專利名稱：新型變態反應原突變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及天然變態反應原的突變體，新型重組變態反應原。本發明也涉及包含該新型重組變態反應原突變體的混合物的組合物。更進一步，本發明涉及制備這種重組變態反應原突變體的方法以及包含該重組變態反應原突變體的藥物組合物，包括疫苗。在進一步的實施方案中，本發明涉及在被試者中產生免疫反應的方法、涉及對被試者接種疫苗或治療以及制備本發明的組合物的方法。
背景技術：
遺傳誘發的個體對源于各種環境來源的抗原以及對該個體所暴露的變態反應原變得過敏(變態反應)。當先前過敏的個體再次遭受同樣或同源的變態反應原時發生變態反應。響應于如蜜蜂或大黃蜂刺痛或昆蟲叮咬，變態反應的范圍為從枯草熱、rhinoconductivitis、鼻炎和氣喘到全身過敏反應及死亡。該反應是立即發生的，且可由各種特異反應性的變態反應原導致，如源于草、樹、野草、昆蟲、食物、藥品、化學品和香料等。
然而，當個體初次遭受變態反應原時不發生該反應。初始的適應性反應耗費時間且一般不導致任何癥狀。但當已經生產了能夠與變態反應原反應的抗體和T細胞時，任何隨后的暴露都可引起癥狀。因而，變態反應證明免疫反應本身能夠導致顯著的病理學狀態，其可威脅生命。
涉及在特異反應性變態反應中的抗體主要屬于IgE類的免疫球蛋白。IgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的特異性受體結合。在特異性變態反應原與結合肥大細胞的IgE形成復合物之后，在細胞表面交聯的受體導致通過受體的信號傳導和目的細胞的生理學反應。脫粒導致釋放缺席的組胺、肝素、嗜曙紅白細胞的一種趨化因子、白三烯C4、D4和E4，它們導致了支氣管平滑肌細胞收縮延長。所導致的作用可能為全身性或局部性。
抗體介導的過敏性反應可分為4類，即類型I、類型II、類型III和類型IV。類型I變態反應是在抗原暴露之后數秒或數分鐘之內發生的典型的即時過敏反應。這些癥狀由變態反應原特異的IgE所介導。
通常觀察到的變態反應是作為對蛋白質變態反應原的反應，這些蛋白質變態反應原存在于如花粉、房屋塵螨、動物毛發和頭皮屑、毒液和食物產品中。
為了減少或消除變態反應，通常使用謹慎控制并重復給藥的變態反應疫苗。變態反應疫苗接種傳統上是以漸增的劑量在一個相當長的時期內通過腸胃外、鼻內或舌下給藥方式進行，且導致患者脫敏。精確的免疫學機制尚未知道，但認為在變態反應原特異的T細胞表型中誘導的差異特別重要。
變態反應疫苗接種疫苗接種的概念基于免疫系統的兩個基本特征，即特異性和記憶。疫苗接種將使受者的免疫系統預先準備好，且在重復暴露在相似的蛋白質中時該免疫系統將能夠對如微生物感染產生更加劇烈的反應。疫苗是疫苗接種中用于在受者中產生這種保護性免疫反應的蛋白質的混合物。該保護將僅包含存在于疫苗和同源抗原中的成分。
與其他類型的疫苗接種相比較，變態反應疫苗接種由于在變態反應患者中存在正在進行的免疫反應而是復雜。該免疫反應特征在于當暴露于變態反應原時存在介導變態反應癥狀釋放的變態反應原特異的IgE。因而，利用來自于天然來源的變態反應原的變態反應疫苗接種具有固有的副作用的危險，其最大的結果甚至威脅患者生命。
避免這個問題的方法可分為三類。實際上經常組合使用超過一類的方法。第一類方法包括在延長的時間內給藥幾種小劑量以達到相當的累積劑量。第二類方法包括通過將變態反應原摻入到凝膠物質如氫氧化鋁中而對變態反應原進行物理修飾。氫氧化鋁制備物具有減小活性變態反應原成分的組織濃度的緩慢變態反應原釋放的佐劑作用及貯存作用。第三類方法包括目的在于減少變態反應性即IgE結合的變態反應原的化學修飾。
成功的變態反應疫苗接種的詳細機制仍有爭議。然而，一致認為T細胞在免疫反應的全面調節中發揮了關鍵的作用。根據目前的一致意見，T細胞表型的兩個極端即Th1和Th2決定了個體的變態反應狀態。當用變態反應原刺激時，Th1細胞分泌以干擾素-γ為主的導致保護性免疫的白細胞介素，則個體是健康的。另一方面，Th2細胞主要分泌導致IgE合成和嗜曙紅性的白細胞介素4和5，則個體發生變態反應。體外研究顯示通過用衍生自含有相關的T細胞抗原決定部位的肽的變態反應原免疫激發可能改變變態反應原特異的T細胞的反應。因此目前對新變態反應疫苗的研究主要是基于影響T細胞，其目的在于使T細胞沉默(誘導無反應性)或將Th2表型的反應轉變為Th1表型的。
結合抗體的抗原決定部位(B-細胞抗原決定部位)對Fab-抗原復合物的X-射線晶體學分析已經增加了對抗體-結合的抗原決定部位的理解。根據該類分析抗體-結合的抗原決定部位可定義為包含來自15～25個氨基酸殘基的原子的抗原表面部分，它們處在與能直接相互作用的抗體原子的一定距離之內。抗原-抗體相互作用的親和力不能單從由范德瓦耳斯相互作用、氫鍵或離子鍵貢獻的焓來預測。與水分子幾乎完全從界面排除相關的熵代表了大小相似的能量貢獻。這意味著相互作用分子外形之間的正確配合是抗原-抗體高親和力相互作用的主要因素。
在WO 97/30150(參考文獻1)中，要求保護一組蛋白質分子，該蛋白質分子與親代蛋白質相比在氨基酸序列中具有特異性突變的分布。從說明書中可知，看來該發明涉及生產與親代蛋白質相比被修飾的類似物，但它們以與親代蛋白質(天然存在的變態反應原)相似的方式被吸收、消化及呈遞給T細胞。因此，獲得了修飾的T細胞反應。修飾的蛋白質文庫用稱為PM(簡約原則誘變)的技術來制備。
在WO 92/02621(參考文獻2)中，描述了重組DNA分子，該分子包含編碼具有至少一個Fagalrs目樹木變態反應原的抗原決定部位多肽的DNA，該變態反應原選自Aln g 1、Cor a 1和Bet v 1。在此處描述的重組分子都具有與天然發生的變態反應原的序列相應的氨基酸序列或部分氨基酸序列。
WO 90/11293(參考文獻3)在理論上涉及分離的豚草(ragweed)花粉的變態反應肽和修飾的豚草花粉肽。在此處公開的肽具有與天然存在的變態反應原或其天然存在的同種型相應的氨基酸序列。
變態反應原的化學修飾已經采取了幾種對變態反應原化學修飾的方法。七十年代早期的方法包括將變態反應原與聚合物化學偶聯和用甲醛等化學交聯變態反應原，從而形成所謂的“類變態反應原(allergoid)”。這些方法背后的基本原理是通過附加化學配體而造成的IgE結合的抗原決定部位的隨機破壞，因而在通過增加的復合物分子量維持免疫原性同時減少了IgE-結合。“類變態反應原”生產的固有缺點與在控制化學交聯方法中的困難及在對結果所得的高分子量復合物的分析和標準化中的困難有關。“類變態反應原”目前做臨床應用，且由于IgE結合的抗原決定部位的隨機破壞，與常規疫苗相比可以應用高劑量，但其安全和效力參數并沒有比常規疫苗的應用有改進。
對變態反應原的化學修飾的更新方法目標在于對變態反應原三級結構的整體破壞從而消除IgE的結合，這里假定基本的治療目標是變態反應原特異的T細胞。這樣的疫苗包含由變態反應原序列，其衍生自代表最小的T細胞抗原決定部位的合成肽、代表連接的T細胞抗原決定部位的較長的肽、較長的變態反應原序列，其衍生自代表免疫決定T細胞抗原表位區域的合成肽或被重組技術切割成兩個半分子的變態反應原分子。另一個基于該基本原理的方法建議使用“低IgE結合”重組同種型。最近幾年中已經明確天然的變態反應原是異質性的，其含有氨基酸約達25％被替換的異變態反應原(isoallergen)和變體。已發現一些重組異變態反應原可能由于不可逆的變性及因此導致的三級結構的整體破壞而具有較低的IgE結合效力。
體外誘變和變態反應疫苗接種已經用幾種變態反應原進行了通過體外定點突變來減少變態反應性的嘗試，包括Der f 2(Takai等人，參考文獻4)，Der p 2(Smith等人，參考文獻5)，一個39 kDa的粉塵螨(Dermatophagoides farinae)變態反應原(Aki等人，參考文獻6)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(Frster等人，參考文獻7)，Ara h 1(Burks等人，參考文獻8)，Ara h 2(Stanley等人，參考文獻9)，Bet v 1(Ferreira等人，參考文獻10和11)，樺木抑制蛋白(Wiedemann等人，參考文獻12)和Ory s 1(Alvarez等人，參考文獻13)。
這些方法背后的基本原理再次針對變態反應原特異的T細胞而同時減少IgE介導的副作用危險，這是通過破壞重組變態反應原突變體的三級結構減少或消除IgE結合。這些方法背后的基本原理不包括主要IgE結合抗原決定部位的概念且不包括起始也涉及B-細胞和抗體產生的新的保護性免疫反應的概念。
Ferreira等人(參考文獻11)的文章描述了目的在于減少IgE結合的定點突變的應用。盡管在文中提到了Bet v 1的三維結構，但作者未用該結構對暴露在溶劑中的氨基酸殘基做突變預測，其中一半的殘基具有低程度的溶劑暴露。相反，他們應用了一種發展來用于在與對此處描述的基于確定保守表面區域的結構概念不同的蛋白質功能殘基的預測方法。盡管作者確實討論了α-碳主鏈的三級結構的保守性，但是該概念不是治療策略的部分，而僅僅是包含在體外IgE結合的估計中。另外，出示的證據不足，因為CD-譜的歸一化阻礙估計樣品的部分變性，這是一個普遍的問題。所述治療策略目標在于對變態反應原特異性T細胞誘導耐受性且沒有提到起始新免疫反應。
Wiedemann等人(參考文獻12)的文章描述了定點突變的應用和用于單克隆抗體抗原決定部位表征的肽合成。作者擁有抗原三級結構的知識，而且他們用這些知識選擇了一個表面暴露的氨基酸進行突變。可以說所用的算法是與本發明者所描述的算法相反的，因其選擇了與同源序列有差異的氨基酸。該研究證明表面暴露的氨基酸的替換具有修飾單克隆抗體的結合特征的能力，考慮到一般的知識這并不令人驚訝。所述實驗不是設計來估計對多克隆抗體如變態反應患者的血清IgE結合的調制。包含的一個實驗的確應用了IgE，且盡管該實驗不適于數量評估，但IgE的結合看來沒有受發生的突變的影響。
Smith等人(參考文獻5)的文章描述了用于單克隆抗體抗原決定部位的作圖和減少IgE結合的定點突變的應用。作者沒有三級結構的知識，且他沒有嘗試估價α-碳主鏈的三級結構的保守性。所用的算法不能確保選擇用來進行突變的氨基酸是事實上暴露于分子表面。只有一個所述突變體導致IgE結合真正減少。該突變體在對所有檢驗的抗體的結合中都有缺陷，這顯示其三級結構被破壞。作者沒有定義治療策略，且沒有提到起始新免疫反應。
Colombo等人(參考文獻14)的文章描述了通過應用定點突變和肽合成對IgE結合抗原決定部位的研究。作者應用基于同源蛋白質的晶體結構的三維電腦模型結構來闡明存在于分子表面的抗原決定部位。抗原決定部位在顯示一級結構同源的不同變態反應原上進一步的存在是用代表抗原決定部位的合成肽來陳述的。治療策略是基于應用該代表單價IgE結合抗原決定部位的合成肽進行治療。沒有提到同源變態反應原之間保守的表面區域以及起始一種新的保護性免疫反應的治療概念。
Spangfort等人(參考文獻15)的文章描述了主要樺木變態反應原三維結構和保守表面暴露的區塊。文章沒有提到主要IgE結合抗原決定部位，也沒有提到定點突變，也沒有陳述治療應用。
上述的研究中沒有一個關于由替換表面暴露的氨基酸同時保持α-碳主鏈的三級結構而減少IgE結合。上述方法背后的基本原理沒包括主要IgE結合抗原決定部位的概念，且它不包括起始一種新保護性免疫反應的治療概念。
WO 99/47680公開了在維持變態反應原的α-碳主鏈三級結構同時，向確定的關鍵性位置引入人工氨基酸替換。具體地，WO99/47680公開了一種重組變態反應原，它是衍生自天然存在的變態反應原的非天然存在的突變體，其中至少一種表面暴露的B細胞抗原決定部位的保守氨基酸殘基是由另一種殘基替換的，在該天然存在的變態反應原所源自的分類目中該殘基不存在于任何已知同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置上，該變態反應原突變體具有基本與該天然存在的變態反應原相同的α-碳主鏈三級結構，且對突變的變態反應原的特異的IgE結合與對該天然存在的變態反應原的結合相比是減少的。
在WO 99/47680中公開的重組變態反應原通過以下途徑可得到a)在天然存在的變態反應原中確定氨基酸殘基，該變態反應原是保守的，其在該天然存在的變態反應原所源自的分類目中的所有已知的同源蛋白質中以超過70％的一致性保守，b)確定至少一片區域的保守氨基酸殘基，它們在變態反應原分子的三維表面上至少4002的面積上互相連接，該小片區域由具有至少20％的溶劑可接近性所定義，其中至少一個區域包含至少一個B細胞抗原決定部位，和c)在至少一個區域用另一個氨基酸殘基替換至少一個氨基酸殘基，該新殘基在該特別位置不保守，但基本保持了該變態反應原分子的α-碳主鏈三級結構。
附圖簡述

圖1表示用于Bet v 1突變體1號的突變體特異性寡核苷酸引物。突變的核苷酸以下劃線表示。
圖2表示兩個合成并用于所有突變體的一般可適用的引物(以“全有義的”和“全無義的”標明)。
圖3表示天然存在的變態反應原Bet v 1和許多Bet v 1突變體的DNA和氨基酸序列。
圖4表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Glu45Ser突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者群體的血清IgE結合。
圖5表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者群體的血清IgE結合。
圖6表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Pr0108Gly突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者群體的血清IgE結合。
圖7表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1突變體Glu60Ser抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者群體的血清IgE結合。
圖8表示重組和三重區塊突變體的CD譜，以接近相等的濃度記錄。
