專利名稱：編碼一種可調控擬南芥葉子壽命的f-盒蛋白的新基因及其突變基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從擬南芥中分離出的葉子壽命調控基因ORE9；一種突變型基因ore9，該基因是ORE9基因的一種突變型，能通過抑制與葉子衰老有關的生理和生化變化來延長葉子的壽命；以及所述基因的利用。
背景技術：
抑制植物衰老不僅有其自身重要的科學價值，而且在提高農作物的產量或增進收割后的儲藏效率方面有重要的產業價值。所以，為確定植物衰老現象，積極進行了遺傳學、分子生物學、生理學、生物化學方面的研究。尤其是利用壽命延長突變體對基因的識別和功能的研究，不僅在確定影響衰老進展速度的信號轉移途徑上，而且在解決實際問題上，如提高植物的產量和增進果實收獲前、后的儲藏效率等，都提供了初步的步驟。
在植物的生命過程中，衰老是植物經受的最后一個階段。衰老的啟動可以說是植物生長的一個快速轉變點。該期間中，細胞在新陳代謝和細胞結構上經受了巨大變化。在植物的這些變化中，一個典型的可視現象是秋季葉子的顏色變化秋色，其在葉綠素遭到破壞而其它色素產生時呈現。在秋色期間發生的葉綠素分解導致了葉綠體的破壞、以及合成代謝(如光合作用和蛋白質合成)活性的降低。相反，該期間中，大量的水解酶被誘導，而分解代謝如核酸裂解或蛋白質水解被激活。(Matile P.et al.，In CropPhotosynthesisSpatial and Temporal Determinant，Elsevier 413-440，1992；Nooden L.D.et al.，Senescence and aging in plant，Academic press，1988；andThiman K.V.et al.，The senescence of leaves，CRC press，85-115，1980)。但是，植物衰老可以看作是一個細胞變性的過程，同時可以看作是一個遺傳特征，該遺傳特征是植物在生長過程中為適應環境而積極獲取的，包括冬季里營養物質從生長器官向生殖器官的遷移。衰老包括一系列連續的生化和生理現象，并導致細胞、器官以及整個個體的死亡。(Matile P.et al.，InCrop PhotosynthesisSpatial and temporal Determinant，Elsevier 413-440，1992；Nooden L.D.et al.，Senescence and aging in Plant，Academic press，1988；andThiman K.V.et al.，The senescence of leaves，CRC press，85-115，1980；andThomas H.et al.，Annu.Rev.Plant Physiol.123193-219，1993)。基因理論解釋了衰老的原因，該理論認為基因依據固定的程序引發衰老，而錯誤堆積理論認為，衰老是由于重復發生在體內的信息傳遞錯誤或者蛋白質合成過程中的錯誤堆積引起的。后來一直認為基因理論(認為衰老由基因決定)是有說服力的。因此，在衰老過程的研究和調控上，有關植物衰老的基因克隆以及所述基因的功能識別是非常重要的。但是，盡管有其科學和實踐的重要性，有關植物衰老的大量細節還不清楚。在有關植物衰老的研究中，有關植物生長激素的報告至今一直是研究興趣的主要領域，分子生物學研究最近也已經開始。
植物生長激素(細胞分裂素)是一類已知能夠在生理上延緩衰老的激素。所以，正在進行大量研究，通過調控衰老相關基因來控制細胞分裂素的分泌，從而延緩衰老。然而，存在的問題是激素使其它生理功能受到了影響。最近，為解決這個問題，將IPT基因連接在衰老-特異性基因SAG12的啟動子上，從而在一定的衰老階段調控生長激素，以延緩衰老進程，結果產量增加了50％以上，而開花時間及其它生理功能等發生了較小或沒有發生變化。(Gan S et al.，Science 221986-1988，1995)。另外，對已經延緩了衰老的植物的發育，試驗了一種方法，該方法可抑制乙烯(一種在衰老過程中發揮了重要作用的物質)的合成，或者降低細胞(主要在成熟的番茄中)中乙烯的數量，(Klee et al.，Plant Cell，3(11)1187-93，1991；Oeller etal.，Science，18254(5030)437-9，1991；and Picton et al.，Plant Physiol 103(4)1471-1472，1993)。
有關延緩衰老的分子生物學研究主要聚焦于相關基因的調控，所述基因具有與衰老過程中發生的生化變化有關的活性，或參與了信號轉導系統。對番茄而言，有方法報道，利用反義DNA可防止某些基因的表達，所述基因參與了細胞壁的變性，從而預防了番茄的軟化，結果提高了番茄的運輸和儲藏品質。(Giovannoni et al.，Plant Cell 1(1)53-63，1989)。另有報道說，反義DNA阻礙了磷脂酶D的表達，從而延緩了由植物生長激素引起的衰老(Fan et al.，Plant Cell 9(12)2183-96，1997)。
但是，能直接控制植物衰老的方法可以通過分子生物學研究獲得，所述分子生物學研究對基因(其表達隨衰老而改變)進行了分析；還可以通過遺傳學研究獲得，所述遺傳學研究對衰老-相關突變體進行了分離和分析。
