本發明屬于植物育(yu)種(zhong)(zhong)技術(shu)領域，具(ju)體涉及一種(zhong)(zhong)用于得到(dao)對鹽脅(xie)迫(po)高敏(min)感的(de)植物的(de)質粒載體及方(fang)法。

背景技術：

植(zhi)物經常處于逆境脅迫的(de)環境中(zhong)(zhong)，植(zhi)物應對脅迫常見的(de)響應就是(shi)(shi)促進(jin)活性氧(yang)的(de)積累(lei)(Halliwellet al.，1998)。RCD1蛋白(bai)是(shi)(shi)植(zhi)物逆境和(he)生(sheng)長發(fa)育(yu)過程中(zhong)(zhong)一(yi)個(ge)(ge)重要(yao)的(de)調(diao)節因子(zi)(Jaspers et al.，2009；Teotia Setal.，2009)。SRO是(shi)(shi)植(zhi)物特有的(de)小蛋白(bai)家族，在擬南芥中(zhong)(zhong)，該家族共(gong)有六個(ge)(ge)成(cheng)員，包(bao)括RCD1和(he)5個(ge)(ge)SROs(SIMILAR-TO-RCD-ONE)，即AtSRO1-AtSRO5(Jaspers et al.，2009)。RCD1蛋白(bai)包(bao)含一(yi)個(ge)(ge)保守的(de)球狀WWE結構域(yu)和(he)一(yi)個(ge)(ge)PARP(poly ADP-ribose polymerase)結構域(yu)，WWE結構域(yu)可以調(diao)節特定蛋白(bai)質之間的(de)相互作用(Aravindet al.，2001)。

土壤鹽漬度是一個影響植物生長和農業生產力的重要環境因素，鹽漬土中的Na⁺在植物體細胞質中過度積累對植物生長發育是不利的(Liu et al.，2001)。SOS(salt overly sensitive)途徑負責維持植物體內的Na⁺平衡(Zhu et al.，2002)，Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白SOS1定位于質膜上，它可以將細胞內的Na⁺排出(Qiu et al.，2002)。擬(ni)南(nan)芥中(zhong)，過量(liang)表達SOS1可以提高(gao)抗鹽(yan)脅(xie)迫(po)(po)能力(li)。前人(ren)研(yan)究表明，擬(ni)南(nan)芥SOS1和(he)(he)RCD1在鹽(yan)脅(xie)迫(po)(po)和(he)(he)氧(yang)(yang)化脅(xie)迫(po)(po)時發生相互作用，共同參與植(zhi)物的抗鹽(yan)和(he)(he)抗氧(yang)(yang)化途(tu)徑(Katiyar-Agarwal et al.，2006)。

植物體內對氧化脅迫的響應有利于植物的正常生長發育。前人研究表明酵母的Yap1(Yeast activator proteins 1)參與酵母細胞對H₂O₂引起的氧化脅迫反應，它作為H₂O₂轉錄因(yin)(yin)子(zi)(zi)在氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)脅迫(po)(po)信號(hao)中(zhong)(zhong)扮演(yan)重(zhong)要角(jiao)色(se)(Carmel‐Harel et al.，2001；Fernandes et al.，1997)。植(zhi)物中(zhong)(zhong)有許(xu)多(duo)參與氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)脅迫(po)(po)的相關因(yin)(yin)子(zi)(zi)已被深入研(yan)究，比如致(zhi)病(bing)相關蛋白(RP)、抗壞血酸氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)酶(APX)、苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)和谷胱(guang)甘肽-S-轉移酶(GST)等(Teotia et al.，2009)。Belles-Boix等研(yan)究表(biao)明(ming)，擬南(nan)(nan)芥(jie)RCD1可以增強酵母抗氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)能力并互補Yap1突變(bian)酵母表(biao)型，表(biao)明(ming)AtRCD1在擬南(nan)(nan)芥(jie)的氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)脅迫(po)(po)中(zhong)(zhong)扮演(yan)重(zhong)要的角(jiao)色(se)(Belles-Boix et al.，2000)。擬南(nan)(nan)芥(jie)突變(bian)體rcd1-1表(biao)現出(chu)對臭(chou)氧(yang)(yang)(yang)和超(chao)氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)物超(chao)敏感，引起超(chao)氧(yang)(yang)(yang)根(gen)離子(zi)(zi)的積累，并在短時間(jian)內傳播病(bing)態(Overmyer et al.，2005)。此(ci)外，突變(bian)體還(huan)表(biao)現出(chu)對脫落酸、乙烯、茉莉(li)酸甲酯敏感度降(jiang)低，并且這(zhe)幾種植(zhi)物激素調(diao)節基因(yin)(yin)的表(biao)達量也(ye)發(fa)生了改變(bian)(Overmyer et al.，2000)。因(yin)(yin)此(ci)，AtRCD1在調(diao)節擬南(nan)(nan)芥(jie)的生長發(fa)育及對環境脅迫(po)(po)的反應中(zhong)(zhong)發(fa)揮重(zhong)要作用。

