本(ben)發明屬于分子生物(wu)(wu)(wu)學領域，具體涉及(ji)與(yu)一種(zhong)亞油(you)酸含量(liang)(liang)相關(guan)的(de)芝(zhi)麻基(ji)(ji)因sifad2，同時還涉及(ji)該(gai)基(ji)(ji)因在(zai)釀(niang)酒(jiu)酵(jiao)母(mu)微生物(wu)(wu)(wu)初生代(dai)謝物(wu)(wu)(wu)分泌(mi)和(he)作物(wu)(wu)(wu)品質育(yu)種(zhong)中的(de)應用(yong)，亞油(you)酸含量(liang)(liang)相關(guan)芝(zhi)麻基(ji)(ji)因sifad2在(zai)釀(niang)酒(jiu)酵(jiao)母(mu)細胞和(he)擬南芥中的(de)過量(liang)(liang)表達表明，此(ci)基(ji)(ji)因可顯著提高釀(niang)酒(jiu)酵(jiao)母(mu)細胞和(he)植物(wu)(wu)(wu)種(zhong)子的(de)亞油(you)酸含量(liang)(liang)，應用(yong)于改良(liang)微生物(wu)(wu)(wu)出油(you)品質和(he)作物(wu)(wu)(wu)品質。

背景技術：

芝(zhi)麻(ma)(sesamumindicuml.)屬胡麻(ma)科草本植物(wu)，世界范圍內廣(guang)泛栽培(pei)和(he)利(li)用的優(you)質油(you)料和(he)特色經濟作物(wu)。芝(zhi)麻(ma)種子含(han)油(you)量高，平(ping)(ping)均可達(da)55％，有(you)(you)“油(you)料皇后”之(zhi)美稱，含(han)有(you)(you)豐(feng)富的蛋(dan)白質、甾醇、卵磷脂、維生(sheng)素(su)e等(deng)營養成(cheng)分，還富含(han)鈣、磷、鐵等(deng)重要(yao)元(yuan)素(su)，芝(zhi)麻(ma)中的芝(zhi)麻(ma)素(su)和(he)芝(zhi)麻(ma)酚林等(deng)特色保健(jian)成(cheng)分，經研究證明(ming)具有(you)(you)強抗(kang)氧化和(he)抗(kang)癌等(deng)功能。因(yin)此，芝(zhi)麻(ma)廣(guang)受人民喜愛，其需求(qiu)量和(he)消費量隨著人民生(sheng)活水平(ping)(ping)的上升而逐年增加。芝(zhi)麻(ma)中脂肪(fang)酸含(han)量豐(feng)富，主要(yao)由亞(ya)油(you)酸和(he)油(you)酸組成(cheng)，其比例分別占芝(zhi)麻(ma)脂肪(fang)酸總(zong)量的44.32％和(he)42.18％。

亞(ya)(ya)油(you)酸(suan)(suan)屬ω-6系(xi)不飽和(he)(he)脂(zhi)肪酸(suan)(suan)，是(shi)其(qi)他不飽和(he)(he)脂(zhi)肪酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)前(qian)體，是(shi)人(ren)(ren)和(he)(he)動物營養中必(bi)需(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)肪酸(suan)(suan)，具有(you)重(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)生理功能(neng)。亞(ya)(ya)油(you)酸(suan)(suan)參與磷脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)合成(cheng)并(bing)以(yi)磷脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)形式(shi)作(zuo)為(wei)(wei)線(xian)粒體和(he)(he)細(xi)胞(bao)膜的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)成(cheng)分(fen)，促(cu)進膽固醇(chun)(chun)和(he)(he)類脂(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)代謝，合成(cheng)前(qian)列腺素的(de)(de)(de)(de)(de)前(qian)體，保護皮膚免受由(you)x射線(xian)引起的(de)(de)(de)(de)(de)損(sun)害，有(you)利于促(cu)進動物精子的(de)(de)(de)(de)(de)形成(cheng)等。除此之(zhi)外，亞(ya)(ya)油(you)酸(suan)(suan)還有(you)助(zhu)于生長、發育以(yi)及(ji)妊娠。人(ren)(ren)體缺乏(fa)亞(ya)(ya)油(you)酸(suan)(suan)會出(chu)現(xian)生長過緩(huan)甚至停滯以(yi)及(ji)皮膚損(sun)傷等癥(zheng)(zheng)狀，因此說，亞(ya)(ya)油(you)酸(suan)(suan)是(shi)最為(wei)(wei)有(you)效、也最為(wei)(wei)普遍的(de)(de)(de)(de)(de)ω-6脂(zhi)肪酸(suan)(suan)。對(dui)人(ren)(ren)體主要(yao)功能(neng)還包括降血(xue)(xue)脂(zhi)，預防動脈硬化、高膽固醇(chun)(chun)血(xue)(xue)癥(zheng)(zheng)和(he)(he)高血(xue)(xue)脂(zhi)癥(zheng)(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用以(yi)及(ji)提(ti)高細(xi)胞(bao)免疫功能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用。同時，亞(ya)(ya)油(you)酸(suan)(suan)在工業(ye)上(shang)應用也較多，亞(ya)(ya)油(you)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)鈉(na)鹽或鉀鹽是(shi)肥(fei)皂的(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)分(fen)之(zhi)一，并(bing)可用作(zuo)乳化劑等表面活(huo)性劑。