根據現有的報道，已知在擬南芥中，乙烯受體的表達在果實成熟期或花朵衰老期中受到控制，(Payton S.et al.，Plant Mol.Biol.，31(6)1227-1231，1996)，而clp基因的表達在葉子衰老期中受到控制(Nakabayashi K.et al.，Plant Cell Physiol.40(5)504-514，1999)。最近有報道已利用擬南芥突變株識別出了與葉子衰老過程有關的基因(Oh S.A.et al.，Plant Mol.Biol.30(4)739-54，1996)，和與其相關的三個基因位點(Oh S.A.et al.，The PlantJournal，12(3)527-535，1997)，以及sen1(一種衰老-相關基因)的啟動子活性(Oh S.A.，et al.，Journal of Plant Physiology 151339-345，1997)。但是，有關直接調控衰老的基因及其功能的分子生物學研究還不充分。
因此，本發明致力于尋找某些突變體，該突變體參與了擬南芥中葉子壽命的延長，并具有許多遺傳學優勢；同時本發明致力于識別某些基因，該基因參與了突變體中壽命的延長。結果本發明發現了一種突變體，其平均葉子壽命比野生株長大約27％；而且本發明以遺傳圖為基礎，識別出了所述突變體中的相關基因。結果，發現衰老-相關基因是一種位于擬南芥2號染色體的m429至4.8±0.5cM位點、尤其是BAC F14N22位點的基因，該基因包含了2082個核苷酸，該2082個核苷酸在一個cDNA序列上編碼了693個氨基酸。所述基因被命名為ORE9。另外，已發現ORE9蛋白(由所述ORE9基因編碼)有一個被修飾的F-盒結構和18個富含亮氨酸的重復序列，同時能在某些蛋白質(與其它現存的含F-盒的蛋白質相似)之間進行受控結合，關于ore9(ORE9基因的一種突變體)，其能夠大大延長擬南芥的壽命。基于上述要點，本發明得以實現。
另外，本發明提供了一種突變型基因ore9，由于ORE9基因的第979個堿基處的C被T代替，基因ore9的翻譯被提早終止。另外，本發明還提供了一種蛋白質ore9，該蛋白質由基因ore9表達。突變型基因ore9有延長植物壽命的能力，一種通過用所述突變型基因ore9來轉化植物從而延長植物壽命的方法也在本發明范圍之中。
此處所使用的術語“ore”在本發明中取其“長時間生存”的含義，以同樣的含義命名有關植物壽命調控的基因、或其表達的蛋白質或衍生物。“ORE9基因”或“ORE9蛋白”在本發明中分別特定指壽命調控基因或蛋白。術語“ore9基因”或“ore9蛋白”分別指擬南芥的突變型基因或由該基因表達的突變型蛋白，所述擬南芥通過ORE9核苷酸序列上的點突變、或者由其表達的突變型蛋白分別傳代后生成。
下面將詳細描述本發明。
本發明中，為識別與壽命調控有關的基因，首先選取了具有延長壽命特性的突變體。為此，將擬南芥作為試驗植物，所述擬南芥是一種經常被用作植物遺傳學和分子學研究的試驗對象。擬南芥的5條染色體現已完全被解碼為130-140Mbp大小的小基因組，其詳盡的遺傳學和物理學圖譜也已存在。同時，擬南芥的壽命很短，并具有產出大量種子、易于栽培和轉化的優勢。因為上述原因，經常將該植物作為一種遺傳模型用以研究植物。(http//www.arabidopsis.org)。
本發明中，為選取其葉子壽命延長了的突變體，以擬南芥為試驗對象，將其進行乙甲基磺酸(EMS)處理以誘導突變。然后，從成年個體中選取葉子發黃速度緩慢的個體，并檢測這些個體的葉子存活率、葉綠素含量、光合作用效率以及離子流出速度，從而驗證其壽命延長的特性。將選取的上述個體命名為“ore9突變體”，并將其特性與野生株進行比較。結果發現，突變體的平均葉子壽命為31.4 DAE(葉子突出表面后的天數)，比野生株的平均壽命增加了27.1％，后者的平均葉子壽命大約為24.7 DAE。另外，關于衰老的進展速度，在野生株中，50％的葉綠素丟失，而在ore9突變體中，黃化現象直到24 DAE后才開始。同時，作為衰老進展的其它測量手段，光合作用活性和膜離子流出量的降低表明衰老在ore9突變體中的進展慢于野生株。
盡管總的說來葉子的衰老受基因控制，但現已知植物生長激素如脫落酸(ABA)、茉莉酮酸甲酯(MeJA)以及乙烯可改變衰老的啟動和進展(Henselet al.，Plant Cell 5553，1993)。因此，為檢測在上述植物生長激素處理后ore9突變體中葉子壽命的變化，分別用ABA、MeJA和乙烯處理ore9突變體和野生株后，通過檢測葉綠素含量和光合作用活性，測量其衰老的進展。結果證實，野生株中，由于植物生長激素的影響，葉綠素含量和光合作用活性都明顯降低，從而加速了衰老。而在ore9突變體中，植物生長激素的影響明顯降低。該結果表明，即使進行了衰老-相關激素處理，ore9突變體的壽命仍可延長。
同時，在本發明的一個實施例中，為驗證ore9突變體壽命的延長不僅在生理水平上受到影響，還在分子水平上受到影響，借助Northern印漬分析檢測了不同衰老-相關基因的表達情況。例如，合成代謝活性(如光合作用)和自我-修復基因活性在葉子生長階段增加，而在衰老階段降低(Nam etal.Curr.Opin.Biotech.8200，1997)。在野生株中，光合作用-相關基因的表達(如葉綠素a/b結合蛋白、葉綠體核糖蛋白S17)及其它一些基因的表達(如小亞單位的核酮糖二磷酸羧化酶)隨衰老的進展按比例下降。而在本發明的ore9突變體中，上述基因的表達很少發生或沒有發生改變。另一方面，在野生株中，不同衰老相關基因(如SAG12、SEN4以及SEN5)的表達隨衰老進展而增加。而在ore9突變體中，發現其衰老相關基因的表達不隨衰老進展而大量增加。上述事實表明，ore9突變體壽命延長的影響不僅在生理水平上，還在分子水平上。
為識別與植物壽命調控有關的基因，使用了遺傳圖。結果發現在遺傳圖上，ORE9定位在與m429相距4.8±0.5厘摩(cM)的位點，特別是2號染色體上的BAC F14N22位點。以此結果為基礎，構建兩個定位在0.05cM和0.1cM位點的分裂擴增多態性序列(CAPS)標記物，從而識別出一個大小為10kb的區域，該區域包括三個開放閱讀框架(ORFs)。由此，亞克隆出了一個只包含ORE9基因的大小為4.5kb的片段。已證實該片段足以互補ore9突變體。