擬南芥中，AtRCD1的同源基因AtSROs在PARP(Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和C-末端的RST[RCD-SRO-TAF4(TATA-box-binding protein-associated factor 4)]結構域上與AtRCD1具有高度保守性(Jaspers et al.，2009)。研究表明，AtSRO1與AtRCD1之間在功能上存在部分功能冗余,AtSRO1同樣參與到非生物脅迫反應當中(Ahlfors et al.，2009；Jaspers et al.，2009；Overmyer et al.，2000)，AtSRO5表達明顯受鹽脅迫誘導(Borsani et al.，2005)，AtSRO2、AtSRO3和AtSRO5也顯示出對多種非生物脅迫下轉錄子水平的變化,比如強光、鹽處理及O₃(Jaspers et al.，2010)。然(ran)而AtSRO4的研究相對較少，沒有相關類(lei)似的功能。

在(zai)擬南芥中RCD1已(yi)經進行(xing)了克隆(long)和(he)功(gong)能鑒定，但是在(zai)蘋果中的(de)尚(shang)未見報(bao)道(dao)。因(yin)此，需要一種(zhong)得到對鹽脅迫具有(you)增強抗性(xing)的(de)植物的(de)方法。

技術實現要素：

為解(jie)決(jue)現有(you)技術的(de)不(bu)足，本發明提供了(le)一(yi)種用于(yu)得到對鹽(yan)脅迫高敏感(gan)的(de)植(zhi)物(wu)(wu)的(de)質粒載(zai)體及(ji)方(fang)法。該技術方(fang)案從(cong)蘋果嘎啦中分離克隆出的(de)抗鹽(yan)相關(guan)基因完整編碼區段的(de)核苷酸序列，同時提供了(le)該基因在抗鹽(yan)的(de)轉(zhuan)基因擬南芥和煙草中的(de)應用，可用于(yu)通過(guo)植(zhi)物(wu)(wu)基因工程技術改善植(zhi)物(wu)(wu)抗鹽(yan)性(xing)和其(qi)他有(you)益生產性(xing)狀(zhuang)。

一種(zhong)用于(yu)得(de)到對鹽脅迫高敏感的(de)植(zhi)(zhi)物的(de)質粒(li)載體，包含MdMAX1基(ji)因表達(da)框(kuang)和篩(shai)選標記(ji)，所(suo)(suo)述MdMAX1基(ji)因表達(da)框(kuang)由包含在植(zhi)(zhi)物中組成型表達(da)的(de)強(qiang)啟(qi)動子(zi)和由所(suo)(suo)述強(qiang)啟(qi)動子(zi)控制表達(da)的(de)MdMAX1基(ji)因，所(suo)(suo)述MdMAX1基(ji)因表達(da)的(de)蛋白序列如SEQ ID NO:1所(suo)(suo)示(shi)。

該基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)片(pian)(pian)段來源于嘎啦(la)蘋果組培苗，其(qi)通過特殊設計的(de)引物(wu)擴增嘎啦(la)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組DNA獲得，其(qi)中(zhong)所述的(de)引物(wu)包括引物(wu)1，5-CCATCACCAATCTATTAAACCT-3，引物(wu)2，5-CAAGAACATTACAGGACTGAAG-3，得到cDNA全長序(xu)列(lie)。該基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)開放閱讀框(open reading frame,ORF)為1623bp，編碼(ma)540個氨基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸。之后利用強啟動子(花椰(ye)菜花葉病毒(du)35S啟動子)驅動原理(li)的(de)轉(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)技(ji)術，將MdMAX1基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)超量(liang)(liang)表(biao)達(da)載體轉(zhuan)入擬南(nan)芥(jie)和煙草(cao)中(zhong)，從而(er)獲得轉(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)植株。超量(liang)(liang)表(biao)達(da)MdMAX1基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)轉(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)擬南(nan)芥(jie)在鹽脅(xie)迫下，萌(meng)發率明顯降低(di)，葉片(pian)(pian)中(zhong)活(huo)性氧(yang)物(wu)質(zhi)含量(liang)(liang)顯著增多(duo)；同時(shi)MdMAX1基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)達(da)量(liang)(liang)顯著提高的(de)遺傳(chuan)轉(zhuan)化(hua)煙草(cao)對鹽脅(xie)迫更(geng)加敏感(gan)，說明MdMAX1基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在植株抗鹽中(zhong)發揮重要(yao)作用。

優選的，所(suo)述MdMAX1基因的序(xu)列(lie)如SEQ ID NO:2所(suo)示。

優選(xuan)的，所述(shu)植(zhi)物是擬南(nan)芥、蘋果或煙草。

優(you)選的，所(suo)述(shu)質粒載體由所(suo)述(shu)MdMAX1基因順著CaMV35S啟動子(zi)的轉錄方向插入到(dao)pCAMBIA 1300質粒的BamHⅠ和PsTⅠ之(zhi)間得到(dao)。