圖9表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1三重區塊突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者群體的血清IgE結合。
圖10表示單獨比對的抗原5殘基和黃胡蜂屬(Vespula)抗原5序列(左面部分)的溶劑可接近性。在圖10的右圖版顯示了在黃胡蜂抗原5s中具有保守區域的抗原5的分子表面。
圖11表示相應于由有義鏈衍生的Ves v 5氨基端的引物序列。下游引物的序列從無義鏈衍生。
圖12表示兩個合成并用于所有突變體的一般可適用的引物(以“全有義的”和“全無義的”表示)。
圖13表示天然存在的變態反應原Ves v 5以及2個Ves v 5突變體的DNA和氨基酸序列。
圖14表示通過非生物素化的Ves v 5和Ves v 5突變體Lys72Ala抑制生物素化的重組Ves v 5與來自變態反應患者群體的血清IgE結合。
圖15表示變態反應原和肥大細胞之間通過IgE交聯的反應的理論模型。
圖16表示天然存在的變態反應原Der p 2的DNA和氨基酸序列。
圖17示意性地表示用于產生突變的引物。(I)表示有義和反義引物。(II)表示在顯示的位置含有突變的最終重組蛋白質。
圖18表示對構建Bet v 1突變體的說明和所用引物的列表。該突變體含有5到9個氨基酸。
圖19表示在Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)表面引入的點突變。在突變體Bet v 1(2628)中，在Bet v 1的一半中引入了5個初級突變而另一半沒有改變。在突變體Bet v 1(2637)中，在另一半中引入了5個初級突變和3個二級突變，而第一半沒有改變。
圖20表示以幾乎相等的濃度記錄的重組Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2637)突變體的圓二色(CD)譜。
圖21表示通過非生物素化的Bet v 1.2801和通過Bet v 1(2628)、Bet v 1(2637)及Bet v 1(2628)與Bet v 1(2637)的1∶1混合物抑制生物素化的重組Bet v 1.2801(野生型)與來自變態反應患者群體的血清IgE結合。
圖22表示人Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)嗜堿性粒細胞中的組胺釋放。
圖23表示人Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)嗜堿性粒細胞中的組胺釋放。
圖24表示Bet v 1(2744)表面的點突變。
圖25表示Bet v 1(2753)表面的點突變。
圖26表示Bet v 1(2744)和Bet v 1(2753)表面的點突變。
圖27表示以幾乎相等的濃度記錄的Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2744)的圓二色(CD)譜。
圖28表示人Bet v 1.2801(野生型)和突變體Bet v 1(2744)嗜堿性粒細胞中的組胺釋放。
圖29表示人Bet v 1.2801(野生型)和突變體Bet v 1(2744)嗜堿性粒細胞中的組胺釋放。
圖30表示Bet v 1(2733)表面的點突變。
圖31表示用于對Der p 2進行定點突變的引物。
圖32表示Der p 2與其他類群2屋塵螨變態反應原的序列比對。
圖33從4個不同角度表示Der p 2的表面外形。
圖34從4個不同角度表示Der p 2突變體的表面外形。
圖35A和B表示Der p 1與其他類群1屋塵螨變態反應原的序列比對。
圖36從4個不同角度表示Der p 1的表面外形。
圖37從4個不同角度表示Der p 1突變體的表面外形。
圖38A-D表示Phl p 5與其他類群5草變態反應原的序列比對。
圖39A和B分別從4個不同角度表示Phl p 5模型A和模型B的表面外形。
圖40A和B分別從4個不同角度表示Phl p 5突變體模型A和B的表面外形。
圖41表示表達為各種Bet v 1制備物的刺激指數(StimulationIndex，SI)的外周血淋巴細胞的增殖。
圖42-44表示用各種Bet v制備物刺激的T細胞的細胞因子的概況。圖42表示具有Th0狀況的患者，圖43表示Th1狀況，圖44表示Th2狀況。
發明目的本發明背后的基本原理本發明基于獨特的基本原理。根據此基本原理，成功的變態反應原免疫接種機制不是改造進行中的Th2-類型免疫反應，而是平行地起始一種新的涉及B-細胞識別三級抗原決定部位和抗體形成的免疫反應。現已相信該新的免疫反應部分屬于Th1-類型免疫反應。該模型由于觀察到特異IgE水平不受成功的免疫接種治療的影響而得到支持，且成功的治療經常是伴隨變態反應原特異的IgG4的真正增加。另外，在變態反應原攻擊前后的鼻活組織檢查中沒有顯示具Th2-樣表型的T細胞的減少，而是觀察到Th1-樣T細胞的增加。當將疫苗(或藥物組合物)通過除呼吸道之外的其他途徑給藥時，假定該新的免疫反應在與正在進行的Th2反應物理相分隔的位置上發展，因而使得兩個反應得以平行存在。
免疫系統的另一個重要方面是所謂的主要IgE結合抗原決定部位存在的確定。有人提出這些主要IgE結合抗原決定部位是由三級結構依賴的連續表面區域構成，該區域大小足夠大容納抗體結合，且在異變態反應原、變體和/或來自相關物種的同源變態反應原中保守。能夠在同源變態反應原上結合相似抗原決定部位的交叉反應性IgE的存在得到了臨床觀察的支持，即變態反應患者經常對幾種密切相關的物種反應，如榿木、樺木和榛子，多種草本物種，或嗜皮螨屬(Dermatophagoides)的幾個物種。此外，它得到了實驗室實驗的支持，該實驗證明了來自相關物種的同源變態反應原之間的IgE交叉反應性及一種變態反應原抑制IgE結合同源變態反應原的能力(Ipsen等人，1992，參考文獻16)。眾所周知，暴露和免疫反應以劑量依賴的方式相關。結合這些觀察，可假定保守的表面區域暴露于免疫系統的劑量比不保守的表面區域更高，導致具有更高親和力的IgE抗體的產生，因此有了術語“主要IgE結合抗原決定部位”。
根據這個基本原理，必要的是變態反應原具有與天然變態反應原基本上相同的α-碳主鏈三級結構，因而確保圍繞保守區塊的區域表面拓撲學的保守性，這些區域代表了旨在減少IgE結合的誘變目標。通過實現這些標準，變態反應原有潛力以相對較高的劑量施用以改善其效力，即產生一種保護性的免疫反應而不損害安全性。
此外，本發明基于如下發現，即變態反應癥狀由IgE通過高親和力的受體FceR I在效應細胞即肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的2個特異的結合所導致的變態反應交聯引起。為了說明，我們參考圖15，它描述了具有IgE結合抗原決定部位的變態反應原的理論模型。誘導中介體從肥大細胞釋放及因此產生的變態反應癥狀由變態反應原所介導的結合于肥大細胞表面的IgE所致，參考圖15A。在圖15B所示的情況下，兩個抗原決定部位已經發生突變以減少它們的IgE結合親和力，并因此防止了變態反應原介導的交聯。在這種聯系中應該注意到變態反應原通常包含超過3個的B細胞抗原決定部位。然而，從圖15中描述的理論狀況下可假定發生的以消除或減少其IgE結合能力的抗原決定部位的突變越多，那么變態反應原介導的交聯和結果所得的變態反應癥狀的危險就越低。
然而，為了使突變的變態反應原能夠引起新的免疫反應，包括IgG反應，變態反應原必須包含至少一個未變的抗原決定部位。優選，未變的抗原決定部位是主要的抗原決定部位，因為這樣的突變變態反應原用于疫苗接種時將提供改善的保護。
總之，本發明的發明思想基于如下認識，即具有在多重B細胞抗原決定部位中減少IgE結合的突變的變態反應原突變體和至少一種未變的抗原決定部位將一方面減少變態反應原介導的交聯，另一方面允許引起具有與IgE競爭的結合能力的IgG反應。因而，該變態反應原突變體組成了一種非常有利的變態反應原，這里過敏性的反應的危險將大大減少。
本發明也基于如下認識，即包含不同這樣的變態反應原突變體的混合物的疫苗，其中許多或全部抗原決定部位都理想地表現為未變化，在其誘導對變態反應癥狀的保護的能力上具有與天然存在的變態反應原相同的效力，其中從天然的變態反應原衍生了該變態反應原突變體。
發明概述本發明涉及向一些確定的關鍵位點，即IgE結合的抗原決定部位引入人工的氨基酸替換，目的在于減少每個突變的抗原決定部位的特異的IgE結合能力。
本發明提供了重組變態反應原，其特征在于它是天然存在的變態反應原的突變體，其中變態反應原突變體具有至少4個初級突變，與該天然存在的變態反應原的IgE結合能力相比，這每一個突變都減少了變態反應原突變體的特異的IgE結合能力；其中每一個初級突變都用其他的殘基替換一個表面暴露的氨基酸殘基，在該天然存在的變態反應原所源自的分類學物種中該新殘基不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上；其中每一個初級突變都與任一其他初級突變間隔至少15；且其中初級突變以這種方式分布，以使得至少一個具有8002面積的圓形表面區域不包含有突變。
如果不受理論的限制，相信B細胞抗原決定部位可分布在變態反應原的幾乎整個表面。此外，有實驗證據表明至少一些抗原決定部位組成了包含大量交迭抗原決定部位的抗原決定部位簇的一部分。因此，本發明的理論基礎即為任何表面暴露的氨基酸都構成突變的潛在位點，其可導致降低特異地結合IgE的能力。
因此，初級突變是由它們相互的定位而確定，即它們相互隔開，以確保它們是分離的抗原決定部位簇中的突變。
本發明也提供包含兩或多種根據權利要求1的重組變態反應原突變體的組合物，其中每一個變體都是通過具有至少一個主要突變而定義，該突變在至少一個其他的變體中不存在；其中對于每一個變體而言在每一個不存在的初級突變的15的半徑之內不存在二級突變。該組合物優選包含2～12個，更優選3～10個，更優選4～8個且最優選5～7個變體。
本發明也提供制備根據權利要求1的重組變態反應原的方法，其特征在于a)在天然存在的變態反應原中確定一些氨基酸殘基，它們具有至少20％的溶劑可接近性；b)以這樣的方式選擇至少4個確定的氨基酸殘基以使得每個所選氨基酸與其他所選氨基酸相互間隔至少15，且所選氨基酸是以這種方式放置，使得至少一個具有8002面積的圓形表面區域不包含選擇的氨基酸；和c)對每個所選氨基酸進行初級突變，使得與天然存在的變態反應原的結合能力相比變態反應原突變體的特異性IgE結合能力減少了，其中每個初級突變都是用其他的氨基酸替換所選氨基酸殘基，前者在該天然存在的變態反應原所源自的分類學物種中不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上。
在另一個方面，本發明涉及制備根據本發明的重組變態反應原的方法，其特征在于該變態反應原是從由編碼相應的天然存在的變態反應原的DNA進行的DNA改組(DNA shuffling)(分子培育(Molecular breeding))獲得的DNA序列生產。
此外，本發明涉及根據權利要求1以用作藥物的重組變態反應原。
本發明也涉及根據權利要求1的重組變態反應原在制備預防和/或治療變態反應的藥物中的用途。
此外，本發明涉及根據權利要求37的用作藥物的組合物。
本發明也涉及根據權利要求37的組合物以制備藥物來預防和/或治療變態反應的用途。
更進一步地，本發明涉及藥物組合物，其特征在于它包含根據權利要求1的重組變態反應原或根據權利要求37的組合物，可選地與藥物學上可接受的載體和/或賦形劑，以及可選佐劑結合。根據本發明的藥物組合物可為對抗變態反應的疫苗的形式，該變態反應是由天然存在的變態反應原在遭受變態反應的患者中引起。
本發明也涉及在被試者中產生免疫反應的方法，包含向被試者施用根據權利要求1的重組變態反應原、根據權利要求37的組合物或根據權利要求41-42或46的藥物組合物。
更進一步地，本發明涉及對被試者進行疫苗接種或治療，包含向被試者施用根據權利要求1的重組變態反應原、根據權利要求37的組合物或根據權利要求41-42或46的藥物組合物。
本發明也涉及制備根據權利要求41或42的藥物組合物的方法，包含將根據權利要求1的重組變態反應原或根據權利要求37的組合物與藥物學上可接受的物質和/或賦形劑混合。
更進一步地，本發明涉及由根據權利要求45的方法可獲得的藥物組合物。
本發明也涉及在被試者中治療、預防或減輕變態反應的方法，包含向被試者施用根據權利要求1的重組變態反應原、根據權利要求37的組合物或根據權利要求41-42或46的藥物組合物。
更進一步地，本發明涉及編碼根據本發明的變態反應原的DNA序列、其衍生物、其部分序列、其簡并的序列或在嚴緊條件下與其雜交的序列，其中該衍生物、部分序列、簡并序列或雜交序列編碼具有至少一個B細胞抗原決定部位的肽。
本發明也涉及包含根據本發明的DNA的表達載體。
此外，本發明也涉及含有根據本發明的表達載體的宿主細胞。
此外，本發明涉及生產重組變態反應原突變體的方法，該方法包含培養根據本發明的宿主細胞的步驟。
最后，本發明涉及根據本發明或由根據本發明的DNA序列編碼的重組變態反應原，其包含至少一種T細胞抗原決定部位能夠刺激特異于天然存在的變態反應原的T細胞克隆或T細胞系。
根據本發明的突變體應該優選地能夠以由T細胞刺激指數測量的相似方式/程度來刺激變態反應原特異的T細胞系。
發明詳述在本發明的一個優選實施方案中，初級突變間隔20，優選地為25，且最優選地為30。
相信變態反應原包含許多特異的IgE的潛在結合區，其中每個區域約具有8002的面積，每個表面區域包含大量的交迭抗原決定部位。因而，變態反應原含有許多由8002劃分的表面區域的潛在的初級突變。
優選地，根據本發明的重組變態反應原包含5～20個，優選6～15個，更優選7～12個，且最優選8～10個初級突變。
在本發明的一個優選實施方案中，不含有突變的表面區域具有7002的面積，優選6002，更優選5002且最優選4002。
在本發明的一個優選實施方案中，重組變態反應原包含許多二級突變，與該天然存在的變態反應原的結合能力相比，它們每一個突變都減少了變態反應原突變體的特異的IgE結合能力；其中每一個二級突變都是用其他的殘基替換一個表面暴露的氨基酸殘基，前者在該天然存在的變態反應原所源自的分類學物種中不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上；其中的二級突變是處于圓形表面區域之外。