根據本發明，所提供的ORE9基因的核苷酸序列和ORE9蛋白的氨基酸序列分別表示為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。在ore9基因(ORE9的一種突變型基因)的核苷酸序列中，ORE9基因的核苷酸序列SEQ ID NO1中第979個堿基處的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)代替。在上述ore9基因表達為ore9蛋白時，翻譯提前終止。因此，ore9蛋白的氨基酸序列只含8個LRRs，短于含18個LRRs的正常ORE9蛋白。該ore9蛋白的氨基酸序列表示為SEQ ID NO3。
基因組DNA的印漬分析結果顯示，在擬南芥的基因組中，ORE9基因以單拷貝數存在，而且當比較cDNA和gDNA時，發現ORE9基因含6個外顯子。由該ORE9基因所表達的ORE9蛋白包含693個氨基酸。而且，該ORE9蛋白包含一個位于N-端的F-盒結構，并有18個LRRs。利用數據庫鑒別上述氨基酸序列，結果顯示該氨基酸序列與擬南芥TIR1(參與植物生長激素反應)有48.4％的同源性，與人類CUL1和FBL2分別有46.6％和37.8％的同源性，并與酵母CDC4有47.8％的同源性，因此與含LRRs的F-盒蛋白質是同源的。
F-盒結構是一種高度變性的疏水序列，是一個含40個氨基酸的區域。F-盒結構存在于某些蛋白質中，這些蛋白質都能夠聚集酶作用物，從而成為泛素連接酶復合體的核心，以進行泛素化和蛋白質水解作用(Craig et al.，Prog.Biophys.Mol.Biol.72299，1999)。通過泛素-蛋白體途徑，F-盒蛋白與Skp1和Cdc53蛋白特異性地相互作用，從而形成了一個E3泛素連接酶復合體，稱之為SCF(Skp1-Cdc53-F-box)。在脊椎動物和酵母的調控蛋白中都可發現上述F-盒蛋白質，例如酵母Cdc4和Grr1、人類Skp2和CUL1-假蛋白等等。最近發現在植物中也有F-盒蛋白質，有報道說這些蛋白質同樣影響花器官性質(UFO)、JA-調控抵抗(Coll)、植物生長激素反應(TIR1)的調控以及生物鐘的調控(ZTL和FKF1)(see Xin et al.，Science 2801091，1998；Ruegger et al.，Genes dev.12198；1998；Samach et al.，Plant J.20433，1999；Sommers et al.，Cell 101319，2000；and Nelson et al.，Cell 101331，2000)。
為證實ORE9蛋白實際上顯示了F-盒蛋白的活性，利用酵母雙-雜交測定法，對ORE9蛋白能否與ASK1、ASK2相互作用進行了檢測，所述ORE9蛋白的序列與上文各種F-盒蛋白有同源性，所述ASK1和ASK2是與Skp1(能與F-盒蛋白結合)相似的蛋白質。通過構建質粒，以結合在GAL4 DNA結合區(GAL4-BD)的結合蛋白的形式，分別表達一個僅包含F-盒區的片段(1-49a.a.)和一個切除了F-盒部分的片段(50-693a.a.)，同樣通過構建質粒，以結合在GAL4轉錄活性區(GAL4-AD)的結合蛋白的形式，分別表達ASK1和ASK2。然后，用不同結合對子的載體轉化酵母，并進行培養。結果顯示，只有包含ASK1質粒和ORE9(有F-盒區)的酵母在缺乏組氨酸的培養基上存活，且有β-半乳糖活性。相反，切除了F-盒區的ORE9衍生物無法與ASK1結合。同樣，發現ASK2和ORE9互相結合。該結果說明，ORE9的F-盒區與ASK蛋白之間的結合是特異性的。結果可以斷定，對ORE9和ASK1的結合而言，ORE9的F-盒區是必需的，ORE9具有與一般F-盒蛋白相近的功能。
同時，通過in vitro實驗，也驗證了ORE9蛋白能與ASK1結合。放射性-標記的ORE9及其衍生物與GST-ASK1結合蛋白的In vitro結合測定結果顯示，ore9突變蛋白以及ORE9衍生物(包含F-盒區)與GSK-ASK1共同沉淀。這說明這些蛋白直接與ASK1結合。
ORE9蛋白影響擬南芥葉子壽命的機制有下面兩個可能。一個可能是ORE9蛋白在葉子衰老的啟動中充當了一種負面調節因子，所以能夠聚集轉錄抑制因子，該轉錄抑制因子抑制了衰老啟動所必需的基因。另一個可能是ORE9充當了一種受體，該受體是自我-調控蛋白的選擇性變性所必需的。換而言之，因為F-盒蛋白借助泛素途徑在蛋白質變性過程中發揮了重要作用，所以ORE9蛋白在蛋白質(如其它F-盒蛋白)之間的結合上發揮了重要作用。因此，可以說借助泛素途徑，ORE9通過蛋白質的變性導致了衰老現象。在這一點上可以說，ore9突變體表達了其壽命延長特性的原因是相比野生型ORE9，從ore9蛋白的C-端切除了WD重復序列或LRRs，所以蛋白質之間的結合力減弱。
但是，根據本發明，盡管用上述原理描述了其機制，但ORE9基因和其蛋白質、以及ore9基因和其蛋白質對壽命調控或壽命延長的影響不受上述原理限制、或不局限于上述原理。
另外，本發明中的ORE9基因和ORE9蛋白有助于研究植物中的衰老-相關基因或衰老抑制物質。例如，可通過與ORE9基因核苷酸序列的比較，研究與ORE9基因有高同源性序列的基因，或者可通過雜交反應來研究假-基因，所述雜交反應以ORE9基因片段為探針，使用一個模板RNA或從植物(經過衰老-相關物質處理)中提取的mRNA，以產生cDNA。另外，本發明中的基因可用于研究能直接與本發明基因結合的物質；或者用于研究能抑制或激活本發明基因的表達的物質；或者通過對衰老抑制物質與ORE9蛋白結合情況的分析，用于識別衰老抑制物質。這種分析可以通過不同的傳統方法特異性地實現，如DNA碎片法、聚合酶聯反應(PCR)、Northern印漬分析和Southern印漬分析等。