本發明(ming)還提供(gong)了(le)一種(zhong)用(yong)于得到(dao)對鹽脅(xie)迫(po)高(gao)(gao)敏感的(de)植(zhi)物的(de)方法，包括(kuo)以下步(bu)驟：將(jiang)(jiang)權利要求1-4中(zhong)任(ren)一項所述的(de)質粒(li)載體(ti)導入到(dao)植(zhi)物細胞中(zhong)，篩選攜帶(dai)有所述質粒(li)載體(ti)的(de)植(zhi)物細胞，并(bing)將(jiang)(jiang)其培育成植(zhi)株，即得到(dao)對鹽脅(xie)迫(po)高(gao)(gao)敏感的(de)植(zhi)物。

具體的，所述(shu)植物是(shi)擬(ni)南芥、蘋果或煙(yan)草(cao)。

當為擬南芥時，用于得到對鹽脅迫(po)高敏感的植物的方法包括以下步驟：

1)用所述質粒載體轉化農桿(gan)菌LBA4404，得(de)到攜帶有所述質粒載體的(de)農桿(gan)菌LBA4404；

2)用所述(shu)攜帶有所述(shu)質粒載體的農(nong)桿菌(jun)LBA4404制作為(wei)侵染液(ye)；

3)用所述侵(qin)染液(ye)侵(qin)染擬(ni)南芥花(hua)序，收(shou)集果莢(jia)，抗(kang)性篩選(xuan)后，PCR檢測得(de)到(dao)(dao)陽性轉(zhuan)基因植株(zhu)，經過(guo)連續多代(dai)篩選(xuan)得(de)到(dao)(dao)純合(he)體，收(shou)取種子，培養，得(de)到(dao)(dao)對鹽脅迫高(gao)敏感的(de)擬(ni)南芥。

具體的，包(bao)括以下(xia)步驟：

1)將獲得的擬南芥種子，分別(bie)用70％酒精(jing)消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min，滅菌水沖洗(xi)5次，吸干水，播種于種子萌發培養(yang)基上，光培養(yang)，至小(xiao)苗(miao)長出，移(yi)栽到(dao)基質培養(yang)到(dao)開花；

2)選(xuan)取農桿菌LBA4404單克隆菌落接種于10mL YEP液(ye)體培(pei)養(yang)基(ji)中，28℃、200rpm，振蕩(dang)培(pei)養(yang)至(zhi)OD600為(wei)06-0.8；取其(qi)中lmL菌液(ye)加(jia)入(ru)20mL YEP液(ye)體培(pei)養(yang)基(ji)內，28℃、200rpm，振蕩(dang)培(pei)養(yang)至(zhi)OD600為(wei)06-0.8，離心(xin)收(shou)集菌體，用稀(xi)(xi)釋液(ye)懸浮稀(xi)(xi)釋20倍，得到(dao)侵(qin)染液(ye)，備用；

3)將(jiang)擬(ni)南芥花序(xu)浸到侵染(ran)液(ye)中15-20s，收(shou)集(ji)果莢，50mg·L-1Hyg抗性篩(shai)選后，PCR檢測(ce)得到陽性轉基因(yin)植株，經(jing)過連續3代(dai)篩(shai)選得到T3代(dai)純(chun)合體，收(shou)取種子，培養，得到對(dui)鹽(yan)脅迫高敏感(gan)的(de)擬(ni)南芥。

當(dang)為煙草(cao)時(shi)，用于得到(dao)對(dui)鹽脅迫高敏感的植物的方法包(bao)括以下步驟：

1)用所(suo)述(shu)(shu)質粒(li)載(zai)體(ti)轉化農(nong)桿菌LBA4404，得到攜帶(dai)有所(suo)述(shu)(shu)質粒(li)載(zai)體(ti)的農(nong)桿菌LBA4404；

2)用所述(shu)攜帶有所述(shu)質粒載體的農(nong)桿菌LBA4404轉化為侵染液；

3)用所述侵(qin)(qin)染液(ye)侵(qin)(qin)染煙(yan)草的(de)幼嫩(nen)組織，分化培養(yang)得到(dao)初代芽(ya)體后切下(xia)進行繼代培養(yang)，生根培養(yang)，得到(dao)對鹽(yan)脅迫(po)高敏感的(de)煙(yan)草。

具體的，包括以下步驟(zou)：

1)播種：將獲得的煙草(cao)種子，分別用70％酒精消毒(du)1min，0.7％次氯酸鈉(na)消毒(du)23-25min，滅菌水沖(chong)洗3次，吸干水。播種于(yu)種子萌發培養基上，光培養；