二級突變可位于靠近初級突變的位置，即二級突變也可是相同抗原決定部位的額外突變，該抗原決定部位已有了初級突變。
在本發明的一個優選實施方案中，在天然存在的變態反應原中至少一個要進行替換的表面暴露的氨基酸具有超過20％的溶劑可接近性，優選超過30％，更優選超過40％且最優選超過50％。
在本發明的另一個優選實施方案中，至少一個要在天然存在的變態反應原中進行替換的表面暴露的氨基酸在該天然存在的變態反應原所源自的分類目中的所有已知的同源蛋白質中具有超過70％，優選80％的且最優選90％的一致性。
優選地，根據本發明的重組變態反應原基本上具有與該天然存在的變態反應原相同的α-碳主鏈三級結構。
當比較突變體和天然存在的變態反應原分子的α-碳主鏈三級結構時，對原子坐標的平均根均方偏差優選地低于2。
在本發明的重組變態反應原的一個優選實施方案中，每一個要結合入變態反應原突變體的氨基酸殘基在該天然存在的變態反應原所源自的分類學屬，優選亞科，更優選科，更優選總科，更優選軍團(legion)，更優選亞目且最優選目中都不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上。
在本發明的一個優選實施方案中，根據本發明的重組變態反應原突變體是非天然存在的變態反應原。
在使用來自來源特異的IgE反應性變態反應患者或其群體的血清進行的免疫測定中與天然存在的異變態反應原或相似的重組蛋白質相比，對突變的變態反應原的特異的IgE結合減少了至少5％，優選至少10％。
估計減少的IgE結合和減少的介導突變體交聯能力的另一個途徑是突變體起始組胺釋放(HR)的能力。組胺的釋放可在幾個組胺釋放測定中被測量。突變體減少的組胺釋放來源于對結合到細胞表面的特異的IgE的親和力的減小及其減少的促進交聯的能力。與天然存在的變態反應原相比，本發明的突變體HR優選減少5～100％，更優選25～100％，更優選50～100％且最優選75～100％。
典型地，不含有突變且具有8002面積的圓形表面區域包含15～25個氨基酸殘基的原子。
根據本發明的一個優選的重組變態反應原特征在于將表面暴露的氨基酸殘基關于溶劑可接近性分級，且將處于較高的溶劑可接近性的氨基酸中的一個或多個替換。
根據本發明一個進一步優選的重組變態反應原特征在于將表面暴露的氨基酸殘基關于其在該天然存在的變態反應原所源自的分類學種中的所有已知同源蛋白質中的保守程度而分級，且將處于較高保守程度的氨基酸中的一個或多個替換。
優選地，根據本發明的重組變態反應原對于每個初級突變包含1～4個二級突變。
本發明的一個優選實施方案特征在于一個或多個替換由定點突變實現。
本發明的另一個優選實施方案特征在于一個或多個替換由隨機誘變實現。
本發明進一步的一個優選實施方案特征在于一個或多個替換由DNA改組實現。
根據本發明的重組變態反應原可適當地為吸入的變態反應原的突變體，它理論上來源于樹、草、草本植物、真菌、屋塵螨、蟑螂和動物毛發和皮屑。來自樹、草和草本植物的重要花粉變態反應原是源自分類目Fagales、Oleales和Pinales的這些，理論上包括樺木(樺木屬(Betula))、榿木(榿木屬(Alnus))、榛樹(榛屬(Corvlus))、角樹(鵝耳櫪屬(Carpinus))和橄欖樹(齊墩果屬(Olea))，Poales目理論上包括黑麥草屬(Lolium)、貓尾草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)和黑麥屬(Secale)等屬的草，Asterales和Urticales目理論上包括豚草屬(Ambrosia)和蒿屬(Artemisia)的草本植物。來自真菌的重要吸入型變態反應原理論上為源自鏈格孢屬(Alternaria)和芽枝霉屬(Cladosporium)的這些。其他重要吸入型變態反應原來自嗜皮螨屬的屋塵螨、來自蟑螂和來自哺乳動物如貓、狗和馬。更進一步地，根據本發明的重組變態反應原可為毒液變態反應原的突變體，包括來自刺人的或咬人的昆蟲，例如來自膜翅目，包括蜜蜂(蜜蜂總科(Apidae))，黃蜂(胡蜂總科(Vespidae))和螞蟻(蟻Formicoidae總科)。
特異的變態反應原成分包括如Fagalrs目的Bet v 1(白樺(B.verrucosa)，樺木)、Aln g 1(膠榿木(Alnus glutinosa)，榿木)、Cor a 1(Corylus avelana，榛子)和Car b 1(樺葉鵝耳櫪(Carpinus betulus)，角樹)。其他的為Cry j 1(Pinales)、Amb a1和2、Art v 1(Asterales)、Par j 1(Urticales)、Ole e 1(Oleales)、Ave e 1、Cyn d 1、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1和5、Pas n 1、Phl p 1和5、Poa p 1、2和5、Sec c 1和5、及Sorh 1(各種草的花粉)、Alt a 1和Cla h 1(真菌)、Der f 1和2、Derp 1和2(屋塵螨，分別為粉塵螨(D.farinae)和屋塵螨(D.pteronyssinus))、Lep d 1和2(Lepidoglyphus destructor；貯藏螨(storage mite))、Bla g 1和2、Per a 1(蟑螂，分別為德國小蠊(Blatella germanica)和美洲大蠊(Periplaneta americana)、Fel d1(貓)、Can f 1(狗)、Equ c 1、2和3(馬)、Apis m 1和2(蜜蜂)、Ves v 1、2和5、Pol a 1、2和5(全為黃蜂)和Sol i 1、2、3和4(火蟻(fire ant))。
在一個實施方案中重組變態反應原是Bet v 1的一個突變體。潛在適合用于替換的氨基酸包含氨基酸V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。一或多種一次和二次替換可選自V2F、V2L、V2I、V2M、Y5V、T10P、T10A、K20N、D25E、N28T、K32Q、Q36A、Q36K、E42S、E45S、N47S、K55N、K65N、D72H、D72Q、D72N、T77A、N78K、E87G、E96L、K97S、K103V、P108G、D109N、K123I、D125Y、K129N、K134E、R145E、S149R、S149T、D156H和+160N，其中+表示插入了一個額外的氨基酸。
根據本發明Bet v 1突變體的實施例如下(當用到時，括弧表示一次和二級突變)突變體A(Asn28Thr，Lys32Gln)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突變體BTyr5Val、Glu42Ser、Glu45Ser、Asn78Lys、Lys103Val、Lys123Ile、Lys134Glu、Asp156His。
突變體2595(實施例2)N28T、K32Q、E45S、P108G突變體2628(實施例4)Tyr5Val、Glu45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu。
突變體2637(實施例4)Ala16Pro、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys103Thr、Pro108Gly、(Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro)。
突變體2724N28T、K32Q、N78K、K103V、P108G、R145E、D156H、+160N。
突變體2733(實施例4)(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Glu45Ser、Lys65Asn、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys97Ser、Pro108Gly、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突變體2744(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Glu42Ser、Glu45Ser)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys123Ile、(Asp156His，+160Asn)。
突變體2753(實施例4)(Asn28Thr，Lys32GIn)、Lys65Asn、(Glu96Leu，Lys97Ser)、(Pro108Gly，Asp109Asn)、(Asp125Tyr，Glu127Ser)、Arg145Glu。
突變體2744+2595Y5V、N28T、K32Q、E42S、E45S、N78K、K103V、P108G、K123I、K134E、D156H、+160N。
突變體2744+2628Y5V、E42S、E45S、K65N、N78K、K97S、K103V、K123I、K134E、D156H、+160N。
突變體2744+2595+2628Y5V、N28T、K32Q、E42S、E45S、K65N、N78K、K97S、K103V、P108G、K123I、K134E、D156H、+160N。
此外，所有上述突變體包含一種或多種下面的替換V2F、V2L、V2I、V2M、T10A、K20N、Q36A或Q36K、D72H、D72Q、D72N、E87G、K129N和S149R或S149T。
在另一個實施方案中，重組變態反應原衍生自來自分類學目胡蜂科(Vespidae)、蜜蜂科(Apidae)和蟻(Formicoidae)總科的毒液變態反應原。
在進一步的實施方案中，重組變態反應原衍生自Ves v 5。潛在適合用于替換的氨基酸包含氨基酸K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。一或多種一次和二次替換可選自K29A、T67A、K78A、V84S、Y102A、K112S、K144A、K202M和N203G。
在進一步的實施方案中，重組變態反應原衍生自Der p 2。潛在適合用于替換的氨基酸包含氨基酸R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。一或多種一次和二次替換可選自K6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q。
根據本發明Bet v 1突變體的實施例如下突變體AK6A、K15E、H30N、E62S。
突變體BK6A、K15E、H30N、E62S、H74N、K82N。
突變體CK6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q疫苗疫苗的制備為本領域眾所周知。疫苗一般以可注射的液體溶液或懸浮液的形式制備。這樣的疫苗也可以乳化或調配以使其能夠經鼻及經口給藥，包括口腔和舌下給藥。正被討論的免疫原性成分(如在此處所限定的重組變態反應原)可適當地與藥物學上可接受，且進一步與活性成分相容的賦形劑混合。適當的賦形劑的實例為水、鹽、右旋糖、甘油、乙醇等以及它們的組合。疫苗另外可含有其他的物質，如潤濕劑、乳化劑、緩沖劑或增強疫苗效力的佐劑。
疫苗最通常通過皮下或肌內注射以腸胃外方式給藥。適合于通過其他途徑給藥的制劑包括口服制劑和栓劑。經口給藥的疫苗可適當地用通常用于這種制劑的賦形劑來調配，如藥物等級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉(sodium saccharine)、纖維素、碳酸鎂等。組合物可被制備成溶液、懸浮掖、乳劑、片劑、藥丸、膠囊、緩釋制備物、氣溶膠、粉末或顆粒。
疫苗的給藥途徑應與劑量配方相容，并且其量在藥物學上有效且具免疫原性。在疫苗中包含的活性成分的量依賴于治療對象、理論上被試者響應于治療的免疫系統對治療的應答能力、給藥途徑及被試者的年齡和體重。適當的劑量范圍在0.0001μg～1000μg。
如上所述，通過向制備物中添加佐劑可獲得增加的作用。這樣的佐劑的實例為氫氧化鋁和磷酸緩沖鹽溶液中0.05％～0.1％的磷酸(明礬)或磷酸鈣溶液、用作0.25％溶液的糖或聚交酯乙交酯(polylactid glycolid)(PLG)的合成多聚體。也可采用與細菌細胞如小棒桿菌(C.parvum)、革蘭氏陰性細菌的內毒素或脂多糖成分的混合物、在生理學可接受的油載體如二縮甘露醇monoaleate(Aracel A)中的乳劑或在用作阻斷替換的20％全氟烴(perfluorocarbon)(如Fluosol-DA)溶液中的乳劑。也可用到油乳劑如MF-59。也可以用到其他的佐劑如弗氏完全和不完全佐劑以及皂苷，如QuilA、Qs-21和ISCOM和RIBI。
最經常地，疫苗的多重給藥對確保其作用是必需的。疫苗經常以初次給藥后伴隨后續接種或其他給藥的方式來給藥。疫苗接種的數量一般為1～50次，通常不超過35次疫苗接種。疫苗接種通常雙周到雙月地進行3個月到5年的時間。預期這將達到預防或治療效果的期望水平。
重組變態反應原可被用作藥物制備物，在癥狀出現所在年的期間適合于提供某些對抗變態反應的保護(預防)。通常，必須每年重復治療以維持保護作用。調配為鼻、口和舌下應用的制備物特別適合于這個目的。
制備根據本發明的重組變態反應原的方法如上所述，本發明也涉及制備本發明的重組變態反應原突變體的方法，參考權利要求48。
依照本發明適合于替換的表面暴露的氨基酸可以其溶劑(水)可接近性的信息為基礎進行確定，該信息表達了其表面暴露的程度。本發明方法的一個優選實施方案特征在于以溶劑可接近性對其中確定的氨基酸殘基進行分級，且在具有較大溶劑可接近性的氨基酸中替換一個或多個。
有助于確定依照本發明的適合用作替換的表面暴露的氨基酸的第二個參數是氨基酸在該天然存在的變態反應原所源自的物種中所有已知同源蛋白質中的保守程度。或者，將其在該天然存在的變態反應原所源自的分類學屬、亞科、科、總科、軍團(legion)、亞目或目中所有已知的同源蛋白質中的保守程度用作這樣的第二個參數。