另外，當使用ORE9蛋白時，可以利用某種方法對ORE9蛋白的表達情況進行分析，該方法可選自一組方法，包括酶聯免疫吸收測定(ELISA)、蛋白質碎片測定或2-D凝膠分析等。
另外，本發明提供了一種方法，該方法通過用突變型基因ore9轉化植物來延長植物的壽命。關于用突變型基因轉化植物的方法，技術上有多種方法可用以轉化植物。例如，可使用擬南芥介導的轉化方法，該方法利用一個二元載體來轉化植物，從而引入突變型基因ore9。另外，當使用不含T-DNA區域的載體時，有電泳、微粒子轟擊、聚乙二醇-介導攝取等方法。
可以用本發明中的方法延長其壽命的植物包括雙子葉植物(如萵苣、大白菜、馬鈴薯和蘿卜)以及單子葉植物(如水稻、大麥、香蕉等)。當將本發明中的方法用于可食用青菜或果實如番茄(有薄的果皮，因此衰老可使其品質快速惡化)、以及主要出售其葉子的植物時，本發明中的方法可有效增加其儲藏效率。
附圖簡述

圖1中圖示了擬南芥野生株及其壽命延長突變體ore9中，葉子在不同時間的存活率，其中，當葉子丟失了其葉綠素總數的80％時，認為該葉子死亡，每一個總體包括100個獨立的葉子。
□野生株■ore9圖2a中圖示了擬南芥野生株和ore9(野生株的一種壽命延長突變體)中，不同時間時葉綠素含量的變化。
圖2b中示出了不同時間時光合作用活性的變化，其中光合作用活性用PSII的光化學效率(Fv/Fm)表示。
□野生株■ore9Fv最大可變熒光Fm最大熒光強度圖2c中圖示了擬南芥野生株及其壽命延長突變體ore9中，不同時間時膜離子流出量的變化，其中膜離子流出量用初始傳導率和總傳導率的比值(百分比)表示。
圖3中示出了擬南芥野生株及其壽命延長突變體ore9中，不同時間下衰老-相關基因(SAGs)和其它光合作用-相關基因表達模式的Northern印漬分析結果。
CAB一種葉綠素a/b結合蛋白RPS17一種葉綠體核糖蛋白S17RBCS一種小亞單位的核酮糖二磷酸羧化酶SEN4一種衰老-相關基因4SEN5一種衰老-相關基因5圖4a中圖示了分別進行脫落酸(ABA)、茉莉酮酸甲酯(MeJA)和乙烯處理后的葉子壽命變化，以光合作用效率表示，所處理的三種物質是對衰老的啟動和進展有影響的植物生長激素。
黑條未進行植物生長激素處理的葉子白條經過植物生長激素處理后的葉子圖4b中圖示了分別進行脫落酸(ABA)、茉莉酮酸甲酯(MeJA)和乙烯處理后的葉子壽命變化，以葉綠素含量表示，所處理的三種物質是對衰老的啟動和進展有影響的植物生長激素。
黑條未進行植物生長激素處理的葉子白條經過植物生長激素處理后的葉子圖5a是ORE9基因在擬南芥基因組上的定位的基因圖譜。
斜條用以對ore9突變體進行互補測定的部分圖5b是ORE9和ore9蛋白的預期結構的示意圖。
FF-盒區白框LRRs圖6中示出了ORE9和含F-盒結構的蛋白質之間，F-盒區上的氨基酸序列同源性和共同序列。
a脂肪族氨基酸殘基圖7a是ORE9、ORE9衍生物、以及ASK1和ASK蛋白(用于酵母雙-雜交測定)的結構示意圖。
黑框GAL4-BD陰影框GAL4-AD圖7b是利用ORE9或其衍生物、以及ASK1或ASK2蛋白，進行酵母雙-雜交測定后的結果的照片。
左上部分用于雜交測定的質粒的配對和位置右上部分在缺乏色氨酸、亮氨酸的培養盤中培養的結果左下部分在含2Mm 3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)的缺乏色氨酸、亮氨酸、組氨酸的SD培養盤中培養的結果右下部分轉化體的β-半乳糖活性圖8是利用ORE9或其衍生物、以及GSK或GSK-ASK1結合蛋白，進行in vitro結合測定的結果的凝膠照片。
實現發明的最佳方式下面將通過實施例進一步詳細介紹本發明。但請注意，本發明不局限于本實施例、或不受本實施例的限制。
例1在擬南芥中選取壽命-延長突變體取Col-O(野生株擬南芥)的大約40,000個種子(M1)，在0.33％乙甲基磺酸(EMS)溶液中處理8小時，并進行自身-授粉以獲取其第二代種子(M2)。在溫室(溫度控制在23℃)中培養該植物，并用肉眼觀察葉子的黃化，該黃化是由于植物隨年齡而衰老，從而引起了葉綠素的降低而造成的。對比野生株，選取6個黃化速度較慢的個體。將選出的突變體命名為“oresara”，其在韓語的意思為“存活時間長”(ore1、ore2、ore3、ore9、ore10以及ore11)。根據對這些突變體的生化分析結果(葉綠素含量分析、光化學效率分析、以及核糖核酸酶和過氧化物酶分析)，發現實際上所述突變植物是功能持久的綠色植物。以生化分析為生物指標來檢測葉子的衰老。在22℃、16小時光照/8小時暗室條件下的培植房(韓國器具公司)中，培養上面選出的壽命延長突變體和作為對照組的野生株個體，以用于后續的實驗。本實驗中選用第3個玫瑰花形葉子和第4個玫瑰形葉子。
例2對壽命延長突變體ore9特性的表達研究為驗證突變體ore9的壽命-延長特性，測量了突變體ore9葉子的葉綠素含量、光合作用活性和膜離子流出量，并與野生株擬南芥的上述指標進行對比。
2-1)測量葉子的存活率和葉綠素含量通過測量葉子突出表面后的天數(DAE)來確定葉子的壽命，DAE期間葉子保持50％的存活率。還可通過葉子的葉綠素含量來確定葉子的壽命，葉綠素含量在12 DAE后每隔4天進行測量，12 DAE時第3個和第4個玫瑰形葉子已經生長完全。當葉子丟失了其全部葉綠素的80％以上時，確認該葉子已死亡。本發明中所用的標本組是取自獨立個體的100個互相獨立的葉子。