油(you)(you)酰(xian)磷脂(zhi)酰(xian)膽堿去飽和酶(mei)(mei)(l-acyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine△12-desaturase，fad2)，存在(zai)于內質網上，其(qi)可以(yi)催化(hua)(hua)單不飽和脂(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)脫氫形(xing)成第(di)(di)二個(ge)雙(shuang)鍵(jian)(jian)，雙(shuang)鍵(jian)(jian)位于脂(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)烴鏈(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)(di)12個(ge)碳位置上，是(shi)(shi)形(xing)成多不飽和脂(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)(di)一步(bu)反應，主(zhu)要催化(hua)(hua)油(you)(you)酸(suan)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)為亞(ya)油(you)(you)酸(suan)，對植(zhi)(zhi)物(wu)油(you)(you)中(zhong)(zhong)(zhong)油(you)(you)酸(suan)和亞(ya)油(you)(you)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)含量、比(bi)例均具有調(diao)控作(zuo)用(yong)，是(shi)(shi)植(zhi)(zhi)物(wu)脂(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)代謝通路中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)關鍵(jian)(jian)酶(mei)(mei)。fad2基(ji)因(yin)是(shi)(shi)油(you)(you)酰(xian)磷脂(zhi)酰(xian)膽堿去飽和酶(mei)(mei)(fad2酶(mei)(mei))的(de)(de)(de)(de)(de)編碼基(ji)因(yin)，故其(qi)是(shi)(shi)調(diao)控植(zhi)(zhi)物(wu)中(zhong)(zhong)(zhong)油(you)(you)酸(suan)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)為亞(ya)油(you)(you)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)關鍵(jian)(jian)基(ji)因(yin)。目前，多種植(zhi)(zhi)物(wu)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)fad2基(ji)因(yin)被分離得到，包括油(you)(you)菜(cai)、花生(sheng)、大(da)豆、向(xiang)日葵(kui)、玉米等食(shi)用(yong)油(you)(you)農作(zuo)物(wu)，也包括擬(ni)南芥(jie)(jie)、煙草、菠菜(cai)等非(fei)食(shi)用(yong)油(you)(you)作(zuo)物(wu)，以(yi)及橄欖(lan)、蓖麻等木本植(zhi)(zhi)物(wu)。khadake等(2009)發(fa)(fa)現亞(ya)麻lufad2-2和lufad2被轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)到釀(niang)酒酵(jiao)母(mu)中(zhong)(zhong)(zhong)，兩基(ji)因(yin)在(zai)釀(niang)酒酵(jiao)母(mu)中(zhong)(zhong)(zhong)表(biao)達(da)，并具有油(you)(you)酸(suan)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)為亞(ya)油(you)(you)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。okuley(1994)等在(zai)擬(ni)南芥(jie)(jie)中(zhong)(zhong)(zhong)發(fa)(fa)現fad2基(ji)因(yin)，并將其(qi)分離克(ke)隆出(chu)來(lai)，通過研究得出(chu)：fad2是(shi)(shi)編碼油(you)(you)酸(suan)去飽和酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)重要基(ji)因(yin)，在(zai)植(zhi)(zhi)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)整個(ge)生(sheng)長發(fa)(fa)育期均有表(biao)達(da)。

技術實現要素：

本發明(ming)所要解決(jue)的(de)技術問題包括提供一種(sesamumindicuml.)亞油(you)酸含量相(xiang)關(guan)的(de)芝(zhi)麻(ma)基因sifad2、編碼蛋(dan)白及應用。

為解決(jue)上述技術問(wen)題(ti)，本發明(ming)采(cai)用的技術方(fang)案如下：

提供一(yi)種亞油(you)(you)酸(suan)(suan)含量(liang)(liang)(liang)相關的(de)芝麻基(ji)因(yin)(yin)(yin)sifad2，該基(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)核苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)為seqidno.1所示，或為由該序(xu)列(lie)在添加(jia)、取代、插入或缺失一(yi)個(ge)或多個(ge)核苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)而產生的(de)具有同(tong)等功能的(de)核苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)。通(tong)過將亞油(you)(you)酸(suan)(suan)含量(liang)(liang)(liang)相關芝麻基(ji)因(yin)(yin)(yin)sifad2在釀酒酵(jiao)母和(he)擬南芥中的(de)過量(liang)(liang)(liang)表達，發現此基(ji)因(yin)(yin)(yin)可顯著(zhu)提高釀酒酵(jiao)母細胞和(he)植物種子的(de)亞油(you)(you)酸(suan)(suan)含量(liang)(liang)(liang)，為微生物亞油(you)(you)酸(suan)(suan)含量(liang)(liang)(liang)分泌和(he)植物品質改(gai)良(liang)提供基(ji)因(yin)(yin)(yin)資源。