因此，本發明方法的一個優選實施方案特征在于選擇確定的氨基酸殘基，其在該天然存在的變態反應原所源自的物種中所有已知同源蛋白質中具有超過70％，優選超過80％的且最優選超過90％的一致性。
此外，本發明方法的特別優選的一個實施方案特征在于關于以在該天然存在的變態反應原所源自的物種中所有已知同源蛋白質中的保守程度來對其中確定的氨基酸殘基進行分級，且在具有較大保守性的氨基酸中替換一個或多個。
本發明方法更進一步優選的實施方案包含選擇確定的氨基酸以形成變態反應原突變體，它具有與天然存在的變態反應原基本上相同的α-碳主鏈三級結構。
本發明方法的另一個優選實施方案特征在于對氨基酸殘基的替換通過定點突變來實現。
本發明方法的另一個優選實施方案特征在于對氨基酸殘基的替換通過DNA改組來實現。
替換標準對于三級結構已經確定的分子(例如通過X-射線晶體學或NMR電子顯微鏡方法)，帶有替換的氨基酸的突變體應該優選地符合如下標準1.分子的總α-碳主鏈三級結構優選保守。保守定義為比較結構時原子坐標中平均根均方偏差低于2。這由于兩個原因而重要a)可預期天然的變態反應原的整個表面組成了潛在抗體結合抗原決定部位的一個交迭連續統一體。分子表面的大部分不受替換影響，并因而維持了其抗體結合誘導的性質，這對于產生針對也存在于天然變態反應原上的抗原決定部位的新保護性抗體特異性重要。b)考慮保存限期和注射入體液中時的穩定性。
2.要替換的氨基酸優選位于表面，因而可供抗體結合所接近。位于三維結構的表面的氨基酸通常具有至少20％的溶劑(水)可接近性，適當地為20～80％，更適當地為30～80％。溶劑可接近性定義為對具有與溶劑(水，r＝1.4)分子相當半徑的球體可接近的分子的面積。
3.每個替換的氨基酸優選位于具有超過4002面積的保守區塊中。保守的區塊定義為表面暴露的保守氨基酸殘基和主鏈的連續相結合的區域。保守的氨基酸殘基由處于相同分類學屬、亞科、科、總科、軍團(legion)、亞目或目中的同源蛋白質的所有已知氨基酸序列的序列比對來界定。在超過70％的序列中具有相同氨基酸殘基的氨基酸位置被認為保守。預期保守的區塊含有大多數患者的IgE所針對的抗原決定部位。
α-碳主鏈三級結構的保守是由在誘變前后用X-射線晶體學或NMR獲得相同的結構而最好地確定的。沒有描述突變體結構數據時，如果與由對結構上確定的分子分析所獲得的數據相比，不能區別的CD-譜或免疫化學數據如抗體反應性則能推知大概α-碳主鏈三級結構的保守性。
4.在保守的區塊中，用于誘變的氨基酸應該優選選自優選位于接近保守區塊中心的具有最大溶劑(水)可接近性的那些。
5.優先地，極性氨基酸殘基由另一個極性殘基替換，而非極性氨基酸殘基由另一個非極性殘基替換。
為了基本維持變態反應原的三維結構，要結合進來的氨基酸可基于同該變態反應原的結構類似物的蛋白質的比較來選擇，例如一個與該變態反應原屬于相同分類學目且與該變態反應原不具有任何交叉反應性的蛋白質。
根據本發明的DNA在一個優選實施方案中，本發明的DNA序列是編碼天然存在的變態反應原的DNA序列的衍生物。
優選，該DNA衍生物通過對編碼天然存在的變態反應原的DNA進行定點突變或隨機誘變而獲得。
在第一個特別優選的實施方案中，DNA序列是如圖3所示的序列的一個衍生物，其中的DNA序列進行了突變以編碼具有至少4個突變的變態反應原，這些突變選自K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
在第二個特別優選的實施方案中，DNA序列是如圖13所示的序列的一個衍生物，其中的DNA序列進行了突變以編碼具有至少4個突變的變態反應原，這些突變選自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-20、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
在第三個特別優選的實施方案中，DNA序列是如圖16所示的序列的一個衍生物，其中的DNA序列進行了突變以編碼具有至少4個突變的變態反應原，這些突變選自R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
DNA改組(shuffling)
根據本發明的重組變態反應原突變體可以用從相關天然DNA的DNA改組(分子培育)獲得的DNA來生產。DNA改組可根據在Punnonen等人(參考文獻25)的文章所公開的程序以及其中提到的文章中公開的程序來實施，這些程序在此處引用作為參考。
診斷測定此外，根據本發明的重組變態反應原突變體具有診斷可能性和優點。當前領域中的變態反應疫苗基于天然存在的變態反應原來源的提取物，因而代表了多種同種型。變態反應個體最初針對一種或多種存在的同種型過敏并產生IgE。由于同源性及隨后與使個體發生變態反應的同種型的交叉反應性，一些同種型關于變態反應個體的變態反應是相關的，然而其他同種型由于不具有任何變態反應個體對其具有特異性IgE的IgE結合抗原決定部位而不相關。由于IgE群體特征性的異質性，一些同種型因而可安全地給藥，即它們不導致經由IgE的變態反應，然而其他的同種型可能有害地導致不良的副作用。
因而，打算治療性給藥的本發明的突變體和本發明的組合物也可被用作體內或體外診斷測定以監控使用這種突變體或組合物進行治療的適當性、安全性或結果。應用的診斷樣品包括人體樣品，如血清。
因而，本發明也涉及用根據本發明的重組變態反應原突變體或根據本發明的組合物來估計對被試者的治療的適當性、安全性或結果的診斷測定，其中將被試者的含IgE的樣品與該突變體或該組合物混合并估計該樣品中或該突變體中IgE之間的反應性的水平。對該樣品中或該突變體中IgE之間的反應性的水平的估計可用任何已知的免疫測定來實施。
定義在本發明中，表達“與該天然存在的變態反應原的IgE結合能力相比減少特異性IgE結合能力”指在至少一個免疫測定中，該減少是以統計學顯著的方式(p＜0.05)可測量的，其中的免疫測定應用來自對天然存在的變態反應原發生變態反應的被試者的血清。優選，IgE結合能力減少了至少5％，更優選至少10％。
表達“表面暴露的氨基酸”指氨基酸殘基這樣位于三維結構的表面當變態反應原在溶液中時，氨基酸殘基的至少一個原子的至少一部分可接觸周圍溶劑。優選，在三維結構中的氨基酸殘基具有至少20％的溶劑(水)可接近性，適當地為至少30％，更適當地為至少40％且最優選地為至少50％。
表達“溶劑可接近性”定義為對具有與溶劑分子相當半徑的球體(水，r＝1.4)是可接近的分子面積。
表達“表面暴露的”和“溶劑暴露的”可互換使用。
表達“天然存在的變態反應原所源自的分類學物種”指分類學系統中的物種。
此外，表達“該變態反應原突變體具有與該天然存在的變態反應原基本相同的α-碳主鏈三級結構”指當比較結構時，對原子坐標的平均根均方偏差低于2。
在本發明中，表達“替換”指與天然存在的變態反應原的氨基酸序列相比的氨基酸缺失、替換或加成。
本發明通過下面非限制性的實施例進一步地進行闡明。
實施例實施例1實施例1描述了具有1個或3個初級突變的重組變態反應原突變體的制備。根據本發明的重組變態反應原突變體，即包含至少4個初級突變的變態反應原可用相同的程序來制備。
Fagales花粉變態反應原中共同抗原決定部位的確定主要樺木花粉變態反應原Bet v 1顯示與來自分類學相關的樹木花粉的主要變態反應原有約90％的氨基酸序列一致性，即Fagales(例如榛子和角樹)和樺木花粉變態反應患者常顯示對這些Bet v 1同源蛋白質變態反應交叉反應性的臨床癥狀。
Bet v 1也顯示與在某些水果(例如蘋果和櫻桃)和蔬菜(例如芹菜和胡蘿卜)中存在的變態反應蛋白質有約50～60％的序列一致性，且有臨床證據顯示Bet v 1和這些食物相關的蛋白質之間的變態反應交叉反應性。
另外，Bet v 1與一組稱為病原體相關的蛋白質(PR-10)的植物蛋白質享有顯著的序列一致性(20～40％)，然而對這些PR-10蛋白質的變態反應交叉反應性沒有報道。
分子模型暗示因與Bet v 1結構近乎相同，Fagales和食物變態反應原和PR-10蛋白質的結構相近。
變態反應性Bet v 1的交叉反應性的結構基礎報道于(Gajhede等人1996，參考文獻17)，其中可以確定Bet v 1分子表面的3個區塊同已知的主要樹木花粉變態反應原相同。因而，識別Bet v 1上這些區塊的任何IgE將能夠交叉反應并結合到其他Fagales主要花粉變態反應原上，從而引起變態反應癥狀。對這3個共同區塊的確定是在將主要樹木花粉變態反應原所有已知的氨基酸序列比對結合對報道于參考文獻17中的α-碳主鏈三級結構所揭示的Bet v 1分子表面的分析之后進行。另外，基于結合有抗體后被覆蓋的面積這些區塊界定為具有確定的最小尺寸(＞4002)。
用于定點突變的氨基酸殘基的選擇用于定點突變的氨基酸殘基選自存在于Bet v 1特異區域和共同區塊的殘基，因為對這些殘基的修飾預期可影響其與來自大多數表現臨床樹木花粉變態反應交叉反應性的患者的血清IgE的結合。
各個區塊中每個氨基酸殘基溶劑暴露的相對方向和百分比基于其原子坐標來計算。由于可能導致破壞結構或缺乏抗體相互作用，而不認為具有低程度的溶劑暴露(＜20％)的殘基與誘變相關。剩下的殘基根據其溶劑暴露的程度分級。
序列比對與所考察序列(Bet v 1 No.2801，WHO IUIS變態反應原命名小組委員會)同源的序列是通過BLAST檢索(Altschul等人，參考文獻18)在GenBank和EMBL序列數據庫中得來。將BLAST報告的概率小于0.1的所有序列進行考察，且構建含有不重復同源序列列表的列表。這些序列通過CLUSTAL W(Higgins等人，參考文獻19)進行比對，且一致性百分比考慮了全部列表或單獨分類學相關的物種對序列中的每個位置進行計算。總計有122個序列與Bet v 1 No.2801同源，其中的57個序列源自分類學相關的物種。
編碼Bet v 1的基因的克隆通過酚抽提和LiCl沉淀從白樺(Betula verrucosa)花粉(Allergon，瑞典)制備RNA。Oligo(dT)-纖維素親和層析是在Eppendorph管中以分批方式進行，且雙鏈的cDNA是用商品試劑盒(Amersham)合成。通過PCR擴增編碼Bet v 1的DNA并克隆。簡單扼要地，PCR以cDNA作為模板進行，其引物設計為分別在相應于Bet v 1的氨基端和3’-非翻譯區的位置與cDNA的序列相配對。將引物在5’-端延長以包含限制酶切位點(NcoI和HindIII)以定向克隆入pKK233-2。
亞克隆入pMAL-c將編碼Bet v 1的基因隨后亞克隆入麥芽糖結合蛋白質融合載體pMAL-c(New England Biolabs)。將該基因通過PCR擴增并在malE的框內亞克隆以生成麥芽糖結合蛋白質(MBP)-Bet v 1蛋白質融合操縱子，其中MBP和Bet v 1由因子Xa蛋白酶切割位點分隔，該位點被定位于當切割后可恢復原來的Bet v 1氨基端序列的位置，如在參考文獻15中所描述。簡單扼要地，PCR以插入了Bet v 1的pKK233-3作為模板，且其引物分別相應于蛋白質的氨基-和羧基端。將接近啟動子的引物在5’-端延長以包含在框內編碼因子Xa蛋白酶切割位點的4個密碼子。將兩個引物都在5’-端延長以包含限制酶切位點(Kpn I)以進行克隆。將編碼Bet v 1的基因用20個循環的PCR進行亞克隆以減少PCR假象的頻率。
體外誘變體外誘變以插入了Bet v 1的重組pMAL-c作為模板經過PCR進行。每個突變體Bet v 1基因都是用4個引物由3次PCR來生成的。
合成2個包含每個突變的突變特異性寡核苷酸引物，每個DNA鏈對應1個，參見圖1和2。用突變的核苷酸作為起始位點，兩個引物都在5’-端延長7個核苷酸，而在3’-端延長15個核苷酸。延長的核苷酸在序列上與實際區域的Bet v 1基因相同。
此外合成了2個通用引物(圖2標為“全有義”和“全無義”)并用于所有突變體。這些引物長為15個核苷酸且在序列上與pMAL-c載體中Bet v 1的上游和下游約1千堿基對(kb)處區域的序列相應。上游引物的序列衍生自有義鏈而下游引物的序列衍生自無義鏈，參見圖2。
基本根據標準程序進行2個獨立的PCR反應(Saiki等人1988，參考文獻20)，只進行20次循環變溫以減少PCR假象的頻率。每個PCR反應都使用插入了Bet v 1的pMAL-c作模板且一個突變特異的引物和一個通用引物形成有意義的組合。
在三重區塊突變體中引入4個氨基酸替換(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)如上所述按一步一步的方法進行。首先，用插入了Bet v 1 No.2801、Bet v 1(Glu45Ser)、Bet v 1(Glu45Ser，Pro108Gly)的pMAL-c作為模板來分別引入Glu45Ser突變，然后是Pro108Gly突變，最后是Asn28Thr，Lys32Gln突變。
用瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫及隨后的乙醇沉淀純化PCR產物。第三次PCR反應使用來自前兩次PCR反應產物的組合作為模板和兩個通常可適用的引物來進行。再次使用標準PCR的20次循環。將PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫及隨后的乙醇沉淀進行純化，用限制性內切酶(BsiW I/EcoR I)進行切割，并定向地連接入用相同的酶限制酶切的插入了Bet v 1的pMAL-c中。
圖3表示所有9個Bet v 1突變的概述，其如下Thr10Pro、Asp25Gly、Asn28Thr+Lys32Gln、Glu45Ser、Asn47Ser、Lys55Asn、Glu60Ser(非區塊的)、Thr77Ala和Pro108Gly。也制備具有4個突變的額外的突變體(Asn28Thr、Lys32Gln、Glu45Ser、Pro108Gly)。在這些突變中，選擇5個以進行進一步的檢驗Asn28Thr+Lys32Gln、Glu45Ser、Glu60Ser、Pro108Gly和三重區塊突變體Asn28Thr、Lys32Gln、Glu45Ser、Pro108Gly。
核苷酸測序對Bet v 1編碼基因核苷酸序列的確定分別在亞克隆前后及隨后的體外誘變中進行。