為測量葉綠素含量，80℃下將獨立的葉子標本在95％的乙醇中煮沸，然后提取葉綠素。以648nm和664nm下的吸光率來測量葉綠素的含量，并表示為每單位重量新鮮葉子中的葉綠素濃度(Vermon et al.，Anal.Chem.321142-1150，1960)。結果如圖1所示，野生株的平均壽命大約為24.7 DAE，而壽命-延長突變體ore9的平均壽命為31.4 DAE，該結果顯示，ore9突變體的葉子壽命比野生株增加了27.1％。同樣，如圖2a所示，24 DAE時野生株丟失了其葉綠素的50％，而在ore9突變體中，24 DAE時黃化現象剛剛開始出現，直到32 DAE時仍保持了50％的葉綠素。
2-2)光合作用活性為測量光合作用活性，使用了Oh S.A等的方法(Oh S.A.et al.，Plant Mol.Biol.30939，1996)。首先，分別將獨立的葉子進行暗室處理15分鐘，并借助植物效率分析器測量葉綠素的熒光。利用葉綠素的熒光性質，將光合作用活性表示為光系統II(PSII)的光化學效率。用最大可變熒光(Fv)與最大熒光強度(Fm)的比率(Fv/Fm)來表示光化學效率。光合作用效率隨著該比率的增大而提高。
結果顯示，光合作用活性的變化與葉綠素含量的變化相似。換而言之，野生株中的光合作用活性在20 DAE后快速下降，而ore9突變體中的光合作用活性在28 DAE后才開始下降(見圖2b)。
2-3)檢測膜離子流出量通過測量從葉子中流出的電解液來確定膜離子流出量。從每個擬南芥個體中收集兩個葉子，并浸入3ml 400mM的甘露醇中，22℃下輕輕震蕩3小時，然后用傳導率測量儀SC-170測量初始傳導率。將標本煮沸10分鐘，并測量總傳導率。用初始傳導率與總傳導率的比值(％)表示傳導率。
野生株中，膜離子流出量在24 DAE后迅速增加，而ore9突變體中，膜離子流出量在36 DAE后迅速增加(見圖2c)。
考慮上述結果，可以發現相比野生株，ore9突變體具有葉子壽命延長的顯型。該壽命延長的影響可通過下面的事實得到證實ore9突變體中，由于衰老造成的葉綠素含量降低、光合作用活性降低、膜離子流出等生化改變遲于野生株。
例3ore9突變體中衰老-相關基因的表達為證實ore9對衰老-相關基因(SAGs)的表達有影響，借助Northern印漬分析，分別檢測了SAG蛋白在葉子發展過程的不同時間階段上的表達情況。在12、20、24 DAE時分別從葉子中提取總RNA，在野生株中，該3個時間上葉子分別完全生長、葉綠素損失低于10％、葉綠素損失高于50％。在每個加樣槽中加入10μgRNA，并用全長ORE9基因作為探針。
現已知合成代謝活性(如光合作用和自我-修復活性)隨植物的生長而增加，而在植物衰老階段降低(H.G.Nam，Curr.Opin.Biotech.8200，1997)。本實施例的結果與該報道完全一致。在野生株中，光合作用-相關基因的表達(如葉綠素a/b結合蛋白、葉綠體核糖蛋白S17)以及一些基因的表達(如小亞單位核酮糖二磷酸羧化酶)隨衰老的進展而降低。但在本發明的ore9突變體中，上述基因的表達很少發生或沒有發生變化。同時，在野生株中，不同衰老-相關基因(如SAG12，SEN4和SEN5)的表達隨時間階段的進行而增加。但現已證實，在ore9突變體中，衰老-相關基因的表達在同一時間內沒有大量增加。該事實說明，ore9突變體不僅在生理水平上、也在分子水平上延緩了衰老的啟動，從而延長了葉子的壽命。
例4用植物生長激素處理后，ore9突變體葉子壽命的改變盡管葉子的衰老是一個受基因控制的過程，但衰老的啟動和進展可以被植物生長激素如脫落酸(ABA)、茉莉酮酸甲酯(MeJA)和乙烯改變，該三種物質是抑制植物生長的物質(Hensel et al.，Plant Cell 5553，1993；Weidhase et al.，Physiol.Plant 69161，1987；and Zeevaart et al.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.39439，1998)。因此，本實驗中，通過測量光合作用活性和葉綠素含量的變化，檢測了植物生長激素處理后ore9突變體中葉子壽命的變化。將分離的葉子漂浮在pH5.8、含50μM ABA或50μMMeJA的3mM 2-[N-嗎啉]-乙甲基磺酸(MES)緩沖液中，并持續暴露在日光下。通過在含4.5μM乙烯氣體的玻璃瓶中培養植物，進行了乙烯處理。22℃下將上述植物生長激素處理持續3天，并持續暴露在日光下。這時，取12 DAE時的獨立葉子為標本，并按例2中同樣的方式測量葉綠素含量和光合作用活性。
結果發現，在進行了ABA、MeJA和乙烯處理后，野生株的光合作用活性分別降低了65％、38％和54％，而ore9突變體的光合作用活性分別保持在93％、70％和82％(見圖4a)。另外，與光合作用活性相似，葉綠素含量的降低在ore9突變體中變弱了(見圖4b)。上述結果表明，ore9突變體對衰老-加速激素的敏感性較低，并抑制了由所述激素引起的衰老過程，所以可以延長植物的壽命。
例5以基因圖譜為基礎，對ORE9基因的克隆和序列分析為獲取有關ORE9的準確遺傳學信息，利用分裂擴增多態性序列測定物，繪制了基因圖譜。
從該圖譜中可以發現，ORE9定位在與m429相距4.8±0.5厘摩(cM)的位點，特別是2號染色體上的BAC F14N22位點(見圖5a)。
構建兩個CAPS標記物(F14N22.6和F14N22.13)，其分別定位在0.05cM和0.1cM位點，在該兩個位點處，可以分別從ORE9獲取一個重組體和兩個重組體(984個個體中)。CAPS標記物中的F14N22.6是一種大小為1.2kb的PCR擴增產品，進行PCR擴增時，以寡核苷酸(其核苷酸序列表示為SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)為引物。同時，該標記物包含2個來自Col的Dra I位點和3個來自Ler的Dra I位點。F14N22.13是一種大小為1.2kb的PCR擴增產品，進行PCR擴增時，以寡核苷酸(其核苷酸序列表示為SEQ ID NO6和SEQ ID NO7)為引物。同時，F14N22.13包含1個來自Col的HinfI位點和2個來自Ler的HinfI位點。上述CAPS標記物的圖譜顯示，一個預料包含ORE9基因的大小為10kb的區域有三個開放閱讀框架(ORFs)。將上述三個開放閱讀框架的核苷酸序列與ore9突變體進行對比，結果顯示，在ore9突變體中，開放閱讀框架一個位點上的一個C堿基被T代替，所以其翻譯提前終止，結果產生的蛋白質比野生株中的短(見圖5b)。