提供一種芝(zhi)麻(ma)sifad2蛋白，其(qi)具有如seqidno.2所示(shi)的氨基酸(suan)序(xu)列或該序(xu)列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸(suan)形成的具有同(tong)等功能的氨基酸(suan)序(xu)列。

本發明(ming)包括通(tong)過各種(zhong)方法獲得的(de)、如(ru)seqidno.2所示氨基酸序(xu)列(lie)(lie)或該序(xu)列(lie)(lie)經替換(huan)、缺失或添(tian)加(jia)一個(ge)或幾個(ge)氨基酸形成的(de)具有同(tong)等(deng)功能的(de)衍(yan)(yan)生蛋(dan)白質以及編碼(ma)這些衍(yan)(yan)生蛋(dan)白質的(de)基因(yin)。

本發明(ming)還(huan)包括(kuo)含(han)有sifad2核(he)苷酸序列的(de)(de)克隆載體或(huo)各類表達載體、含(han)有所述(shu)載體的(de)(de)宿主細(xi)胞(bao)如含(han)有所述(shu)核(he)苷酸序列或(huo)其片段的(de)(de)轉化釀酒(jiu)酵母細(xi)胞(bao)。

sifad2基(ji)因(yin)構建到(dao)表(biao)(biao)達(da)載體(ti)pyes2。通(tong)過(guo)熱激轉(zhuan)(zhuan)化方法(fa)，將pyes2攜帶(dai)的sifad2基(ji)因(yin)轉(zhuan)(zhuan)入釀酒(jiu)酵(jiao)母(mu)(mu)細胞(bao)中，獲得釀酒(jiu)酵(jiao)母(mu)(mu)轉(zhuan)(zhuan)化細胞(bao)。實(shi)驗結果表(biao)(biao)明，sifad2具有(you)提高釀酒(jiu)酵(jiao)母(mu)(mu)細胞(bao)的亞(ya)油酸(suan)含(han)量的作用(yong)。本(ben)發明將sifad2基(ji)因(yin)構建到(dao)表(biao)(biao)達(da)載體(ti)pbi121。通(tong)過(guo)農桿(gan)菌介導轉(zhuan)(zhuan)化方法(fa)，將pbi121攜帶(dai)的sifad2基(ji)因(yin)轉(zhuan)(zhuan)入擬南芥，獲得擬南芥轉(zhuan)(zhuan)化植(zhi)株(zhu)。實(shi)驗結果表(biao)(biao)明，sifad2具有(you)提高植(zhi)物種子亞(ya)油酸(suan)含(han)量的作用(yong)。本(ben)發明還(huan)提供上述sifad2基(ji)因(yin)、載體(ti)或(huo)宿主細胞(bao)在調節釀酒(jiu)酵(jiao)母(mu)(mu)細胞(bao)亞(ya)油酸(suan)含(han)量中的應用(yong)。

本發明還提(ti)供上述sifad2基因、載(zai)體或宿主細胞在(zai)調節植物種子亞油酸含(han)量中的(de)應用。

本發明所述的一種提(ti)高亞油酸含(han)量的芝(zhi)麻基因sifad2獲得方法，包括如下(xia)步驟：

(1)從國家(jia)芝麻中期庫保存的(de)7910份國內外(wai)資源中根據產量相關性(xing)狀(zhuang)的(de)表型、地理來(lai)源和遺傳多樣性(xing)檢測結果，采取逐級取樣策略，選取了705份芝麻材料進行(xing)重(zhong)測序分析；

(2)利(li)用illuminahiseq2500測(ce)(ce)(ce)序(xu)平臺，用2×76雙末端測(ce)(ce)(ce)序(xu)法對(dui)705份(fen)芝麻材料(liao)進(jin)行低覆蓋(gai)度的(de)全基(ji)因(yin)組重(zhong)測(ce)(ce)(ce)序(xu)，獲得了2.6倍覆蓋(gai)的(de)基(ji)因(yin)組序(xu)列；

(3)結合種質資源群體中的種子亞油酸含量數據、基因型數據和群體結構，采用emmax軟件包和peal程序對芝麻相關性狀進行全基因組關聯分析，在p＝10^-4.65水平檢測(ce)到(dao)1個位于(yu)6號連鎖群上3279380的位置與(yu)芝(zhi)麻亞油(you)(you)酸(suan)含(han)量(liang)顯著關聯(lian)的標記位點(dian)，解(jie)釋8.7％的表型變異；(4)通過芝(zhi)麻參考基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)(//ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比對和基(ji)(ji)因(yin)(yin)注釋分析，發現距離(li)顯著關聯(lian)標記位點(dian)24428bp的位置存在sin_1009785基(ji)(ji)因(yin)(yin)，該(gai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的擬(ni)南(nan)(nan)芥同源基(ji)(ji)因(yin)(yin)為fad2，是擬(ni)南(nan)(nan)芥亞油(you)(you)酸(suan)合成(cheng)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，因(yin)(yin)此(ci)，推(tui)測(ce)該(gai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)可(ke)能與(yu)芝(zhi)麻亞油(you)(you)酸(suan)含(han)量(liang)相(xiang)關，命名為sifad2；