2)預(yu)(yu)培養：剪下幼嫩葉(xie)片(pian)，切成方形(xing),葉(xie)片(pian)向光(guang)面向上擺放于預(yu)(yu)培養培養基上，倒置培養1d；

3)選(xuan)取農桿菌(jun)(jun)LBA4404單克隆菌(jun)(jun)落接種于10mL YEP液(ye)體培(pei)(pei)養基(ji)中，28℃、200rpm，振(zhen)蕩培(pei)(pei)養至(zhi)OD600為06-0.8；取其中lmL菌(jun)(jun)液(ye)加入20mL YEP液(ye)體培(pei)(pei)養基(ji)內，28℃、200rpm，振(zhen)蕩培(pei)(pei)養至(zhi)OD600為06-0.8，離心(xin)收集(ji)菌(jun)(jun)體，用(yong)(yong)MS液(ye)體培(pei)(pei)養基(ji)懸浮稀(xi)釋20倍，得到侵染液(ye)，備用(yong)(yong)；

4)將經預培(pei)養(yang)的煙草葉片浸入(ru)菌(jun)液(ye)(ye)10min，期間多次(ci)搖晃(huang)；然后倒掉菌(jun)液(ye)(ye)，用無菌(jun)濾紙吸干多余菌(jun)液(ye)(ye)，轉移(yi)至共培(pei)養(yang)基(ji)(ji)上，封口，28℃暗(an)培(pei)養(yang)1d，之(zhi)后，移(yi)至分化培(pei)養(yang)基(ji)(ji)上培(pei)養(yang)，每隔15d更換一次(ci)培(pei)養(yang)基(ji)(ji)。

5)待(dai)芽長至2cm時，切下，部(bu)分(fen)繼續繼代培養(yang)，部(bu)分(fen)移(yi)入MS生(sheng)根(gen)(gen)培養(yang)基(ji)上(shang)進行生(sheng)根(gen)(gen)。根(gen)(gen)系發育好后(hou)，煉苗(miao)后(hou)移(yi)入盛(sheng)有基(ji)質的(de)營養(yang)缽中，溫室常規管理，得(de)到(dao)對鹽脅迫高敏(min)感的(de)煙(yan)草。

總體上，本發明的發明人基于首(shou)次發現了從蘋果中分離克(ke)隆出的抗鹽(yan)相關基因完整(zheng)編(bian)碼區段的DNA片段，并命名為MdMAX1，從而提供(gong)了用(yong)于得到對鹽(yan)脅迫高(gao)敏感(gan)的植物的方(fang)法(fa)。

附圖說明

圖1：MdMAX1與其(qi)同源基因(yin)蛋白(bai)序(xu)列比對(dui)。

圖(tu)2：嘎(ga)啦組培苗在不同逆境(jing)處理條件下，MdMAX1基因的相對表達量。

分別用100mMNaCl(左圖)和300mM甘露醇(右圖)處理嘎(ga)啦(la)蘋果組培(pei)苗(miao)，分別于0h、3h、6h、12h、24h取樣，用液氮固定，進行RNA提取并反(fan)轉錄作為模板，檢測(ce)MdMAX1基(ji)因(yin)的相對表(biao)達(da)量(liang)。

圖3：超量表達構(gou)建載(zai)體pCAMBIA1300圖譜。

圖(tu)4：野生型(xing)擬南(nan)芥(jie)(col)和轉基因擬南(nan)芥(jie)株系(xi)(#3、#5、#7、#8)的半(ban)定量RT-PCR以及定量PCR檢測MdMAX1基因表(biao)達量。野生型(xing)擬南(nan)芥(jie)(col)中MdMAX1表(biao)達量為1。

圖5：鹽和(he)甘(gan)露(lu)醇脅迫(po)下擬(ni)南芥種(zhong)子萌發實驗。(A-C)在1/2MS，150mMNaCl、300mM甘(gan)露(lu)醇培養基(ji)下，野生型擬(ni)南芥(col)和(he)轉基(ji)因擬(ni)南芥株系(#3、#5、#7、#8)萌發情況觀察及統計。(D)不同濃度(du)NaCl(75mM、125mM和(he)150mM)處(chu)理(li)以及不同濃度(du)甘(gan)露(lu)醇(200mM、300mM)處(chu)理(li)，擬(ni)南芥萌發情況統計。

圖(tu)6：DAB和NBT染(ran)色觀察離體(ti)葉片活性(xing)氧(yang)積累情況。野生型(xing)擬(ni)(ni)南(nan)芥(col)和轉基因(yin)擬(ni)(ni)南(nan)芥株系(#3、#5、#7、#8)離體(ti)葉片150mMNaCl和200mM甘(gan)露醇處(chu)理4h,DAB和NBT染(ran)色觀察葉片中活性(xing)氧(yang)(H2O2和O2-)含量(liang)。