將一個只包含ORE9基因的大小為4.5kb的片段進行PCR擴增，并通過PCR亞克隆到GEM T簡易載體(Promega，USA)中，進行PCR擴增時，以寡核苷酸(核苷酸序列表示為SEQ ID NO8和SEQ ID NO9)為引物。將上述重組載體pGTE-ORE9轉化的Escherichia coli于2000年10月31日存放在韓國培養類型收集庫(KCTC)、韓國生物科學和生物技術研究協會(KRIBB)，登記號為KCTC 0881BP。
為檢測ORE9基因與ore9突變體中控制壽命的物質互補的可能性，將插入到重組載體中的ORE9基因(包含大小為4.5kb的片段)亞克隆到pCAMBIA1300的一個BamHI位點(MRC，USA)，然后用該亞克隆載體轉化ore9個體。觀察該轉化個體的抗生素抗性和T2代顯型，結果顯示，ORE9基因(包含大小為4.5kb的片段)能夠與ore9突變體互補，如下列表1所示。
表1轉基因后ore9突變體的互補實驗

注X2值指與3∶1或5∶1(HygR∶HygS或+∶-)對比后的統計值，該兩個比值是后代的預期顯型比；HygR潮霉素抗性；HygS潮霉素敏感；+野生株；-壽命延長株；ore9/ORE9-a，b，c三個獨立的T2植物，其中ore9個體被大小為4.5kb的片段轉化。
另外，基因組DNA的印漬分析結果顯示，ORE9在擬南芥基因組中以單拷貝數存在(數據未示出)。同時，將ORE9的cDNA序列與基因組序列進行對比，結果顯示ORE9包含6個外顯子。ORE9的cDNA序列包含2082個堿基(編碼了693個氨基酸)，并有一個表示為SEQ ID NO1的核苷酸序列。ORE9基因所編碼的ORE9蛋白有一個變性的F-盒結構和18個不完全的LRRs(見圖5b)。
例6在SCF復合體中識別ORE9的F-蛋白功能從ORE9基因(在例5中鑒別出)的核苷酸序列中類推出一個多肽序列，并借助數據庫進行識別。結果顯示，ORE9蛋白與擬南芥的TIR1(參與了植物生長激素反應)有48.4％的同源性；與含LRRs的F-盒蛋白質如人類CUL1、FBL2及酵母CDC4分別有46.6％、37.8％、47.8％的同源性。通過泛素-蛋白體途徑，F-盒蛋白與Skp1和Cdc53蛋白相互作用，從而形成了一個E3泛素連接酶復合體，稱之為SCF(Skp1-Cdc53-F-box)(Craig et al.，Prog.Biophys.Mol.Biol.72299，1999)。因此，為驗證ORE9蛋白具有F-盒蛋白的功能(能形成SCF復合體)，通過酵母雙-雜交測定和in vitro結合測定，檢測了ORE9蛋白是否與Skp1-類蛋白相互作用。作為Skp1-類蛋白質，擬南芥SKP1的同構體1(ASK1)和擬南芥SKP1的同構體2(ASK2)是最適宜選用的。
6-1)構建用于酵母雙-雜交測定的表達載體作為表達GAL4 DNA結合域(GAL4-BD)和ORE9結合蛋白的表達載體，構建了質粒pGBT9-ORE9(1-49)[1]和pGBT9-ORE9(50-693)[2]。質粒pGBT9-ORE9(1-49)表達了一個ORE9片段，該片段包含與ORE9的F-盒區相對應的N-端第1-49氨基酸；質粒pGBT9-ORE9(50-693)表達了另一個ORE9片段，該片段包含ORE9中切除了F-盒區后的第50-693氨基酸。
首先，借助引物(核苷酸序列表示為SEQ ID NO10和SEQ ID NO11)，對編碼ORE9(1-49)片段的基因進行PCR擴增，然后將其插入到pGBT9的BamHI和PstI限制酶位點(Clontech，USA)，所述pGBT9包含一個4-BD基因和一個色氨酸缺陷型選擇標記基因(TRP1)，從而構建了一個pGBT9-ORE9(1-49)質粒。同樣，構建了pGBT 9-ORE9(50-693)質粒，該質粒表達了一個ORE9(50-693)片段和一個GAL4-BD結合蛋白。此處，以寡核苷酸(核苷酸序列表示為SEQ ID NO12和SEQ ID NO13)為PCR的引物，對編碼ORE9(50-693)片段的基因進行了PCR擴增。
同時，關于ASK1(1-160)和ASK2(1-172)(用于識別某種結合)，可將其表達為與GAL4-BD結合的結合蛋白形式，通過這種方式，構建了pGAD424-ASK1(1-160)和pGAD424-ASK2(1-172)。用BamHI和PstI消化含一個ASK1(1-160)基因的pGTE-ASK1(1-160)，并將其插入到pGAD424中(Clontech，USA)，所述pGAD424包含一個GAL4-AD基因和一個亮氨酸缺陷型選擇標記基因(LEU2)，從而構建了一個pGAD424-ASK1(1-160)[3]質粒，該質粒表達了ASK1和GAL4-4AD的結合蛋白。同樣，通過將一個pGTE-ASK2(1-172)的BamHI/PstI片段插入到pGAD424中，構建了pGAD424-ASK2(1-172)[4]質粒。
圖7a示意了如上構建的質粒所表達的結合蛋白的結構。
6-2)酵母雙-雜交測定在一種YPD(酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖)培養基或含2％葡萄糖的基本合成培養基(SD)中培養酵母品系HF7c。