(5)根據sifad2基因的cds序列，利用primer5.0設計可(ke)以擴增其完(wan)整(zheng)cds序列的引物，引物序列及名稱如下：

sifad2-f：5’-cccgggatgggagccggagg-3’

sifad2-r：5’-gagctctcagaacttgttct-3’；

(6)取中芝13發育25天(tian)的蒴果(guo)，提(ti)取種子總rna，逆(ni)轉錄(lu)生成cdna，以反轉后的cdna為模板，利用步(bu)驟(5)中的引物sifad2-f/r進行(xing)rt-pcr擴增(zeng)，將擴增(zeng)得(de)到的片段(duan)進行(xing)測(ce)序(xu)，獲得(de)提(ti)高亞(ya)油酸含量(liang)相關的芝麻(ma)sifad2基(ji)因(yin)序(xu)列，如seqidno.1所(suo)示；

(7)通過上述方法(fa)獲得了亞(ya)油酸含量(liang)相關芝(zhi)麻基(ji)因(yin)sifad2，采用一(yi)種(zhong)提高(gao)sifad2表達活性的轉(zhuan)基(ji)因(yin)釀酒酵(jiao)母(mu)細(xi)胞(bao)和擬南(nan)芥，其特征在于轉(zhuan)基(ji)因(yin)釀酒酵(jiao)母(mu)細(xi)胞(bao)和轉(zhuan)基(ji)因(yin)植物表現為(wei)sifad2含量(liang)增加，比受體對照(非(fei)轉(zhuan)基(ji)因(yin)釀酒酵(jiao)母(mu)和植株)的細(xi)胞(bao)和種(zhong)子亞(ya)油酸含量(liang)有(you)所提高(gao)。

克隆本(ben)(ben)發(fa)明(ming)中所述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)亞油酸含量相關的(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)sifad2的(de)(de)(de)(de)(de)方法是本(ben)(ben)領域中所常用的(de)(de)(de)(de)(de)方法。提取植物(wu)葉片dna是常用的(de)(de)(de)(de)(de)分子生物(wu)學技(ji)術，提取mrna的(de)(de)(de)(de)(de)方法也有多種成熟的(de)(de)(de)(de)(de)技(ji)術，試(shi)劑盒(he)(easyspinplusplantrnakit)可從(cong)商業途(tu)(tu)徑獲(huo)得(購于aidlabbiotechnologiesco.,ltd)。構建(jian)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)中所述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)載體和將載體轉(zhuan)入植株所用到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)酶切、連接(jie)、酵母(mu)(mu)轉(zhuan)化、花序侵染等方法也是本(ben)(ben)領域中常用技(ji)術。其中所涉及的(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)粒(pbi121和pyes2)，轉(zhuan)染用媒體(如(ru)釀酒酵母(mu)(mu)菌株invsc1、根癌農桿菌gv3101和所用試(shi)劑成分如(ru)蔗(zhe)糖、卡那霉素等)可從(cong)商業途(tu)(tu)徑獲(huo)得。

與現(xian)有技術相比，本發明的優點在于(yu)：

本(ben)發(fa)明(ming)是國內(nei)外首次公開報(bao)道了(le)亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)(suan)含(han)量(liang)相關(guan)芝(zhi)麻基(ji)因(yin)sifad2序列，存在(zai)于(yu)內(nei)質網上(shang)，本(ben)發(fa)明(ming)中的(de)(de)亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)(suan)含(han)量(liang)相關(guan)基(ji)因(yin)sifad2及其(qi)編(bian)碼(ma)蛋白，與擬南芥(jie)(jie)同源基(ji)因(yin)(at3g12120.2，fad2)同源度分別為73％和74％。通過其(qi)過量(liang)表(biao)達可提(ti)高(gao)(gao)釀酒酵母(mu)細(xi)胞(bao)(bao)和植物種(zhong)子亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)(suan)含(han)量(liang)。本(ben)發(fa)明(ming)實驗結果表(biao)明(ming)轉基(ji)因(yin)釀酒酵母(mu)和擬南芥(jie)(jie)sifad2的(de)(de)含(han)量(liang)與受體對照(非轉基(ji)因(yin)酵母(mu)細(xi)胞(bao)(bao)和植株)相比均有很大程(cheng)度的(de)(de)提(ti)高(gao)(gao)，酵母(mu)細(xi)胞(bao)(bao)和擬南芥(jie)(jie)種(zhong)子亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)(suan)含(han)量(liang)也因(yin)此得到提(ti)高(gao)(gao)。因(yin)此本(ben)發(fa)明(ming)提(ti)出可利用sifad2的(de)(de)過量(liang)表(biao)達來提(ti)高(gao)(gao)微(wei)生(sheng)物細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)(suan)含(han)量(liang)，改良(liang)微(wei)生(sheng)物菌株的(de)(de)出油(you)品質；以(yi)及利用sifad2的(de)(de)過量(liang)表(biao)達來提(ti)高(gao)(gao)植物種(zhong)子的(de)(de)亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)(suan)含(han)量(liang)以(yi)便用于(yu)油(you)料作物高(gao)(gao)亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)(suan)品種(zhong)的(de)(de)選育，由此來提(ti)高(gao)(gao)食用油(you)的(de)(de)品質，改善人們膳食營養。