圖7：野生(sheng)型(xing)煙草(NC89)和(he)轉基(ji)(ji)因(yin)擬南芥(jie)株系(MAX1-9、MAX1-11和(he)MAX1-17)定量(liang)PCR檢測(ce)MdMAX1基(ji)(ji)因(yin)表(biao)達量(liang)。基(ji)(ji)因(yin)表(biao)達量(liang)最低(di)的MAX1-11株系中MdMAX1基(ji)(ji)因(yin)表(biao)達量(liang)設定為1。

圖(tu)8：野(ye)生型煙草(NC89)和轉基因擬南芥株系(MAX1-9、MAX1-11和MAX1-17)用300mMNaCl處理15天后表(biao)型觀(guan)察。

具體實施方式

以(yi)下(xia)對(dui)本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)原理和特(te)征進行描述，根(gen)據以(yi)上的(de)(de)描述和這些實施例，本(ben)(ben)領域技術(shu)人員可以(yi)確定本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)基本(ben)(ben)特(te)征，并(bing)且在(zai)不偏離本(ben)(ben)發(fa)明精神和范圍的(de)(de)情況下(xia)，可以(yi)對(dui)本(ben)(ben)發(fa)明做出各種改變和修改，以(yi)使(shi)其適用各種用途和條件。除(chu)特(te)殊注明外，本(ben)(ben)發(fa)明所采用的(de)(de)均為本(ben)(ben)領域現有技術(shu)。

實施例1：分(fen)離(li)克隆MdMAX1基(ji)因和(he)基(ji)因結構分(fen)析

1.從蘋果嘎啦品種中分離克隆MdMAX1基因

(1)嘎(ga)啦組培(pei)葉片RNA提取及反轉錄(lu)

方法同MdSIMYB1專(zhuan)利(專(zhuan)利201210197919.5)中實例1中的步驟一(yi))、二)、三)

(2)cDNA全(quan)長(chang)序列(lie)的獲得

根據NCBI查(cha)到的擬(ni)南(nan)芥(jie)中MAX1基因保(bao)守氨基酸(suan)序列(lie)，設計兼并引物(wu)(MdMAX1-F,MdMAX1-R)，以(yi)實例(li)1步驟一)反轉錄合成的cDNA為模板進(jin)行(xing)PCR擴增。

MdMAX1-F：5’-CCATCACCAATCTATTAAACCT-3’，其序列如(ru)SEQ.ID.NO.3所示；

MdMAX1-R：5’-CAAGAACATTACAGGACTGAAG-3’，其序(xu)列如SEQ.ID.NO.4所示；

PCR擴增體系(xi)方法同MdSIMYB1專(zhuan)利(li)(專(zhuan)利(li)號201210197919.5)中(zhong)實例(li)1步驟四)中(zhong)2)的(de)PCR體系(xi)。

PCR反(fan)(fan)應程序(xu)(xu)：94℃預變性5分鐘(zhong)；循(xun)環參數(shu)為94℃變性40秒(miao)、56℃退(tui)火40秒(miao)、72℃延伸90秒(miao)，進(jin)行(xing)(xing)(xing)32個循(xun)環；72℃充(chong)分延伸10分鐘(zhong)。PCR反(fan)(fan)應結(jie)束后(hou)，PCR產物進(jin)行(xing)(xing)(xing)回收、載(zai)體連接(jie)、轉化(具體方法參見(jian)專利201210197919.5實例1步驟四)中的1)，在北京六合(he)華大基(ji)因科(ke)技股份(fen)有限公司進(jin)行(xing)(xing)(xing)序(xu)(xu)列測定后(hou)，得(de)到MdMAX1基(ji)因，其核苷酸序(xu)(xu)列如(ru)SEQ.ID.NO.1所示；其氨基(ji)酸序(xu)(xu)列如(ru)SEQ.ID.NO.2所示。測序(xu)(xu)正確的單(dan)克隆，堿法提(ti)取pMD18-T-MdMAX1的質粒DNA，-20℃保存，用于后(hou)續功能驗(yan)證實驗(yan)。

2.蘋果MdMAX1基因產物的結構和氨基酸序列分析

該基因(yin)(yin)(yin)的開放閱讀框(open reading frame,ORF)為1623bp。由此推得(de)，該基因(yin)(yin)(yin)編碼540個氨基酸(suan)。將其(qi)氨基酸(suan)序列在國際(ji)基因(yin)(yin)(yin)庫中檢索，發(fa)現與已公布的擬南芥(jie)，葡萄，油菜等基因(yin)(yin)(yin)有較高(gao)的同源性。所以我(wo)們將該基因(yin)(yin)(yin)命(ming)名為MdMAX1。(附圖1)