借助醋酸鋰方法(Feilotter et al.，1994)，分別用上述例6-1中構建的載體的不同組合([1+3]、[2+3]、[1+4]；見圖7b的左上部分)轉化酵母品系HF7c(在上述培養基中培養)。在含2％葡萄糖的基本合成培養基中選取轉化體。在不含色氨酸、亮氨酸的SD培養基(見圖7b的右上部分)以及不含色氨酸、亮氨酸、組氨酸的SD培養基(含2Mm 3-氨基-1，2，4-三唑)(見圖7b的左下部分)中培養該轉化體。結果顯示，只有用載體pGBT-ORE9(1-49)[1]和pGAD-ASK1(1-160)[3]轉化的酵母能夠在缺乏組氨酸的培養基中生長，所述載體pGBT-ORE9(1-49)[1]包含F-盒區，所述載體pGAD-ASK1(1-160)[3]能表達ASK1(1-160)。
但是，發現切除F-盒區后的ORE9衍生物[ORE9(50-693)]無法與ASK1結合(見圖7b)。該事實說明，對ORE9與ASK1的結合而言，F-盒區是必要的和充分的條件。
同時，酵母雙-雜交測定反映出，ASK2和ORE9不能互相結合。該事實說明，ORE9的F-盒區與ASK蛋白的結合是特異性的。但是，完整的ORE9(1-693)未顯示出與ASK1結合的正信號(數據未示出)。考慮這是由于結合蛋白錯誤折疊或蛋白從胞核中分離等原因造成的。
在基本合成培養基中培養上述轉化體，并把生成的酵母克隆置于濾紙片上，以檢測其β-半乳糖活性。將該濾紙片在液氮中放置30秒，并在含0.83mM 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的Z緩沖液(60mMNa2HPO4，40mM NaH2PO4，10mM KCl，1mM MgSO4)中培養。30℃下保存該濾紙片，并觀察其顏色變化，該顏色的變化可指示β-半乳糖活性。
結果顯示，只有包含ASK1(1-160)質粒和ORE9[ORE9(1-49)](有F-盒區)的酵母能夠在缺乏組氨酸的培養基中生長，并具有β-半乳糖活性。
6-3)In vitro結合測定為檢驗ORE9蛋白及其衍生物能與ASK1直接結合，對GST-ASK1結合蛋白和標記了35S的ORE9蛋白(通過in vitro翻譯生成)進行了in vitro結合測定。為獲取谷胱甘肽S-轉移酶(GST)蛋白和GST-ASK1結合蛋白，構建了一個pGEX載體(APBiotech，Co.)和一個pGEX-ASK1載體，該兩個載體分別表達了上述兩種蛋白。以人造序列SEQ ID NO14和SEQ ID NO15為PCR引物，對編碼ASK1片段的基因進行擴增。用EcoRI和NcoI限制酶對生成的PCR產物進行消化，并將其插入到pGEX載體的限制酶位點。用生成的兩個載體轉化Escherichia coli BL21(DE3)pLysS，從而表達GST和GST-ASK1結合蛋白。利用谷胱甘肽-瓊脂糖4B珠進行層析，從而提純GST和GST-ASK1結合蛋白。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將提純后的蛋白進行電泳，用考馬斯藍染色，并測量其數量。往谷胱甘肽珠中加入同樣數量的GST和GST-ASK1結合蛋白，該谷胱甘肽珠先用10倍體積的B緩沖液(20mM氯化磷酸鹽，pH7.6，150mM氯化鈉，10％甘油，0.5％NP-40，1mM DTT)洗滌三次。然后利用旋渦混合器將上面生成的蛋白質在4℃下吸附1小時。用1ml B緩沖液洗滌谷胱甘肽珠三次，并保存在一種漿液相對B緩沖液的比例為50％的狀態。
同時，利用in vitro轉錄/翻譯系統(Promega，USA)和[35S]-蛋氨酸(DuPontNEN，USA)，制備放射性-標記ORE9(1-693)、突變型ore9和ORE9衍生物(1-327和50-693)。利用SDS-PAGE和放射分析顯影系統(日本)，對所述蛋白質進行定量分析。然后，分別將同樣數量的標記了35S的翻譯產物與60μl GST-吸附珠或GST-ASK1結合蛋白-吸附珠混合，所述吸附珠容于1mlGB緩沖液中(最終濃度為20mM Tris-HCl，pH7.5，0.15％NP-40，150mMNaCl，1mM EDTA)。4℃下將上述生成的吸附珠在旋渦混合器中培養2小時，然后用1ml GB緩沖液洗滌4次。往洗滌后的吸附珠中加30μl 2×SDS樣品溶液，煮沸3分鐘，然后分離出SDS-PAGE。將上述生成的凝膠烘干，然后曝光于X光膠片。
結果顯示，與酵母雙-雜交測定不同，完整的ORE9(1-693)直接與ASK1結合。另外，突變型ore9和含F-盒區的部分ORE9(1-327)與GST-ASK1結合蛋白共同沉淀，但不能與GST蛋白(一個陰性對照組)共同沉淀(見圖8)。同時，發現切除了F-盒區的ORE9(50-693)不能與GST-ASK1結合。上述結果說明，ORE9直接與ASK1結合。
工業應用性本發明中新的衰老調控基因ORE9及其所表達的ORE9蛋白有助于研究衰老機制、有助于識別植物中的衰老-相關基因或抑制物質。另外，可以用ore9基因(ORE9基因的一種突變體)來轉化植物，從而延長植物的壽命，以增加植物的產量和儲藏效率。
國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表原始保藏存單至基諾麥因有限公司(GENOMINE，INC.)(Environmental Eng.Bldg.226，Pohang University of Science & Technology，#San31，Hyoja-dong，Nam-ku，Pohang 790-784，Republic of Korea)