按照供應商的建議，將來自10ml在補充了0.1g/l氨芐青霉素的LB培養基中培養過夜至飽和的細菌培養物的質粒DNA用Qiagen-tip20柱進行純化并用測序酶(Sequenase)2.0型DNA測序試劑盒(USB)進行測序。
重組Bet v 1和突變體的表達和純化如在參考文獻15中所述，將重組Bet v 1(Bet v 1 No.2801和突變體)在大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α中過量表達，融合到麥芽糖結合蛋白質上并純化。簡要地，使重組大腸桿菌細胞在37℃生長到436nm光密度為1.0，隨之Bet v 1融合蛋白質的表達由添加IPTG來誘導。在誘導后3小時通過離心來收集細胞，并重懸于裂解緩沖液中并用超聲斷裂。在超聲處理和額外的離心之后，通過直鏈淀粉親和層析分離重組的融合蛋白質并隨后通過與因子Xa溫育來切割(參考文獻15)。在F Xa切割后，將重組Bet v 1用凝膠過濾來分離，且如果發現必要的話，進行另一輪的直鏈淀粉親和層析以除去痕量的麥芽糖結合蛋白質。
將純化的重組Bet v 1超濾濃縮為約5mg/ml并貯存于4℃。純化的重組Bet v 1制備物的終產量為每升大腸桿菌細胞培養物2～5mg。
純化的重組Bet v 1制備物經銀染SDS-聚丙烯酰胺電泳后顯示單一的表現分子量為17.5kDa的條帶。N-末端的測序顯示預期的序列為衍生自cDNA核苷酸序列，且定量的氨基酸分析顯示預期的氨基酸組合物。
我們在前面顯示(參考文獻15)重組Bet v 1 No.2801與天然存在的Bet v 1在免疫化學上不能區別。
用兔多克隆抗體的免疫電泳以重組Bet v 1蛋白質的形式生產了7個突變體Bet v 1并如上所述進行了純化，然后檢驗它們對多克隆兔抗體的反應性，該抗體由對抗從樺木花粉中分離的Bet v 1而產生。當在天然條件下經免疫電泳(火箭線(rocket-line)免疫電泳)進行分析時，兔抗體能夠沉淀所有的突變體，顯示這些突變體具有保守的α-碳主鏈三級結構。
為了分析對人多克隆IgE反應的作用，選擇了突變體Glu45Ser、Pro108Gly、Asn28Thr+Lys32Gln和Glu60Ser進行進一步的分析。
Bet v 1 Glu45Ser突變體位置45的谷氨酸顯示了高度的溶劑暴露(40％)，并定位于Fagales變態反應原所共有的分子表面區塊(區塊I)。在一些Bet v1同源的PR-10蛋白質中發現絲氨酸殘基占具位置45，這表示谷氨酸可被絲氨酸替換而不使α-碳主鏈三級結構發生變形。另外，由于沒有已知的Fagales變態反應原序列在位置45具有絲氨酸，谷氨酸被絲氨酸替換則產生了一個非天然存在的Bet v 1分子。
用重組的Glu45Ser Bet v 1突變體進行T細胞增殖測定該分析以如Spangfort等人1996a描述方法進行。發現重組Betv 1 Glu45Ser突變體能夠誘導來自3種不同的樺木花粉變態反應患者中的T細胞系的增殖，其刺激指數與重組體的和天然存在的情況相似。
重組的Glu45Ser Bet v 1的結晶和結構確定重組G1u45Ser Bet v 1的晶體于25℃由蒸氣擴散來生長，基本如在(Spangfort等人1996b，參考文獻21)中所述。將濃度為5mg/ml的Glu45Ser Bet v 1與相同體積的2.0M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環，pH6.0的溶液混合，并對100x體積的2.0M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環，pH6.0的溶液進行平衡。平衡24小時之后，通過采用在參考文獻21中所描述的加晶種技術來誘導晶體生長，這里用重組的野生型Bet v 1作為晶種來源。
2個月后，收獲晶體并用如參考文獻21所述從Rigaku旋轉陽極生成的X-射線進行分析，且該結構用分子置換(molecularreplacement)來解決。
Bet v 1 Glu45Ser突變體的結構突變的結構作用通過生長三維Bet v 1 Glu45Ser蛋白質晶體而陳述，當用旋轉陽極生成的X-射線進行分析時該晶體衍射為3.0的分辨率。位置45上谷氨酸到絲氨酸的替換通過Bet v 1 Glu45Ser的結構電子密度圖象證實，該圖象也顯示總的α-碳主鏈三級結構保守。
Bet v 1 Glu45Ser突變體的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1 Glu45Ser突變體與重組Betv 1的IgE結合性質，該測定使用衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
重組Bet v 1 no.2801以摩爾比為1∶5進行生物素化(Bet v 1 no.2801生物素)。抑制測定進行如下將血清樣品(25μl)與固相抗IgE溫育，洗滌，重懸并進一步在生物素化的Bet v 1 no.2801(3.4nM)和給定的突變體(0～28.6nM)的混合物中溫育。結合到固相的生物素化的Bet v 1 no.2801的量通過在用丫啶酯(acridiniumester)標記的鏈酶抗生物素溫育后測量RLU來估計。抑制的程度計算為用緩沖液和突變體作為抑制備物所獲得的RLU的比率。
圖4表示由非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Glu45Ser突變體抑制生物素化的重組Bet v 1對來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。
對存在于血清庫中的血清IgE的結合達到50％的抑制所必需的各種重組蛋白質的量有明顯的差別。重組Bet v 1在約6.5ng即達到了50％的抑制，而相應的Bet v 1 Glu45Ser突變體的濃度為約12ng。這顯示在Bet v 1 Glu45Ser突變體中引入的點突變以約2的系數降低了特異性血清IgE的親和力。由Bet v 1 Glu45Ser突變體達到的最高抑制水平與重組Bet v 1相比明顯較低。這可能顯示在Glu45Ser替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識別Bet v 1Glu45Ser突變體。
Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln位置28和32的天冬氨酸和賴氨酸分別顯示了高度的溶劑暴露(分別為35％和50％)，并位于Fagales變態反應原所共同的分子表面區塊(區塊II)。在結構中，天冬氨酸28和賴氨酸32相互靠近地位于分子表面，且極可能通過氫鍵相互作用。在一些與Bet v 1同源的PR-10蛋白質中發現蘇氨酸和谷氨酸殘基分別占具位置28和32，這表明天冬氨酸和賴氨酸可分別被蘇氨酸和谷氨酸替換而不使α-碳主鏈三級結構發生變形。另外，由于沒有已知的天然發生的異變態反應原序列在位置28和32分別具有蘇氨酸和谷氨酸，則這些替換產生了一個非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較突變體Asn28Thr+Lys32Gln與重組Bet v 1的IgE結合性質，該測定使用上述衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
圖5表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。
對存在于血清庫中的血清IgE的結合達到50％的抑制所必需的各種重組蛋白質的量有明顯的差別。重組Bet v 1在約6.5ng即達到了50％的抑制，而相應的Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln的濃度為約12ng。這顯示在Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln中引入的點突變以約2倍的系數降低其特異性血清IgE的親和力。
由Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln達到的最高抑制水平與重組Bet v 1相比明顯較低。這可能顯示在Asn28Thr+Lys32Gln替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識別Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln。
Bet v 1突變體Pro108Gly位置108的脯氨酸顯示了高度的溶劑暴露(60％)，并位于Fagales變態反應原所共同的分子表面區塊(區塊III)。在一些與Betv 1同源的PR-10蛋白質中發現甘氨酸殘基占具位置108，這表明脯氨酸可被甘氨酸替換而不使α-碳主鏈三級結構發生變形。另外，由于沒有已知的異變態反應原序列在位置108具有甘氨酸，脯氨酸被甘氨酸的替換則產生一個非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Pro108Gly突變體的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1 Pro108Gly突變體與重組Betv 1的IgE結合性質，該測定使用上述衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
圖6表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1 Pro108Gly突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。
對存在于血清庫中的血清IgE的結合達到50％的抑制所必需的各個重組蛋白質的量有明顯的差別。重組Bet v 1在約6.5ng即達到了50％的抑制，而相應的Bet v 1 Pro108Gly突變體的濃度為約15ng。這顯示在Bet v 1 Pro108Gly突變體中引入的點突變以約2倍的系數降低了特異性血清IgE的親和力。
由Bet v 1 Pro108Gly突變體達到的最高抑制水平與重組Bet v 1相比明顯較低。這可能顯示在Pro108Gly替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識別Bet v 1 Pro108Gly突變體。
Bet v 1突變體Glu60Ser(非區塊突變體)位置60的谷氨酸顯示了高度的溶劑暴露(60％)，然而它不位于Fagales變態反應原所共同的分子表面區塊內。在一些與Bet v 1同源的PR-10蛋白質中發現絲氨酸殘基占具位置60，這表明谷氨酸可被絲氨酸替換而不使α-碳主鏈三級結構發生變形。另外，由于沒有已知的異變態反應原序列在位置60具有絲氨酸，谷氨酸被絲氨酸的替換則產生一個非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Glu60Ser突變體的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1 Glu60Ser突變體與重組Betv 1的IgE結合性質，該測定使用上述衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
圖7表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1 Glu60Ser突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。與Glu45Ser、Pro108Gly和Asn28Thr+Lys32Gln突變體相反，谷氨酸60到絲氨酸的替換不顯示對IgE結合性質有任何顯著的作用。這顯示在定義的Fagales共同區塊之外的替換對特異性血清IgE的結合僅具有少量作用，這支持了保守的變態反應原分子表面包含主要IgE結合抗原決定部位的概念。
Bet v 1三重區塊突變體在三重區塊突變體中，將如上所述在3個不同的共同Fagales區塊引入的點突變(Glu45Ser、Asn28Thr+Lys32Gln和Pro108Gly)同時引入以造成具有4個氨基酸替換的人工突變體。
Bet v 1三重區塊突變體的結構分析純化的Bet v 1三重區塊突變體的結構完整性用圓二色(CD)譜學分析。圖8顯示以近乎相同的濃度記錄的重組的和三重區塊突變體的CD譜。來自2個重組蛋白質的CD譜中峰幅和位置的交迭顯示2種制備物含有等量的二級結構，這強有力地暗示α-碳主鏈三級結構沒有受到引入的氨基酸替換的影響。
Bet v 1三重區塊突變體的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1三重區塊突變體與重組Bet v1的IgE結合性質，該測定使用上述衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
圖9表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1三重區塊突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。與上述的單獨的突變體相反，三重區塊突變體抑制曲線相對于重組體不再平行。這顯示在三重區塊突變體中引入的替換與重組體相比改變了IgE結合性質和抗原決定部位的外形。平行性的缺乏使得很難定量三重區塊突變體對特異性血清IgE親和力的降低。
重組Bet v 1在約6ng即達到了50％的抑制，而相應的Bet v 1三重區塊突變體的濃度為約30ng，即親和力以系數5倍降低。然而，為了達到80％的抑制，相應的值分別為20ng和400ng，即以系數20降低。
用重組Bet v 1三重區塊突變體進行T細胞增殖測定該分析以如參考文獻15中所述方法實施。發現重組Bet v 1三重區塊突變體能夠誘導來自3個不同的樺木花粉變態反應患者中的T細胞系的增殖，其刺激指數與重組體的和天然存在的情況相似。這暗示三重區塊突變體可以起始抗體生產所必需的細胞免疫反應。