附圖說明

圖(tu)1為(wei)含(han)sifad2基因的釀酒酵母(mu)表達載體pyes2-fad2的構(gou)建；

圖2轉sifad2基因酵母菌株(zhu)(zhu)(zhu)的pcr鑒定結果示意圖(m：marker；1-7：陰性(xing)菌株(zhu)(zhu)(zhu)；8-10：陽性(xing)菌株(zhu)(zhu)(zhu)；空(kong)：轉空(kong)載體菌株(zhu)(zhu)(zhu))；

圖3陽性酵(jiao)母菌株定量表達驗證(zheng)結果圖；

圖(tu)4氣相(xiang)色(se)譜法測定轉sifad2基因酵母各脂(zhi)肪酸組分含量(liang)(liang)以及總脂(zhi)肪酸含量(liang)(liang)；

圖(tu)5為含sifad2基(ji)因的植物表達載體pbi121-fad2的構建；

圖6轉(zhuan)sifad2基因擬南芥t1代(dai)陽性植株(zhu)的篩選結果(guo)示意圖；

圖7轉sifad2基(ji)因(yin)擬南(nan)芥t1代(dai)的pcr鑒定(ding)結果示意圖(m：marker；1-14：轉基(ji)因(yin)t1代(dai)植株；陽(yang)：陽(yang)性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)；陰：陰性(xing)對(dui)(dui)照(zhao))；

圖8轉sifad2基(ji)因擬南芥(jie)t2代(dai)陽性植株(zhu)的篩選(xuan)結(jie)果示意圖；

圖(tu)9轉sifad2基因擬南芥t2代的pcr鑒定結果示意圖(tu)(m：marker；1-25：轉基因t2代植株)；

圖10轉(zhuan)sifad2基因擬南芥(jie)t2代(dai)種(zhong)子定量表達驗證結(jie)果圖；

圖11氣相色(se)譜法測(ce)定轉sifad2基因擬南芥(jie)種(zhong)子各脂肪酸(suan)組分(fen)含(han)量以及總脂肪酸(suan)含(han)量。

具體實施方式

通常按(an)照常規條件如sambrook等人，分(fen)子(zi)克(ke)隆：實驗(yan)室手(shou)冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)，或draper等人(blackwell科學(xue)出(chu)版社，1988)所述(shu)的(de)條件，或按(an)照所用試劑制造廠(chang)商所建議的(de)條件。

實施(shi)例1：亞油酸相關芝麻(ma)基因sifad2的獲得

本發明所述的一種提(ti)高亞油酸含量相關芝麻基因sifad2獲得方法，包括如下步驟：

(1)從國家芝麻(ma)(ma)中期庫保存的7910份(fen)國內(nei)外資源(yuan)中根(gen)據產量相(xiang)關性狀的表型、地(di)理來源(yuan)和遺傳多樣性檢測結果，采取逐級取樣策(ce)略(lve)，選取了705份(fen)芝麻(ma)(ma)材料進行重測序(xu)分析；

(2)利用(yong)illuminahiseq2500測序平臺，用(yong)2×76雙末(mo)端測序法對(dui)705份芝麻材料進(jin)行低(di)覆(fu)(fu)蓋(gai)度的全基因組重測序，獲得了(le)2.6倍覆(fu)(fu)蓋(gai)的基因組序列(lie)；

(3)結合種質資源群體中的種子亞油酸含量數據、基因型數據和群體結構，采用emmax軟件包和peal程序對芝麻相關性狀進行全基因組關聯分析，在p＝10^-4.65水平檢測到1個位(wei)于6號連鎖群上(shang)3279380的位(wei)置與芝麻亞油酸(suan)含(han)量顯著關聯的標記位(wei)點，解釋(shi)8.7％的表型變異(yi)；

(4)通過芝麻(ma)參(can)考(kao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(//ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比對和(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)注(zhu)釋分(fen)析(xi)，發現距(ju)離顯著(zhu)關(guan)聯(lian)標記(ji)位點24428bp的位置(zhi)存在(zai)sin_1009785基(ji)(ji)因(yin)(yin)，該基(ji)(ji)因(yin)(yin)的擬南芥(jie)同源基(ji)(ji)因(yin)(yin)為(wei)fad2，是(shi)擬南芥(jie)亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)合成(cheng)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，因(yin)(yin)此，推測該基(ji)(ji)因(yin)(yin)可能與芝麻(ma)亞(ya)油(you)酸(suan)(suan)含量(liang)相關(guan)，命名為(wei)sifad2；