序列表<110>基諾麥因有限公司浦項工科大學校<120>編碼一種可調控擬南芥葉子壽命的F-盒蛋白的新基因及其突變基因<130>OP01-1009<150>KR 2000-78972<151>2000-12-20<160>15<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>2082<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(2082)<223>ORE9基因<400>1atg gct tcc act act ctc tcc gac ctc cct gac gtc atc tta tcc acc48Met Ala Ser Thr Thr Leu Ser Asp Leu Pro Asp Val Ile Leu Ser Thr1 5 10 15att tcc tct ctc gta tcc gat tcc cga gct cgc aac tct ctc tcc ctc96Ile Ser Ser Leu Val Ser Asp Ser Arg Ala Arg Asn Ser Leu Ser Leu20 25 30gtc tct cac aaa ttc ctc gct ctc gaa cga tcc act cgc tct cac ctc 144Val Ser His Lys Phe Leu Ala Leu Glu Arg Ser Thr Arg Ser His Leu35 40 45act atc cgt ggc aac gct cgt gat ctc tcc ctc gtc ccc gac tgt ttc192Thr Ile Arg Gly Asn Ala Arg Asp Leu Ser Leu Val Pro Asp Cys Phe50 55 60cga tca atc tca cat ctc gat ctc tct ttc ctc tcc cca tgg ggt cac240Arg Ser Ile Ser His Leu Asp Leu Ser Phe Leu Ser Pro Trp Gly His65 70 75 80act ctt ctc gct tct ctc cca atc gat cac cag aac ctt ctc gct ctc288Thr Leu Leu Ala Ser Leu Pro Ile Asp His 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1.一種調控植物壽命的蛋白質ORE9，其氨基酸序列表示為SEQ ID NO2。
2.根據權利要求1所述的蛋白質ORE9，其中該蛋白質從擬南芥中分離。
3.根據權利要求1所述的蛋白質ORE9，該蛋白質有一個位于N-端的F-盒結構，并有18個富含亮氨基酸的重復序列(LRRs)。
4.一種編碼權利要求1所述蛋白質的基因。
5.根據權利要求4所述的基因，該基因的核苷酸序列表示為SEQ IDNO1。
6.一種重組載體，該重組載體包含權利要求4所述的延長植物壽命的基因。
7.根據權利要求6所述的重組載體，該重組載體是包含ORE9基因的pGTE-ORE9(登記號KCTC 0881BP)。
8.一種延長植物壽命的突變型基因ore9，該基因的核苷酸序列是核苷酸序列SEQ ID NO1上第979個堿基處的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代后形成的。
9.一種由權利要求8所述ore9基因表達的ore9蛋白，該蛋白有一個F-盒結構和8個富含亮氨酸的重復序列。
10.一種利用ORE9基因、ORE9蛋白、ore9基因、ore9蛋白以及它們的片段或衍生物來研究植物中的衰老調控基因或蛋白的方法。
11.根據權利要求10所述的方法，該方法通過DNA碎片法、蛋白質碎片法、聚合酶聯反應(PCR)、Northern印漬分析、Southern印漬分析、酶聯免疫吸附測定(ELISA)以及2-D凝膠分析等方法來檢測基因的序列同源性、雜交反應或蛋白質結合反應。
12.一種可增加植物產量和儲藏效率的方法，該方法包括用ORE9基因的突變型基因來轉化植物，從而延長植物的壽命。
13.根據權利要求12所述的方法，該方法中突變型基因是一種ore9基因，該基因的核苷酸序列是核苷酸序列SEQ ID NO1上第979個堿基處的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代后形成的。
14.根據權利要求12所述的方法，該方法中的植物可從糧食作物，包括水稻、小麥、大麥、玉米、大豆、馬鈴薯、美國木豆樹、燕麥和黑黍；蔬菜作物，包括擬南芥、大白菜、蘿卜、紅辣椒、草莓、西紅柿、西瓜、黃瓜、卷心菜、甜瓜、南瓜、韭菜(stone-leek)、洋蔥和胡蘿卜；特殊作物，包括人參、煙草植物、棉樹、芝麻、甘蔗、甜菜、紫蘇、花生和油菜；果樹，包括蘋果樹、梨樹、棗樹、桃樹、獼猴桃樹、葡萄樹、柑橘果樹、柿樹、李子樹、杏樹和香蕉樹；花作物，包括玫瑰花、劍蘭、大丁草、康乃馨、菊花、百合和郁金香；飼料作物，包括黑麥草、紅三葉草、果園草(orchardgrass)、紫花苜蓿、高牛毛草和多年生黑麥草等中選取。
全文摘要
本發明涉及一種調控擬南芥葉子壽命的ORE9基因；一種通過抑制與葉子衰老有關的生理和生化改變來延長植物壽命的ORE9基因；以及所述基因的利用。根據本發明，可將葉子壽命調控基因ORE9及其突變基因ORE9用于實際目的，如增加植物的產量和收割前、后的儲藏效率，以及進行生物探針來研究植物中的葉子壽命－相關基因和葉子壽命抑制物質。
文檔編號C12N15/82GK1481391SQ01820922
公開日2004年3月10日 申請日期2001年12月19日 優先權日2000年12月20日
發明者南洪吉, 禹惠蓮 申請人:基諾麥因有限公司, 浦項工科大學校