重組載體pMCS104613C2(見圖3)。圖3是含有PHA合成酶基因的重組載體pMCS104613C2的基因圖譜。
實施例1-5重組E.coli的制備缺失fadB基因的突變體E.coli WB101和缺失fadB基因和maoC基因的突變體E.coli WB106，用MCL-PHA合成酶基因重組載體pMCS104613C2和MaoC重組載體p10499MaoC以及MaoC重組載體pACYC104MaoC轉化，由此產生重組E.Coli菌株WB101(用pMCS104613C2轉化)，WB101(用pMCS104613C2+p10499MaoC轉化)，WB106(用pMCS104613C2轉化)和WB106(用pMCS104613C2+pACYC104MaoC轉化)。用重組E.coli W3110作為對照組，其用含有PHA合成酶基因重組載體pMCS104613C2和MaoC表達重組載體p10499MaoC轉化正常的E.coli W3110而制得。
實施例2重組E.coli合成MCL-PHA的能力檢測為了檢測對照組E.coli菌株和實施例1-5制備的測試組菌株WB101(pMCS104613C2)，WB101(pMCS104613C2 +p10499MaoC)，WB106(pMCS104613C2)和WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)合成MCL-PHA的能力，每一個重組E.coli菌株都在含有2g/l癸酸酯的LB培養基(酵母提取液5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)中培養4天。然后，培養基肉湯以2,500rpm離心15分鐘，然后在100℃干燥。根據傳統方法，將MCL-PHA從干燥的菌落中分離出來，然后測定MCL-PHA的含量。
為了檢測分離后的MCL-PHA的組分，將分離后的MCL-PHA經甲醇分解，使其轉變為3-羥基鏈烷酸甲酯，組分3-羥基丁酸酯(3HB)，3-羥基己酸酯(3HHx)，3-羥基辛酸酯(3HO)，3-羥基癸酸酯(3HD)和3-羥基十二烷酸酯(3HDD)之間的比率通過氣相色譜測定(Donan Co.，Korea)。在該方法中，用熔融后的硅膠毛細管柱(Supelco SPBTM-5，30m 0.32mm ID 0.25m film，USA)作為氣相柱，苯甲酸(Sigma Chem.Co.，USA)作為內標。測試的結果見下表1。
表1重組E.coli中的MCL-PHA含量及其組分的比率

如上表1的結果，MCL-PHA能夠在對照組E.coli菌株，和測試組E.coli菌株WB101(pMCS104613C2)和WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)中產生，但在缺失maoC基因的E.coli菌株WB106(pMCS104613C2)中不產生。然而，由于MCL-PHA在重組的E.coli WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)中產生，其中maoC基因已被克隆至缺失maoC基因的該重組E.coli中，可見，maoC基因在MCL-PHA的制備中發揮著重要的作用。
Langenbach et al.報道了用含有phaC1Pa基因的重組載體pBHR71轉化的fadB突變體E.coli中可產生MCL-PHA，其含量為細胞干重的21.1％(w/w)(Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150303-9，1997)。Tsugeet al.報道MCL-PHA產生于重組E.coli菌株，該菌株表達源于Pseudomonas sp.的PHA合成酶基因和源于Pseudomonas sp.的(R)-特定的烯酰-CoA水合酶PhaJ1和PhaJ2，其含量為干細胞重量的14和29％(w/w)，產生的PHA主要含有6個碳原子的單體(Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184193-8，2000)。
與現有技術相比，本發明能使MCL-PGA的含量(44.6％(w/w))高于現有技術產生的MCL-PGA含量(14，21.1和29％(w/w))。而且，由現有技術制備的MCL-PHA主要包含6個碳原子的單體，而由本發明制備的MCL-PHA包含6-10個碳原子的單體(3HHx，3HO and 3HD)，尤其包含大量的8-10個碳原子的單體(3HO和3HD)。由此可見，由本發明制備的MCL-PHA比由現有技術制備的PHA的應用領域范圍明顯要大。
實施例3烯酰-CoA水合酶活性的測定如實施例1-2相同的方法制備PCR片段，不同的是用引物His-Tag5’-gctctagattaatggtgatgatggtgatgatcgacaaaatcaccg-3’(SEQ ID NO11)替代maoC引物2。并且將PCR片段插入pTac99A載體中，該載體含有SacI/XbaI消化的tac啟動子，由此構建了重組載體pTac99MaoCH(見圖4)。pTac99A載體的構建包括，用PvuII/EcoRI消化pKK223-3載體(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)以得到tac啟動子，再將tac啟動子克隆至PvuII/EcoRI消化的pTrc99A中(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)。圖4是含有maoC基因的重組載體pTac99MaoCH的基因圖譜。用重組載體pTac99MaoCH轉化E.coli DH5α而制備得重組E.coli DH5α(pTac99MaoCH)。E.coli株DH5α在LB培養基中培養一天，并加入1mM IPTG以誘導蛋白質表達。收集菌落，攪勻，利用NTA柱(Qiagen Ni-NTA試劑盒，USA)得到純化的含有6個組氨酸的MaoC蛋白。