(5)根據sifad2基(ji)因的(de)(de)cds序列，利用primer5.0設計(ji)可以(yi)擴(kuo)增其完整cds序列的(de)(de)引物，引物序列及名稱如下：

sifad2-f：5’-cccgggatgggagccggagg-3’

sifad2-r：5’-gagctctcagaacttgttct-3’；

(6)取中(zhong)芝(zhi)13發育25天的(de)(de)蒴果，提取種子總rna，逆轉錄生成cdna，以反(fan)轉后的(de)(de)cdna為(wei)模(mo)板(ban)，利(li)用步驟(5)中(zhong)的(de)(de)引物sifad2-f/r進行rt-pcr擴增，將擴增得到的(de)(de)片(pian)段進行測序，獲得亞(ya)油(you)酸(suan)含量的(de)(de)芝(zhi)麻基因sifad2，其序列為(wei)seqidno.1所示。

實施例(li)2：一種提(ti)高亞(ya)油酸含(han)量的(de)芝(zhi)麻(ma)基(ji)因sifad2在提(ti)高釀酒酵母(mu)細胞亞(ya)油酸含(han)量中的(de)應用

1)將(jiang)實施例(li)1克隆得到的亞油酸含量相關的基因sifad2利用同源重組的方法與pyes2(vazyme公司)質粒連(lian)接構建植物(wu)表達載體(ti)，命名為pyes2-fad2(圖1)；

2)將步驟1)中(zhong)制備的載體pyes2-fad2轉入釀酒酵母invsc1中(zhong)(invitrogen公司)；

3)轉基因酵母陽性檢測(ce)

挑取步(bu)驟2)中獲得的酵(jiao)母單克(ke)隆(long)5-10個到sd-u基(ji)礎(chu)培養基(ji)中，30℃振蕩(dang)過(guo)夜培養，提取酵(jiao)母質粒，利用sifad2-1f/1r引物，對挑取的轉(zhuan)基(ji)因酵(jiao)母單克(ke)隆(long)和轉(zhuan)空載體酵(jiao)母進行(xing)pcr檢(jian)測(圖(tu)2)，獲得轉(zhuan)基(ji)因陽性(xing)酵(jiao)母(圖(tu)2中的1-7號菌株(zhu))。

酵母(mu)質(zhi)粒提取方法參照北京天根生物技術(shu)公司酵母(mu)質(zhi)粒小(xiao)提試劑盒(he)。

sifad2-1f：5’-gccgttcgttctccta-3’

sifad2-1r：5’-gtgcgtatctgtgatgttat-3’

4)陽(yang)性(xing)酵母(mu)菌(jun)株(zhu)定量(liang)表達驗(yan)證

取(qu)陽性(xing)酵母菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)以及轉(zhuan)(zhuan)pyes2空載(zai)體(ti)釀(niang)酒酵母菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)為(wei)(wei)(wei)對(dui)(dui)照的(de)(de)(de)(de)同(tong)一批(pi)繁殖(zhi)培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)，通過誘導培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)誘導培(pei)(pei)養(yang)，利用easyspin酵母rna快(kuai)速提取(qu)試(shi)劑盒(艾德萊生(sheng)物)提取(qu)各菌(jun)(jun)液rna，并(bing)反轉(zhuan)(zhuan)錄cdna，以各自cdna為(wei)(wei)(wei)模(mo)板，以pyes2載(zai)體(ti)上的(de)(de)(de)(de)ura3基(ji)(ji)因(yin)為(wei)(wei)(wei)內參(pf：5’-gctggccgcatcttctcaaa-3’；pr：5’-tatcggctttattgctcaaa-3’)，進行(xing)qrt-pcr表(biao)達(da)(da)驗證。結(jie)果(guo)表(biao)明(ming)以轉(zhuan)(zhuan)pyes2空載(zai)體(ti)釀(niang)酒酵母菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)為(wei)(wei)(wei)對(dui)(dui)照，芝麻(ma)sifad2基(ji)(ji)因(yin)在3個酵母轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)具有(you)較大的(de)(de)(de)(de)差異表(biao)達(da)(da)，而在轉(zhuan)(zhuan)pyes2空載(zai)體(ti)酵母對(dui)(dui)照菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)，沒有(you)檢測到(dao)芝麻(ma)sifad2基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)(圖3)。表(biao)明(ming)芝麻(ma)的(de)(de)(de)(de)sifad2基(ji)(ji)因(yin)均轉(zhuan)(zhuan)化并(bing)插入到(dao)了相應酵母基(ji)(ji)因(yin)組中(zhong)(zhong)并(bing)得到(dao)了表(biao)達(da)(da)。