實施例2：MdMAX1基因在鹽脅迫處理下表達模(mo)式分析

(1)將生長狀況一(yi)致(zhi)的(de)蘋果嘎啦(la)組(zu)培苗，分別用NaCl(100mM)、甘露醇(300mM)處(chu)理蘋果組(zu)培苗0h、3h、6h、12h、24h，用未(wei)處(chu)理的(de)狀態一(yi)致(zhi)的(de)材料(liao)做對照。材料(liao)取好后液氮中(zhong)迅(xun)速固定(ding)，提取RNA并反轉錄得cDNA。。

(2)在(zai)MdMAX1基因的(de)非保守區設計特異引物MdMAX1(qRT)-F、MdMAX1(qRT)-R，及蘋果的(de)內(nei)參引物Md18S-F、Md18S-R。

Md18S-F：5’-AAACGGCTACCACATCCA-3’；

Md18S-R：5’-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’；

MdMAX1(qRT)-F:5’-ATCAGCCACCACAGCATTCACAT-3’；

MdMAX1(qRT)-R：5’-GCGGTCCAAATCCATCAATCTCTGC-3’；

(3)用實例3步驟(1)中所得的cDNA為模板(ban)，用蘋果內參引物Md18S-F和Md18S-R調整這些cDNA模板(ban)，使各cDNA模板(ban)濃度一致。

反應程序為：94℃預(yu)變性4分(fen)鐘(zhong)；循環參數為94℃變性25秒(miao)、56℃退火25秒(miao)、72℃延伸(shen)30秒(miao)，運(yun)行(xing)25個(ge)循環；72℃后延伸(shen)l0分(fen)鐘(zhong)。擴增產物在1％瓊脂糖凝(ning)膠上做電泳分(fen)析(xi)，用Lab Assistant TM Gel3000Series凝(ning)膠成像分(fen)析(xi)儀檢(jian)測條帶亮度(du)，據結果將(jiang)cDNA稀釋至適當倍(bei)數，使其濃度(du)一致。

(4)用濃度一致的(de)cDNA模板進行定量PCR，檢測(ce)嘎啦組培苗經逆境處理(li)后MdMAX1基(ji)因的(de)表達差異。

結(jie)果顯示MdMAX1基因經鹽和(he)甘(gan)露(lu)醇脅迫處理后(hou)表達(da)上(shang)調，表明該基因受鹽和(he)甘(gan)露(lu)醇脅迫誘導(附圖2左(zuo)NaCl處理，右甘(gan)露(lu)醇處理)

實施例3：MdMAX1基因載(zai)體(ti)的構(gou)建

為研究(jiu)MdMAX1基因(yin)的功能，將包(bao)含有MdMAX1基因(yin)編碼(ma)區在內的共1623bp片段正確插入表(biao)達載(zai)體pCAMBIA 1300上。(附(fu)圖3)

(1)利用DNAMAN等軟件，根據分離出的(de)MdMAX1基(ji)因的(de)核苷酸序列(SEQ.ID.NO:1)，設(she)計帶(dai)酶切(qie)位(wei)點(dian)的(de)引物EMdMAX1-F和EMdMAX1-R，以實(shi)例1步驟(zou)二)中(zhong)4)所保(bao)存的(de)pMD18-T-MdMAX1的(de)質粒(li)DNA為模板，進行PCR反(fan)應。

EMdMAX1-F：5’-GGATCCCCATCACCAATCTATTAAACCT-3’其序列(lie)如SEQ.ID.NO.5所示；

劃(hua)橫線部分(fen)為BamHⅠ酶切位點；

EMdMAX1-R：5’-CTGCAGCAAGAACATTACAGGACTGAAG-3’其(qi)序列如SEQ.ID.NO.6所示；

劃橫線部分為PstⅠ酶切位點；

(2)PCR反應(ying)結束后，進(jin)行1.0％瓊脂(zhi)糖凝膠電泳、PCR產物回收(shou)、載體連接、轉(zhuan)化、測序(xu)(具體步(bu)驟參(can)見專利201210197919.5實例1步(bu)驟四(si))中的(de)1)。堿法提(ti)取其(qi)質粒DNA，用(yong)BamHⅠ和PstⅠ雙酶切，鑒定(ding)正確后用(yong)于后面的(de)實驗。

(3)用(yong)BamHⅠ和PstⅠ兩個(ge)內切(qie)酶(mei)，同時雙酶(mei)切(qie)中的(2)所得質(zhi)粒DNA與pCAMBIA 1300質(zhi)粒，回收MdMAX1的片段和pCAMBIA 1300載體片段，用(yong)T4連(lian)接酶(mei)將二者連(lian)接起來。篩(shai)選陽性(xing)克隆進行測序，從中選擇正確的重組子pCAMBIA 1300-MdMAX1。

(4)用(yong)構建好的重組(zu)子pCAMBIA 1300-MdMAX1轉化(hua)農桿(gan)菌LB4404感受態細胞。進(jin)(jin)行PCR鑒定，挑取陽性菌落進(jin)(jin)行測序(xu)(xu)。測序(xu)(xu)正確的重組(zu)子pCAMBIA 1300-MdMAX1單克隆用(yong)于(yu)后面擬南芥和(he)煙草的轉化(hua)。