實施例2實施例2描述了具有1個初級突變的重組變態反應原突變體的制備。根據本發明的重組變態反應原突變體，即包含至少4個初級突變的變態反應原可用相同的程序來制備。
Vespula Vulgaris毒液主要變態反應原抗原5中共同抗原決定部位的確定抗原5是3個黃蜂毒液蛋白質之一，它們是已知的人變態反應原。黃蜂包括大黃蜂類、小黃蜂和黃蜂。另外2個已知的黃蜂毒液變態反應原是磷脂酶A1和透明質酸酶。來自Vespula Vulgaris(Ves v5)的抗原5已在酵母體系中被克隆及表達為重組蛋白質(Monsalve等人1999，參考文獻22)。最近已經以1.8的分辨率確定重組Vesv 5的三維晶體結構(準備中)。該結構的主要特征由4個β-鏈和4個α-螺旋排列在3個堆積層形成“α-β-α三明治”組成。在來自不同黃胡蜂屬(Vespula)物種的抗原5同源變態反應原之間的序列一致性為約90％，這暗示存在保守的分子表面區域和B細胞抗原決定部位。
如前文對3個花粉變態反應原的描述，共同區塊的存在和確定在對黃胡蜂屬抗原5變態反應原所有已知的氨基酸序列進行比對結合對由Ves v 5的三維結構揭示的抗原5的分子表面分析之后進行。圖10顯示單獨比對的抗原5殘基的溶劑可接近性及黃胡蜂屬抗原5序列的比對(左圖版)。在圖10的右圖版顯示了黃胡蜂屬抗原5的分子表面，其中有色區域表示保守區。
用于定點突變的氨基酸戎基的選擇用于定點突變的氨基酸殘基選自存在于黃胡蜂屬共同區塊的殘基，這是因為對這些殘基的修飾預期可影響血清IgE的結合，這些血清IgE來自大多數表現臨床黃胡蜂屬變態反應交叉反應性的患者。
各個區塊中每個氨基酸殘基溶劑暴露的相對方向和百分比基于其原子坐標來計算。由于可能的結構破壞或缺乏抗體相互作用，而不認為具有低程度溶劑暴露的殘基適用于誘變。剩下的殘基根據它們溶劑暴露的程度來分級。
編碼Ves v 5的基因的克隆總RNA以如在(Fang等人1988，參考文獻23)中所描述的方法從Vespula Vulgaris黃蜂的毒液酸腺中分離。
第一鏈cDNA的合成、PCR擴增和Ves v 5基因的克隆以如(Lu等人1993，參考文獻24)中所述方法進行。
亞克隆入pPICZαA將編碼Ves v 5的基因隨后亞克隆入pPICZαA載體中(Invitrogen)以得到Ves v 5在畢赤巴斯德酵母(pichia pastoris)中的分泌表達。將該基因通過PCR擴增并以同啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子分泌信號的編碼序列框相匹配地亞克隆。在該構建體中，α-因子在蛋白質分泌期間將由畢赤巴斯德酵母Kex2蛋白酶體系在體內。
簡單扼要地，PCR以Ves v 5作為模板的，其引物分別相應于蛋白質的氨基-和羧基端。將引物在5’-端延長以分別包含用于克隆的限制酶切位點EcoR I和Xba I。編碼Kex2切割位點的核苷酸在這個構建體中位于蛋白質氨基端上游18個核苷酸處，導致Ves v 5在氨基末端具有6個額外的氨基酸Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe的表達。
將pPICZαA-Ves v 5插入到畢赤巴斯德酵母中插入了Ves v 5基因的pPICZαA載體經過Sac I限制酶切而線性化并插入到畢赤巴斯德酵母基因組的AOX1座位。插入是依照Invitrogen的建議通過在畢赤巴斯德酵母KM71細胞中同源重組而進行。
體外誘變體外誘變以插入了Ves v 5的重組pPICZαA作為模板經過PCR進行。每個突變體Ves v 5基因都使用4個引物由3次PCR來生成。
合成2個包含每種突變的突變特異性寡核苷酸引物，每個DNA鏈對應1個，參見圖11和12。用突變的核苷酸作為起始位點，兩個引物都在5’-端延長了6-7個核苷酸，而在3’-端延長了12-13個核苷酸。延長的核苷酸在序列上與實際區域的Ves v 5基因相同。
此外合成了2個通用的引物(圖12標為“全有義”和“全無義”)并用于所有突變體。為了確保具有原氨基末端的Ves v 5突變體的表達，相應于蛋白質氨基末端的一個引物在5’-端延長了一個Xho I位點。當Ves v 5突變體基因插入到pPICZαA載體中時，在Ves v 5的氨基末端上游直接就再生了Kex2蛋白酶的切割位點。第二個引物在序列上相應于pPICZαA載體中位于Ves v 5基因下游約300bp的區域。相應于Ves v 5的氨基末端的引物序列衍生自有義鏈而下游引物的序列衍生自無義鏈，參見圖11。
基本根據標準程序進行了2個獨立的PCR反應(Saiki等人1988)，只是進行20次循環變溫以減少PCR假象的頻率。每個PCR反應都使用插入了Ves v 5的ppICZαA作為模板且一個突變特異性的引物和一個通用的引物形成有意義的組合。
將PCR產物用“Concert，Rapid PCR Purification System”(Life Technologies)進行純化。第三次PCR反應使用來自前兩次PCR產物的組合作為模板和兩個通常可適用的引物來進行。再次使用標準PCR的20次循環。將PCR產物用“Concert，Rapid PCRPurification System”(Life Technologies)進行純化，用限制性內切酶(XhoI/XbaI)進行切割，并定向地連接入用相同的酶限制酶切的pPICZαA載體中。圖13表示所有Ves v 5突變的概況。
將nPICZαA-Ves v 5突變體插入到畢赤巴斯德酵母中插入了Ves v 5突變體基因的pPICZαA載體經過Sac I限制酶切而線性化并插入到畢赤巴斯德酵母基因組的AOX1座位。插入依照Invitrogen的建議通過在畢赤巴斯德酵母KM71細胞中同源重組而進行。
核苷酸測序Ves v 5編碼基因核苷酸序列的確定分別在亞克隆前后及隨后的體外誘變中進行。
按照供應商的建議，將來自10ml在補充了0.1g/l氨芐青霉素的LB培養基中培養過夜至飽和的細菌培養物的質粒DNA用Qiagen-tip20柱進行純化并用測序酶(Sequenase)2.0型DNA測序試劑盒(USB)進行測序。
重組Ves v 5的表達和純化畢赤巴斯德酵母菌株KM71的重組酵母細胞在30℃于定軌搖床，225rpm，在500ml的瓶中生長直到A600nm為4-6，瓶中含有100ml包含酵母氮堿、生物素、甘油和組氨酸的pH6.0的磷酸緩沖液。細胞經離心收集，并重懸于10mL的相似的用甲醇替換了甘油的緩沖培養基中。于30℃繼續溫育7天，每天添加0.05ml甲醇。
細胞經離心收獲，且收集的培養物流體通過超濾來濃縮。在對50mM的醋酸銨緩沖液，pH4.6透析之后，將樣品應用于在相同緩沖液中平衡的FPLC(Pharmacia)SE-53陽離子交換柱。該柱用0-1.0M的NaCl，50mM醋酸銨線性梯度進行洗脫。收集在約0.4M的NaCl洗脫出的重組Ves v 5峰并對0.02N的乙酸進行透析。在濃縮到約為10mg/ml之后，將純化的Ves v 5保存于4℃。
重組Ves v 5的結晶Ves v 5的晶體于25℃用蒸氣擴散技術來生長。為了結晶，將5μl 5mg/ml的Ves v 5與5μl含18％的PEG 6000、0.1M的檸檬酸鈉，pH6.0的溶液混合，并對1ml含18％的PEG 6000、0.1M的檸檬酸鈉，pH6.0的溶液進行平衡。
X-射線衍射數據于100K從天然Ves v 5晶體及插入重原子衍生物之后收集，并用于解析Ves v 5的三維結構，參見圖10(原稿在準備中)。
用兔多克隆抗體的免疫電泳以重組Ves v 5蛋白質的形式生產2個Ves v 5突變體并檢驗了它們對多克隆兔抗體的反應性，該抗體是對抗重組Ves v 5而產生的。當在天然條件下經火箭免疫電泳進行分析時，兔抗體能夠沉淀重組Ves v 5以及兩種突變體，顯示這些突變體具有保守的α-碳主鏈三級結構。
特異性血清IgE的抑制在液相IgE抑制測定中比較Ves v 5突變體與重組Ves v 5的IgE結合性質，該測定使用衍生自黃蜂毒液變態反應患者的血清IgE庫。
抑制測定如上文所述用生物素化的重組Ves v 5代替Bet v 1進行。
Ves v 5 Lys72Ala突變體位置72的賴氨酸顯示高度的溶劑暴露(70％)，并位于黃胡蜂屬抗原5所共同的分子表面區塊。溶劑暴露的相對方向和高程度的溶劑暴露說明賴氨酸72可被丙氨酸殘基替換而不使α-碳主鏈三級結構發生變形。另外，由于沒有已知的異變態反應原序列在位置72具有丙氨酸，賴氨酸被丙氨酸的替換則產生了一個非天然存在的Ves v 5分子。
Ves v 5 Lys72Ala突變體的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較Ves v 5 Lys72Ala突變體與重組Vesv 5的IgE結合性質，該測定使用上述衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
圖14表示由非生物素化的Ves v 5和Ves v 5 Lys72Ala突變體抑制生物素化的重組Ves v 5與來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。
對存在于血清庫中的血清IgE的結合達到50％的抑制所必需的各個重組蛋白質的量有明顯的差別。重組Ves v 5在約6ng即達到了50％的抑制，而相應的Ves v 5 Lys72Ala突變體的濃度為40ng。這顯示在Ves v 5 Lys72Ala突變體中引入的點突變以約6倍的系數降低了特異性血清IgE的親和力。由Ves v 5 Lys72Ala突變體達到的最高抑制水平與重組Ves v 5相比明顯較低。這可能顯示在Lys72Ala替換之后，一些存在于血清庫中的特異的IgE不能識別Ves v 5 Lys72Ala突變體。
Ves v 5 Tyr96Ala突變體位置96的酪氨酸顯示了高度的溶劑暴露(65％)，并位于黃胡蜂屬抗原5所共同的分子表面區塊。溶劑暴露的相對方向和高的溶劑暴露程度表明酪氨酸96可被丙氨酸殘基替換而不使α-碳主鏈三級結構發生變形。另外，由于沒有已知的異變態反應原序列在位置96具有丙氨酸，酪氨酸被丙氨酸的替換則產生了一個非天然存在的Ves v5分子。
Ves v 5 Tyr96Ala突變體的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較Ves v 5 Tyr96Ala突變體與重組Vesv 5的IgE結合性質，該測定使用上述衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
圖14表示由非生物素化的Ves v 5和由Ves v 5 Tyr96Ala突變體抑制生物素化的重組Ves v 5與來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。
對存在于血清庫中的血清IgE的結合達到50％的抑制所必需的各個重組蛋白質的量中有明顯的差別。重組Ves v 5在約6ng即達到了50％的抑制，而相應的Ves v 5 Tyr96Ala突變體的濃度為40ng。
這顯示在Ves v 5 Tyr96Ala突變體中引入的點突變以約6倍的系數降低了特異性血清IgE的親和力。
由Ves v 5 Tyr96Ala突變體達到的最高抑制水平與重組Ves v 5相比明顯較低。這可能顯示在Tyr96Ala替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識別Ves v 5 Tyr96Ala突變體。
實施例3對用于替換的氨基酸的確定和選擇用溶劑可接近性和保守程度參數來確定和選擇適合于對變態反應原Bet v 1、Der p 2和Ves v 5進行替換的表面暴露的氨基酸。
溶劑可接近性溶劑可接近性用軟件InsightII版本97.0(MSI)和1.4的探測半徑來計算。
通過使用軟件PASS(推定的球體活性位點)以探針充滿而從分析中排除內部腔。隨后手動去除表面的探針。
保守性Bet v 13-D結構基于訪問號Z80104(1bv1.pdb)。
包括在保守殘基分析中的38個其他的Bet v 1序列包含訪問號P15494＝X15877＝Z80106、Z80101、AJ002107、Z72429、AJ002108、Z80105、Z80100、Z80103、AJ001555、Z80102、AJ002110、Z72436、P43183＝X77271、Z72430、AJ002106、P43178＝X77267、P43179＝X77268、P43177＝X77266、Z72438、P43180＝X77269、AJ001551、P43185＝X77273、AJ001557、Z72434、AJ001556、Z72433＝P43186、AJ001554、X81972、Z72431、P45431＝X77200、P43184＝X77272、P43176＝X77265、S47250、S47251、Z72435、Z72439、Z72437、S47249。
Der p 23-D結構基于訪問號P49278(1a9v.pdb)的。
包括在保守殘基分析中的6個其他的Der p 2序列包含下列替換ALK-GV40L、T47S、M111L、D114N。
ALK-101M76V。
ALK-102V40L、T47S。
ALK-104T47S、M111I、D114N。
ALK-113T47S。
ALK-120V40L、T47S、D114N。
Ves v 53-D結構基于訪問號Q05110(pdb坐標尚未發表)。
在保守殘基分析中的另一個Ves v 5序列含有一個氨基酸替換M202K。
結果Bet v 1高溶劑暴露的59個氨基酸K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、T-77、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、L-62、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
高度溶劑暴露且保守(＞70％)的57個氨基酸K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