5)轉基因酵母亞油酸含量(liang)分析

分(fen)(fen)別挑(tiao)取轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)pyes2-fad2基(ji)因單克隆(long)和轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)pyes2空(kong)載體釀(niang)酒(jiu)酵(jiao)母(mu)(mu)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)進行誘導(dao)培養基(ji)誘導(dao)培養，當od＝2.0時低溫離心(xin)收集菌(jun)(jun)(jun)體，收集的菌(jun)(jun)(jun)體于(yu)-80℃冷凍30min，并于(yu)冷凍干燥機(ji)中(zhong)(zhong)干燥，然后(hou)利用氣相色譜(pu)法(fa)分(fen)(fen)別測(ce)定轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因酵(jiao)母(mu)(mu)和轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)pyes2空(kong)載體釀(niang)酒(jiu)酵(jiao)母(mu)(mu)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)的亞(ya)油(you)酸含(han)量(liang)(liang)。結果表明測(ce)試的轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)sifad2基(ji)因的酵(jiao)母(mu)(mu)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)，較轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)pyes2空(kong)載酵(jiao)母(mu)(mu)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)亞(ya)油(you)酸(c18:2)含(han)量(liang)(liang)都有顯著的升高(圖(tu)4)。通過(guo)芝(zhi)麻sifad2基(ji)因的過(guo)量(liang)(liang)表達，酵(jiao)母(mu)(mu)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)亞(ya)油(you)酸含(han)量(liang)(liang)明顯升高。

實施例3：一種提高亞油酸含量的(de)芝麻基因sifad2在植物(wu)品質改良育種中的(de)應用

1)將實(shi)施例1克(ke)隆得(de)到的亞油(you)酸含量相關的芝麻基因sifad2利用同(tong)源(yuan)重組的方法(fa)與pbi121(vazyme公(gong)司)質粒連(lian)接構建植(zhi)物(wu)表達載體，命名為pbi121-sad(圖5)；

2)將步(bu)驟1)中(zhong)制(zhi)備的載體pbi121-fad2轉入(ru)根癌農桿菌gv3101(invitrogen公司(si))，再導(dao)入(ru)擬南芥植株中(zhong)；

3)篩選(xuan)t1代陽性植株：

種(zhong)植(zhi)擬(ni)南芥t0代(dai)所收(shou)獲的(de)(de)種(zhong)子(zi)，將t0代(dai)種(zhong)子(zi)消毒，接種(zhong)含卡那(nei)霉素(su)的(de)(de)ms篩選培(pei)養(yang)基上(shang)篩選陽(yang)性(xing)植(zhi)株(圖6，右圖是左圖局部(bu)放大圖)。篩選出的(de)(de)陽(yang)性(xing)植(zhi)株的(de)(de)葉片dna提取后，利(li)用實施(shi)例1步驟(5)中的(de)(de)pcr鑒(jian)定(ding)引物sifad2-f/r，進行轉基因植(zhi)株的(de)(de)pcr分子(zi)鑒(jian)定(ding)(圖7)，最終確認基因已經轉入的(de)(de)t1代(dai)陽(yang)性(xing)植(zhi)株。

4)轉(zhuan)基因植(zhi)株t2代陽性(xing)檢測

將t1代陽(yang)性植(zhi)株(zhu)進行單株(zhu)收種獲得(de)t1代種子(zi)，繼續進行卡那霉素篩選獲得(de)t2代陽(yang)性植(zhi)株(zhu)(圖(tu)(tu)8)，獲得(de)的(de)陽(yang)性植(zhi)株(zhu)移栽生長(chang)，提取(qu)葉片基(ji)因組(zu)dna利用實施例1步驟(5)中的(de)目(mu)的(de)基(ji)因引物sifad2-f/r進行pcr分子(zi)鑒定(ding)(圖(tu)(tu)9)，確定(ding)t2代陽(yang)性植(zhi)株(zhu)。

5)t2代陽性(xing)植株定量表達驗證

取(qu)t2代陽性植(zhi)株(zhu)以(yi)(yi)及(ji)未(wei)轉基(ji)因(yin)(yin)擬南芥(jie)野生型對(dui)照的(de)同(tong)一(yi)生長(chang)時期的(de)幼嫩角果(guo)，各(ge)自cdna為(wei)模板，以(yi)(yi)擬南芥(jie)β-actin為(wei)內(nei)參(can)(af：5’-cccgctatgtatgtcgcca-3’；ar：5’-aaccctcgtagattggcacag-3’)，進(jin)行qrt-pcr表達驗(yan)證(zheng)。結(jie)果(guo)表明以(yi)(yi)未(wei)轉基(ji)因(yin)(yin)的(de)野生型擬南芥(jie)為(wei)對(dui)照，芝(zhi)麻sifad2基(ji)因(yin)(yin)在3個(ge)擬南芥(jie)轉基(ji)因(yin)(yin)株(zhu)系的(de)角果(guo)中(zhong)具有較大的(de)差異表達，而在未(wei)轉基(ji)因(yin)(yin)對(dui)照擬南芥(jie)的(de)角果(guo)中(zhong)，沒有檢測到芝(zhi)麻sifad2基(ji)因(yin)(yin)的(de)表達(圖10)。表明芝(zhi)麻的(de)sifad2基(ji)因(yin)(yin)均轉化并插入到了相應擬南芥(jie)基(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)并得到了表達。