實(shi)施例4：轉(zhuan)基因擬南芥和(he)煙草的獲得

(1)獲得轉基因擬南芥

1.將獲得(de)的擬南芥種(zhong)(zhong)子，分(fen)別(bie)用70％酒精消(xiao)毒(du)3min，4％次氯酸鈉消(xiao)毒(du)8-10min(期間(jian)多(duo)次搖(yao)晃(huang))，滅菌水沖洗5次，吸干(gan)水。播種(zhong)(zhong)于種(zhong)(zhong)子萌發培(pei)(pei)養基(ji)上(直(zhi)接鋪于表面)，光培(pei)(pei)養(25-28℃，16h長日照/8h短(duan)日照，10d)，至小苗長出。移栽到基(ji)質培(pei)(pei)養到開(kai)花。

2.挑取(qu)農桿菌(jun)(jun)單克隆菌(jun)(jun)落接種于10mL YEP液體(ti)培養(yang)基(含(han)50mg/L潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩(dang)培養(yang)至(zhi)OD600為(wei)06-0.8(約48h)；取(qu)其中lmL菌(jun)(jun)液加(jia)入(ru)20mL YEP液體(ti)培養(yang)基內，28℃、200rpm，振蕩(dang)培養(yang)至(zhi)OD600為(wei)06-0.8(約5h)。離心收集菌(jun)(jun)體(ti)，用(yong)侵染(ran)液(含(han)0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％Silweet)懸浮(fu)稀(xi)釋20倍，備用(yong)；

3.將擬南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果莢，50mg·L^-1Hyg抗性篩選后，PCR檢測得(de)(de)到陽(yang)性轉基因植株，經過(guo)連續3代(dai)篩選得(de)(de)到T3代(dai)純合體，收取(qu)種子，進行表型分析(xi)。

(2)獲得轉(zhuan)基因煙草

1.播種(zhong)：將獲得(de)的煙(yan)草種(zhong)子，分(fen)別用(yong)70％酒精消毒1min，0.7％次氯酸鈉消毒23-25min(期間(jian)多次搖晃)，滅菌水沖洗3次，吸干水。播種(zhong)于(yu)種(zhong)子萌發培(pei)養基上(直接鋪(pu)于(yu)表面)，光培(pei)養(25-28℃，16h長日(ri)照(zhao)/8h短日(ri)照(zhao)，15d)。

2.預培養(yang)(yang)：剪下幼嫩葉片，切(qie)成(cheng)方(fang)形(xing)(約1cm),葉片向(xiang)光面向(xiang)上擺放于(yu)預培養(yang)(yang)培養(yang)(yang)基(ji)上，倒置培養(yang)(yang)1d。

3.挑取農桿菌(jun)單克隆菌(jun)落接種于10mL YEP液(ye)體(ti)(ti)培養(yang)(yang)基(ji)(含50mg/L潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養(yang)(yang)至(zhi)OD600為(wei)06-0.8(約48h)；取其中lmL菌(jun)液(ye)加入20mL YEP液(ye)體(ti)(ti)培養(yang)(yang)基(ji)內(nei)，28℃、200rpm，振蕩培養(yang)(yang)至(zhi)OD600為(wei)06-0.8(約5h)。離心(xin)收集菌(jun)體(ti)(ti)，用(yong)MS液(ye)體(ti)(ti)培養(yang)(yang)基(ji)懸(xuan)浮稀(xi)釋20倍(bei)，備用(yong)；

4.將經預培(pei)養(yang)的(de)煙草葉片(pian)浸入(ru)菌(jun)液(ye)(ye)10min，期間多次(ci)搖(yao)晃(huang)；然(ran)后(hou)(hou)倒(dao)掉(diao)菌(jun)液(ye)(ye)，用無菌(jun)濾紙吸干多余菌(jun)液(ye)(ye)，轉移(yi)(yi)至共培(pei)養(yang)基上，封口，28℃暗培(pei)養(yang)1d。之后(hou)(hou)，移(yi)(yi)至分(fen)化培(pei)養(yang)基上培(pei)養(yang)(條(tiao)件(jian)：28℃，光照時(shi)間16h/d，光照強度(du)2000Lux)。每隔15d更(geng)換一次(ci)培(pei)養(yang)基。

5.待芽(ya)長至2cm左右時，切下，部分繼續繼代(dai)培(pei)養，部分移入MS生(sheng)根(gen)培(pei)養基上進行生(sheng)根(gen)。根(gen)系發育好后，煉(lian)苗后移入盛有基質的營(ying)養缽中(zhong)，溫(wen)室常規(gui)管理。

種子(zi)萌發培養基：1/2MS

煙草預培(pei)養、共(gong)培(pei)養培(pei)養基：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L

煙草分化培養基(ji)：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Hyg 30mg/L+Cb250mg/L.