進行的23個突變Y5V、T10P、D25E、N28T、K32Q、E42S、E45S、N47S、K55N、K65N、T77A、N78K、E96L、K97S、K103V、P108G、D109N、K123I、D125Y、K134E、R145E、D156H、+160N。
表1以下降順序表示Bet v 1氨基酸的溶劑暴露程度的列表。第1列列出起始于氨基末端的氨基酸號碼，第2列以單字母縮寫列出了氨基酸，第3列列出正規化的溶劑暴露指數，第4列列出了已知序列在該位置具有保守氨基酸的百分數。
表1Bet v 1NO AA Solv_exp Cons％129K1,000 9060E 0,986 9747N 0,979 10065K 0,978 100108P0,929 100159N0,869 10093D 0,866 100123K0,855 10032K 0,855 100125D0,821 74145R0,801 90109D0,778 8277T 0,775 56
127E 0,760 10036Q0,749 95131E 0,725 100152L 0,718 976E 0,712 10096E0,696 100156D 0,693 9763P0,692 9776H0,683 908E 0,638 97134K 0,630 10045E0,623 10010T0,613 9712V0,592 10020K0,584 10062L0,575 5155S 0,568 97126H 0,551 9550P0,541 10078N0,538 100119K 0,529 1002V 0,528 10024L0,528 10042E0,519 1004N 0,517 95153A 0,513 10044I0,508 97138E 0,496 10061G0,488 100130A 0,479 9770R0,474 10028N0,469 9035P0,467 100149S 0,455 92103K 0,447 100150Y 0,438 100154H 0,436 10043N0,412 100106A 0,411 95115K 0,411 10014P0,410 975Y 0,410 100137K 0,396 100141E 0,387 9587E0,385 10073E0,384 10016A0,367 10079F0,362 1003F 0,355 100158Y 0,346 100105V 0,336 100101E 0,326 10064F0,325 10086I0,322 10039S0,314 100124G 0,310 10072D0,308 97
142T 0,2936766Y0,28910055K0,2881007T 0,2796740S0,2749525D0,27187135A 0,2679268K0,26210097K0,24710046G0,23510027D0,232971G 0,227100113I 0,2257751G0,22010092G0,21810080K0,212100110G 0,211100107T 0,2038594T0,2029241V0,2019748G0,19810091I0,1921831P0,18810075D0,1889733V0,18310049G0,17610017R0,17210099S0,1586489G0,15410053I0,154100121H 0,1531009T 0,1507274V0,14897132Q 0,1467257S0,13749148E 0,13510082N0,13341128V 0,12564117S 0,1248790P0,11767116I 0,112100122T 0,107100139M 0,1046295L0,1049754K0,096100146A 0,09510059P0,08897157A 0,088100133V 0,0774488G0,068100140G 0,0538537A0,0429581Y0,04110023I0,03695104I 0,03692
15A0,0369758F0,02910029L0,02810019F0,027100100N 0,0229722F0,0219771V0,014100111G 0,01410013I0,01410018L0,01497114L 0,01410011S0,007100151L 0,00797144L 0,0079052T0,00710084S0,00797118N 0,00797102I 0,00710021A0,0009726G0,0009730F0,0004434A0,00010038I0,0008756I0,00010067V0,0009769D0,0006283Y0,0009585V0,0007298I0,00095112S 0,00077120Y 0,00095136S 0,00067143L 0,000100147V 0,000100
Der p 2高度溶劑暴露的55個氨基酸R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、D-114、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
高度溶劑暴露且保守(＞70％)的57個氨基酸R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
進行的6個突變K6A、K15E、H30N、E62S、H74N、K82N表2以下降順序表示Des p 2氨基酸的溶劑暴露程度的列表。第1列列出起始于氨基末端的氨基酸號碼，第2列以單字母縮寫列出氨基酸，第3列列出正規化的溶劑暴露指數，第4列列出了已知序列在該位置具有保守氨基酸的百分數。
表2Der p 2NO AASolv_exp Cons％128R 1,000 100129D 0,965 10011H0,793 10030H0,712 1001S 0,700 10077K0,694 10075Y0,681 10031R0,677 10082K0,658 1006K 0,645 10096K0,643 100
48K0,64210055K0,64110089K0,62710085Q0,62410092W0,61010097I0,58110022H0,56810065V0,55910024S0,55710074H0,54210026K0,54210061L0,53910026P0,51610093N0,51310064D0,50910028I0,50410014K0,493100100K 0,48910062E0,454100127I 0,439100102E 0,42810025E0,42810066P0,427100114D 0,4185717L0,41210060G0,39010095P0,38810053E0,37710081V0,37710051K0,370100103N 0,3691002Q 0,36610046N0,36010042E0,35710091T0,34010087D0,33410010N0,333100111M 0,325718C 0,323100124H 0,31510068I0,31310079P0,307100109K 0,30710015K0,30210049T0,29210044N0,291100113D 0,29010063V0,286100105V 0,28010019P0,27010084Q0,26410076M0,262867D 0,251100116V 0,24410078C0,23810036Q0,23510045Q0,23310040V0,2235757S0,212100
38E 0,205 10069D 0,203 1009A 0,196 10071N 0,190 10098A 0,186 100115G0,180 10013I 0,179 100123T0,179 10034P 0,178 1004D 0,157 10020G 0,150 100107T0,143 10012E 0,137 10094V 0,137 100121I0,136 10083G 0,128 10070P 0,128 10073C 0,120 1003V 0,116 10035F 0,111 10059D 0,099 10029I 0,098 10023G 0,085 10054I 0,075 1005V 0,075 100101S0,074 10072A 0,069 10027C 0,060 10032G 0,059 10099P 0,058 10086Y 0,056 10016V 0,052 10050A 0,040 10090Y 0,039 10018V 0,035 10033K 0,033 10052I 0,029 10058I 0,029 100104V0,024 100112G0,023 10021C 0,023 10088I 0,023 100117L0,016 10056A 0,011 10041F 0,011 100120A0,006 100119C0,006 10067G 0,005 100122A0,005 10037L 0,000 10039A 0,000 10043A 0,000 10047T 0,000 2980L 0,000 100106V0,000 100108V0,000 100110V0,000 100118A0,000 100125A0,000 100
Ves v 5高度溶劑暴露的89個氨基酸K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、K-202、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、M-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85、I-182。
高度溶劑暴露且保守(＞70％)的88個氨基酸K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-1 12、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、M-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85、I-182。
進行的9個突變K29A、T67A、K78A、V84S、Y102A、K112S、K144A、K202M、N203G表3以下降順序表示Ves v 5氨基酸的溶劑暴露程度的列表。第1列列出了起始于氨基末端的氨基酸號碼，第2列以單字母縮寫列出了氨基酸，第3列列出了正規化的溶劑暴露指數，第4列列出了已知序列在該位置具有保守氨基酸的百分數。
表3Ves v 5NO AASolv_exp16K1,000100185K 0,98910011K0,97810044K0,978100210K 0,96210063R0,95610013K0,9511006F 0,868100149K 0,868100128K 0,857100184E 0,841100112K 0,824100202K 0,82450157F 0,8191003E 0,80210029K0,797100203N 0,79710034N0,77510078K0,775100151K 0,75310015L0,714100158L 0,714100102Y 0,687100186W 0,665100134K 0,65410087D0,62110052K0,61510067T0,610100125T 0,610100150K 0,60410040Y0,59310048Q0,59310065L0,59310081K0,588100101Q 0,577100208Q 0,566100144K 0,5601008N 0,55510070N0,549100104H 0,54910045Q0,538100137K 0,538100159K 0,533100205E 0,51110082N0,500100111A 0,500100131D 0,49510024K0,48910036V0,4891007N 0,484100138M 0,473100
209T 0,473 10084V0,462 100172K 0,451 10019V0,445 10056D0,445 10073P0,440 10033G0,429 100106T 0,429 100170N 0,429 10028L0,423 10043T0,423 100114Q 0,423 10010C0,412 10060K0,407 10031N0,396 10047K0,396 1005E 0,390 100145D 0,390 10038V0,379 100127A 0,379 100156D 0,379 100204E 0,374 10071P0,363 10026G0,352 100129Y 0,352 100141D 0,341 100201F 0,341 10068R0,335 100200N 0,308 10049D0,302 100153S 0,302 10035K0,297 10039S0,291 10025Y0,280 10037V0,280 10018G0,275 10085W0,275 100182I 0,275 10046E0,264 100126A 0,253 10088E0,247 10076P0,236 10079N0,236 100124S 0,236 10030P0,231 100123G 0,231 100162H 0,231 100183Q 0,231 10012I0,225 100197P 0,225 100130D 0,220 100148P 0,214 100180K 0,214 10023C0,209 10075P0,209 100113Y 0,209 100108R 0,203 100188K 0,203 10051L0,198 10059Q0,198 100