6)t2代陽性(xing)擬南芥種(zhong)子亞油酸含量的測(ce)定

待t2代轉(zhuan)基因(yin)種子成熟后，收集種子，利用氣相色(se)譜法分別測定擬(ni)南芥(jie)轉(zhuan)基因(yin)種子和未轉(zhuan)基因(yin)野生(sheng)(sheng)型擬(ni)南芥(jie)種子中亞油(you)酸含(han)量。結(jie)果表(biao)(biao)明(ming)與(yu)野生(sheng)(sheng)型擬(ni)南芥(jie)對照相比(bi)，本研究獲得(de)的(de)轉(zhuan)sifad2基因(yin)擬(ni)南芥(jie)株系(xi)亞油(you)酸(c18:2)含(han)量明(ming)顯升高(圖11)，表(biao)(biao)明(ming)芝(zhi)麻sifad2基因(yin)的(de)過量表(biao)(biao)達可以促進油(you)酸向(xiang)亞油(you)酸轉(zhuan)化(hua)，從而(er)提高植物(wu)種子的(de)亞油(you)酸含(han)量。

sequencelisting

<110>中國農業科學院(yuan)油料作物研究所

<120>一(yi)種亞(ya)油酸含(han)量相(xiang)關的芝麻基因及(ji)其應(ying)用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1152

<212>dna

<213>芝麻(sesamumindicuml.)

<400>1

atgggagccggaggacgcatgtctgatccaacaacgaaagacgaacaaaagaagaacccc60

ctccaacgggtgccttacgcaaagcctccattcacactcggtgacatcaagaaggccatt120

ccaccacactgcttcgagagatccgtcagccgttcgttctcctatgtcgtttacgatctc180

gtcattgttttccttctctactacattgcgacttcttacttccatctgctgccatcccca240

tactgctacctagcttggcccatttactgggctgtacaaggctgcgtttgcaccggaatc300

tgggtcattgcccatgaatgtggccaccatgcattcagcgattaccagtggcttgacgac360

acagttggcctcatcctgcactctgccctgctcgtgccctatttctcatggaaatacagc420

caccgccgccaccactccaacactggatcccttgagcgtgacgaagtcttcgtcccaaag480

ccaaaatccagagtctcgtggtactccaaatacttgaacaatccacttggcagagtcatc540

acacttgtggttactcttactctcggttggcctctatacttgctgtttaatgtctctggc600

aggccttacaaccgttttgcatgccactttgacccatatggtccaatatataatgaccgt660

gagagacttcaaatcttcatctccgatgctggtataattgctgctgtatgtgtgctttat720

cgtgttgctttggtcaaagggttggcttggctggtatgtgtttatggggtaccgttactc780

attgtcaacggtttccttgttttgatcacattccttcagcacactcacccttcgttgccg840

cactatgattcttccgagtgggactggctaaggggagctcttgcaactgtcgacagagat900

tatggggtgctaaataaggtgttccataacatcacagatacgcacgtgactcaccacctt960

ttctcaacgatgccacattaccatgcaatggaggcaactaaggcaatcaagcccatactg1020

ggccagtattatcagtttgatggaaccccgttttacaaggcgatgtggagggaggcaaag1080

gaatgtctgtatgtcgagccagacgagagtactccagacaagggtgtattctggtacaag1140

aacaagttctga1152

<210>1

<211>383

<212>prt

<213>芝麻(sesamumindicuml.)

<400>2

metglyalaglyglyargmetseraspprothrthrlysaspglu

51015

glnlyslysasnproleuglnargvalprotyralalyspropro

202530

phethrleuglyaspilelyslysalaileproprohiscysphe

354045

gluargservalserargserphesertyrvalvaltyraspleu

505560

valilevalpheleuleutyrtyrilealathrsertyrphehis

657075

leuleuproserprotyrcystyrleualatrpproiletyrtrp

808590

alavalglnglycysvalcysthrglyiletrpvalilealahis

95100105

glucysglyhishisalapheserasptyrglntrpleuaspasp

110115120

thrvalglyleuileleuhisseralaleuleuvalprotyrphe

125130135

sertrplystyrserhisargarghishisserasnthrglyser

140145150

leugluargaspgluvalphevalprolysprolysserargval

155160165

sertrptyrserlystyrleuasnasnproleuglyargvalile

170175180

thrleuvalvalthrleuthrleuglytrpproleutyrleuleu

185190195

pheasnvalserglyargprotyrasnargphealacyshisphe

200205210

aspprotyrglyproiletyrasnasparggluargleuglnile

215220225

pheileseraspalaglyileilealaalavalcysvalleutyr

230235240

argvalalaleuvallysglyleualatrpleuvalcysvaltyr

245250255

glyvalproleuleuilevalasnglypheleuvalleuilethr

260265270

pheleuglnhisthrhisproserleuprohistyraspserser

275280285

glutrpasptrpleuargglyalaleualathrvalaspargasp

290295300

tyrglyvalleuasnlysvalphehisasnilethraspthrhis

305310315

valthrhishisleupheserthrmetprohistyrhisalamet

320325330

glualathrlysalailelysproileleuglyglntyrtyrgln

335340345

pheaspglythrprophetyrlysalamettrpargglualalys

350355360

glucysleutyrvalgluproaspgluserthrproasplysgly

365370375

valphetrptyrlysasnlysphe

380