煙草生根培養(yang)基：MS+IAA 0.1mg/L

實施例5：MdMAX1基因(yin)在擬(ni)南芥中功(gong)能(neng)驗證

利用篩(shai)(shai)選培(pei)養基(含100mg/L潮(chao)(chao)霉素(su)(su))篩(shai)(shai)選抗潮(chao)(chao)霉素(su)(su)陽(yang)性的(de)候選轉基因株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)，共獲得4個35S:MdMAX1陽(yang)性株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)(#3、#5、#7和(he)#8)；為進一(yi)步鑒定(ding)轉基因株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)，在進行(xing)繼代培(pei)養時，每株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)各(ge)取(qu)0.1g左右的(de)組培(pei)苗(miao)，提取(qu)相應的(de)RNA，反轉錄并進行(xing)半定(ding)量RT-PCR檢測和(he)定(ding)量，以確定(ding)這些株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)中MdMAX1基因的(de)表達水平。結果顯示，MdMAX1基因在#3、#5、#7及(ji)#8中過量表達(附圖4)。

為了進(jin)一步確(que)定轉基因植株的(de)功能，我們(men)在鹽脅迫條件下對擬南(nan)芥(jie)(jie)的(de)萌(meng)發率(lv)進(jin)行統計，同(tong)時觀察擬南(nan)芥(jie)(jie)葉片在脅迫下氧化性物質的(de)積累情況。

1)種子處理。將(jiang)獲得的擬南芥種子(col，#3，#5，#7，#8)，分別用(yong)70％酒精消毒(du)3min，4％次氯酸鈉消毒(du)8-10min(期(qi)間多次搖晃)，滅菌水(shui)沖洗5次，吸干水(shui)。播(bo)種于種子萌發培(pei)(pei)養(yang)基上(1/2MS，含75mM、100mM、125mM、150mMNaCl及200mM、300mM甘(gan)露醇)。4℃層積處理4天后至光(guang)下培(pei)(pei)養(yang)(25-28℃，16h長日(ri)照/8h短(duan)日(ri)照，10d)。

2)種(zhong)子萌發(fa)統(tong)(tong)計(ji)。光(guang)學(xue)顯微鏡下觀察統(tong)(tong)計(ji)種(zhong)子萌發(fa)率(lv)。

3)結果觀察。在1/2MS培養基上，野生型和轉基因株系種子萌發沒有明顯的差異；在含有150mMNaCl和300mM甘露醇的培養基上，轉基因株系種子萌發比野生型明顯慢，同時在不同濃度NaCl和甘露醇處理的培養基上，也顯示出同樣的結果(附圖5)。對離體的葉片NaCl和甘露醇處理后，觀察活性氧含量，結果顯示，轉基因株系葉片中活性氧物質(H2O2和O2^-)含量(liang)比野生型更多(duo)。(附圖(tu)6)這說(shuo)明超量(liang)表達(da)MdMAX1基(ji)因的轉基(ji)因擬南(nan)芥對鹽脅迫更敏(min)感。

實(shi)施例6：MdMAX1基(ji)因在(zai)煙草中(zhong)功(gong)能驗證

按照實施例5所示的方法，準備超(chao)量表達MdMAX1基(ji)因(yin)的轉(zhuan)基(ji)因(yin)煙草。定(ding)量PCR結果顯(xian)示，獲得MAX1-9，MAX1-11，MAX1-17三個轉(zhuan)基(ji)因(yin)煙草。(附圖(tu)7)

選(xuan)擇生(sheng)長狀態良好且(qie)均一的(de)3個轉(zhuan)基(ji)因株系和野生(sheng)型(xing)的(de)煙草(cao)幼苗，進行鹽(yan)脅迫逆(ni)境處理(li)。如圖所示，在鹽(yan)處理(li)15天(tian)后，轉(zhuan)基(ji)因煙草(cao)顯示出更嚴重的(de)枯萎表(biao)(biao)型(xing)。結果表(biao)(biao)明，超量表(biao)(biao)達MdMAX1基(ji)因的(de)轉(zhuan)基(ji)因煙草(cao)對鹽(yan)脅迫更敏(min)感。(附圖8)。

綜上所述，這些結果充分說明了(le)MdMAX1基因是一個抗(kang)(kang)鹽相(xiang)關的基因，該基因的過量表達可以降低植株(zhu)的抗(kang)(kang)鹽能力。

以(yi)(yi)上所述僅為(wei)本(ben)發明(ming)的較(jiao)佳(jia)實施(shi)例，并不用以(yi)(yi)限制(zhi)本(ben)發明(ming)，凡(fan)在(zai)(zai)本(ben)發明(ming)的精神和原則之(zhi)內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在(zai)(zai)本(ben)發明(ming)的保護范圍之(zhi)內。