加入純化的MaoC蛋白和0.25mM作為底物的巴豆酰-CoA，和反應緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)混合，由于烯酰-CoA水合酶使巴豆酰-CoA水合，使其263nm吸收減弱，從而測得該酶的活性。在該狀況下，可以計算出產物烯酰-CoA硫酯的∈263為6700 M-1cm-1。結果，MaoC蛋白顯示了烯酰-CoA水合酶作用于巴豆酰-CoA的活性為47.6 U/mg。
正如以上所描述和證明的，功能還沒有完全確定的maoC基因用于本發明中，可以以更高的效率得到與從前PHA相比含有更多數目碳原子的高質量PHA。因此，本發明將被廣泛用于高質量PHA的制備中。
并且，用E.coli WB101制備PHA，產量最高，盡管單獨使用maoC基因也有可能合成PHA，但MCL-PHA能夠通過放大的maoC基因和PHA合成酶基因在重組E.coli W3110(對照組)中制備得到，并且該重組E.coliW3110具有正常的脂肪酸降解途徑。考慮到PHA通常不能用缺失fadB基因的E.coli從脂肪酸作為碳源的補料分批培養中制備得，本發明制備MCL-PHA的方法通過重組E.coli中maoC基因的放大，仍具有脂肪酸降解的正常途徑，能夠通過補料分批培養應用于MCL-PHA的大量生產中。
Sequence listing<110>韓國科學技術院<120>用maoC基因制備聚羥基鏈烷酸酯的方法<130>PI034755C<150>KR10-<151>2003-04-23<160>11<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>681<212>PRT<213>Escherichia coli<400>1Met Gln Gln Leu Ala Ser Phe Leu Ser Gly Thr Trp Gln Ser Gly Arg1 5 10 15Gly Arg Ser Arg Leu Ile His His Ala Ile Ser Gly Glu Ala Leu Trp20 25 30Glu Val Thr Ser Glu Gly Leu Asp Met Ala Ala Ala Arg Gln Phe Ala35 40 45Ile Glu Lys Gly Ala Pro Ala Leu Arg Ala Met Thr Phe Ile Glu Arg50 55 60Ala Ala Met Leu Lys Ala Val Ala Lys His Leu Leu Ser Glu Lys Glu65 70 75 80Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Gln Thr Gly Ala Thr Arg Ala Asp Ser85 90 95Trp Val Asp Ile Glu Gly Gly Ile Gly Thr Leu Phe Thr Tyr Ala Ser100 105 110Leu Gly Ser Arg Glu Leu Pro Asp Asp Thr Leu Trp Pro Glu Asp Glu115 120 125
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<223>PCR Primer<400>11gctctagatt aatggtgatg atggtgatga tcgacaaaat caccg 4權利要求
1.一種編碼SEQ ID NO1的MaoC蛋白的maoC基因。
2.根據權利要求1的maoC基因，其具有DNA序列SEQ ID NO2，編碼中鏈聚羥基鏈烷酸酯(MCL-PHA)合成所需的單體的蛋白質。
3.一種含有權利要求1的基因的重組載體。
4.一種MaoC蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO1并顯示烯酰-CoA水合酶活性。
5.一種用權利要求3的重組載體轉化的微生物。
6.根據權利要求5的被轉化的微生物，其缺失fadB基因但含有PHA合成酶基因。
7.根據權利要求6的被轉化的微生物，其中該微生物是用含有PHA合成酶基因的重組載體轉化的，或PHA合成酶基因被克隆至微生物的染色體中。
8.根據權利要求6的被轉化的微生物，其中PHA合成酶基因是phaC。
9.一種制備中鏈聚羥基鏈烷酸酯(MCL-PHA)的方法，其包括步驟(i)在含有C6-10碳源的培養基中培養權利要求6的微生物；和(ii)制得含有6-10個碳原子單體的PHA。
10.根據權利要求9的方法制備的MCL-PHA，使其3-羥基辛酸酯和3-羥基癸酸酯的每一種含量都超過30mol％。
全文摘要
本發明涉及一種利用maoC基因制備中鏈聚羥基鏈烷酸酯(MCL－PHA)的方法。本發明的MCL－PHA的制備方法包括步驟用maoC基因轉化微生物得到轉化體，即缺失fadB基因并含有PHA合成酶基因的微生物；在含有C
文檔編號C12N1/19GK1539977SQ03132680
公開日2004年10月27日 申請日期2003年9月28日 優先權日2003年4月23日
發明者李相燁, 樸時載 申請人:韓國科學技術院