121L 0,198 100122T 0,198 100154G 0,192 10053E0,170 10072G0,170 10041G0,165 10086N0,165 100147N 0,165 100173E 0,165 10027S0,159 10094Q0,159 100187H 0,159 100142E 0,154 10064G0,148 10017G0,143 100133V 0,137 10042L0,121 100155N 0,121 10055N0,115 10091Y0,115 10069G0,110 100103G 0,110 100198S 0,110 100109D 0,093 100207Y 0,082 10096W0,077 100161G 0,077 100140E 0,071 100152F 0,071 10080M0,066 100117Q 0,066 1004A 0,060 10032C0,055 10090A0,055 100206L 0,055 10022A0,049 100110V 0,044 100146Y 0,044 10014C0,038 1009Y 0,033 10062A0,033 100132P 0,033 10057F0,027 10099Q0,027 100100C 0,027 100199G 0,027 10077A0,022 100105D 0,022 100119V 0,022 10020H0,016 10083L0,016 100120A 0,016 100139W 0,016 100176C 0,016 100178S 0,016 100181Y 0,016 10095V0,011 100115V 0,011 100116G 0,011 100165Q 0,011 100
169A 0,011 100189H 0,011 10066E0,005 10074Q0,005 10089L0,005 10092V0,005 10098N0,005 100118N 0,005 100168W 0,005 10021T0,000 10050I0,000 10054H0,000 10058R0,000 10061I0,000 10093A0,000 10097A0,000 100107C 0,000 100135L 0,000 100136V 0,000 100143V 0,000 100160T 0,000 100163Y 0,000 100164T 0,000 100166M 0,000 100167V 0,000 100171T 0,000 100174V 0,000 100175G 0,000 100177G 0,000 100179I 0,000 100190Y 0,000 100191L 0,000 100192V 0,000 100193C 0,000 100194N 0,000 100195Y 0,000 100196G 0,000 100
實施例4本實施例描述了制備和表征根據本發明的重組突變體Bet v 1變態反應原，即包含至少4個初級突變且具有減小的IgE結合親和力的變態反應原。
用于Bet v 1定點突變的氧基酸殘基的選擇Bet v 1的氨基酸殘基的溶劑可接近性如實施例3表1所示。氨基酸保守的比率基于用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSyMolecular Biology Server(http//www.expasy.ch/)上進行的序列比對，其中用Bet v 1.2801野生型氨基酸序列作為輸入序列。該比對包括來自Fagales目中物種(Bet v 1白樺(Betula verrucosa)；Carb 1樺葉鵝耳櫪(Carpinus betulus)；Cor a 1Corylus avellana；Aln g 1膠榿木(Alnus glutinosa))的67個變態反應原序列(39個Bet v 1序列、11個Car b 1序列、6個Cor a 1序列和13個Aln g1序列)。考慮到在實施例中顯示的突變重組Bet v 1變態反應原，用于替換的目標殘基基于≥95％的氨基酸一致性。
如在實施例1中所描述的，將來自相關物種的花粉變態反應原之間具有高溶劑暴露程度的和高度保守性的氨基酸殘基選來用于定點突變。不認為具有低溶劑暴露程度的(＜20％)殘基與誘變相關，這是由于可能的三級結構破壞或抗體相互作用的缺乏。
引入的殘基都存在于一組稱為病理相關(PR-10)蛋白質的植物蛋白質同種型的相應位置。分子模型暗示Fagales變態反應原和PR-10蛋白質的三級結構近乎相同。Bet v 1與PR-10蛋白質共享顯著的序列一致性(20-40％)。然而，沒有對這些PR-10蛋白質的變態反應交叉反應性的報道。因而，來自Bet v 1的高度保守和溶劑暴露的氨基酸與PR-10蛋白質中相應位置上的氨基酸的交換導致一個突變的Bet v 1蛋白質，其α-碳主鏈三級結構沒有改變但具有減小的IgE結合親和力。
體外誘變體外誘變用插入了Bet v 1的重組pMAL-c作為模板通過PCR來進行。包含5～9個初級突變的重組變態反應原突變體的制備包括兩個PCR步驟步驟I和步驟II。首先，分別用包含每個突變的有義和反義突變特異性寡核苷酸引物連同包含上游或下游臨近突變或Betv 1的N-末端/C-末端的有義和反義寡核苷酸引物，將單一的突變(或者幾個突變，如果它們在DNA序列中緊密靠在一起)引入到Bet v1.2801或Bet v 1.2801衍生物連續的DNA序列中，如在圖17中示意性闡明的(I)。其次，將來自PCR反應I的PCR產物純化、混合并用作另外的PCR反應(II)的模板，其寡核苷酸引物包含Bet v 1的N-末端和C-末端，如在圖17中示意性闡明的(II)。將PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳和PCR凝膠純化(Life Technologies)和隨后的乙醇沉淀進行純化，用限制性內切酶(Sac I/EcoR I)或(Sac I/Xba I)進行切割，并定向地連接入用相同的酶限制酶切的pMAL-c中。
圖18表示合成的寡核苷酸引物和對構建具有5～9個初級突變的Bet v 1突變體的示意性闡明。突變的氨基酸優選地選自特征在于如實施例3所述具有高度溶劑暴露和保守性的氨基酸。Bet v 1突變體為如下在括弧中陳述的一次和二級突變突變體Bet v 1(2628)Tyr5Val、Glu45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu。
突變體Bet v 1(2637)Ala16Pro、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys103Thr、Pro108Gly、(Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro)。
突變體Bet v 1(2733)(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Glu45Ser、Lys65Asn、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys97Ser、Pro108Gly、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突變體Bet v 1(2744)Tyr5Val，Lys134Glu)、(Glu42Ser，Glu45Ser)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys123Ile、(Asp156His，+160Asn)。
突變體Bet v 1(2753)(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys65Asn、(Glu96Leu，Lys97Ser)、(Pro108Gly，Asp109Asn)、(Asp125Tyr，Glu127Ser)、Arg145Glu。
核苷酸測序對Bet v 1編碼基因核苷酸序列的確定分別在亞克隆前后及隨后的體外誘變中進行。
按照供應商的建議，將來自10ml在補充了0.1g/l氨芐青霉素的LB培養基中培養過夜至飽和的細菌培養物的質粒DNA用Qiagen-tip20柱進行純化，并用均來自(Perkin Elmer)的快速反應染料終止子循環測序試劑盒(Ready reaction dye terminator cycle sequencingkit)和熒光測序儀(Fluoresence Sequencer)AB PRISM 377進行測序。
重組Bet v 1和突變體的表達和純化如在參考文獻15中所描述的，將重組Bet v 1(Bet v 1 No.2801和突變體)在大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α中過量表達，融合到麥芽糖結合蛋白質上并純化。簡要地，使重組的大腸桿菌細胞在37℃生長到600nm時光密度為0.8，隨之由添加IPTG來誘導Bet v1融合蛋白質的表達。在誘導后3小時通過離心來收集細胞，重懸于裂解緩沖液中并用超聲斷裂。在超聲處理和額外的離心之后，通過直鏈淀粉親和層析分離重組的融合蛋白質并隨后通過與因子Xa的溫育來切割(參考文獻15)。在F Xa切割后，將重組Bet v 1用凝膠過濾來分離，并進行另一輪的直鏈淀粉親和層析以除去痕量的麥芽糖結合蛋白質。
將純化的重組Bet v 1超濾濃縮為約5mg/ml并貯存于4℃。純化的重組Bet v 1制備物的終產量為每升大腸桿菌細胞培養物2～5mg。
純化的重組Bet v 1制備物經銀染SDS-聚丙烯酰胺電泳后顯示單一的表現分子量為17.5kDa的條帶。
我們在前面顯示(參考文獻15)重組Bet v 1 No.2801與天然存在的Bet v 1在免疫化學上不能相區別。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體圖19表示在Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)分子表面引入點突變。在突變體Bet v 1(2628)中，在Bet v 1的一半上引入5個初級突變而另一半沒有改變。在突變體Bet v 1(2637)中，在Bet v 1的另一半上引入5個初級和3個二級突變，而第一半不改變。通過這個途徑，在突變體Bet v 1(2628)和突變體Bet v 1(2637)中的突變分別影響Bet v 1表面的不同的一半。
重組Bet v 1(2628)突變體的結晶和結構確定重組Bet v 1(2628)的晶體于25℃蒸氣擴散來生長，基本如在(Spangfort等人1996b，參考文獻21)中所描述。將濃度為5mg/ml的Bet v 1(2628)與相同體積的2.2M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環，pH6.3的溶液混合，并對100x體積的2.2M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環，pH6.3的溶液進行平衡。平衡24小時之后，通過采用在參考文獻21中所描述的加晶種技術來誘導晶體生長，這里用重組體的野生型Betv 1作為晶種來源。
約4個月后，收獲晶體并用如參考文獻21所描述的從Rigaku旋轉陽極生成的X-射線進行分析，且該結構用分子置換(molecularreplacement)來解析。
Bet v 1(2628)突變體的結構突變的結構作用通過生長三維Bet v 1(2628)蛋白質晶體而陳述，當用旋轉陽極生成的X-射線進行分析時該晶體衍射為2.0的分辨率。替換Tyr5Val、G1u45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu是通過Bet v 1(2628)的結構電子密度圖象證實的，該圖象也顯示總的α-碳主鏈三級結構是保守的。
Bet v 1(2637)突變體的結構分析純化的Bet v 1(2637)突變體的結構完整性用圓二色(CD)譜分析。圖20顯示以近乎相同的濃度記錄的重組Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2637)突變體的CD譜。來自2個重組蛋白質的CD譜中峰幅和位置的交迭顯示這2種制備物含有相同量的二級結構，這強有力地暗示α-碳主鏈三級結構沒有受到氨基酸替換引入的影響。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體的IgE結合性質在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)以及Bet v 1(2628)與Bet v 1(2637)的1∶1混合物同重組野生型Bet v 1.2801的IgE結合性質，該測定使用衍生自樺木變態反應患者的血清IgE庫。
如在實施例1中所描述，重組Bet v 1.2801以摩爾比為1∶5進行生物素化(Bet v 1 no.2801生物素)。抑制測定如下進行將血清樣品(25μ1)與固相抗IgE溫育，洗滌，重懸并進一步同生物素化的Bet v 1.2801和給定的突變體或兩種突變體的1∶1混合物溫育。結合到固相的生物素化的Bet v 1.2801的量通過在溫育后用丫啶酯標記的鏈酶抗生物素測量RLU來估計。抑制的程度計算為用緩沖液和突變體作抑制備物所獲得的RLU比率。
圖21表示由非生物素化的Bet v 1.2801和Bet v 1(2628)、Betv 1(2637)以及Bet v 1(2628)與Bet v 1(2637)的1∶1混合物抑制生物素化的重組Bet v 1.2801與來自變態反應患者庫的血清IgE的結合。
對存在于血清庫中的血清IgE的結合達到50％的抑制所必需的各個重組蛋白質的量有明顯的差別。重組Bet v 1.2801在約5ng即達到了50％的抑制，而相應的Bet v 1(2628)突變體的濃度為約15-20ng。這顯示在Bet v 1(2628)突變體中引入的點突變以約3-4倍的系數降低了特異性血清IgE的親和力。
由Bet v 1(2628)突變體達到的最高抑制水平與重組Bet v1.2801相比明顯較低。這可能顯示由于點突變的引入，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識別Bet v 1(2628)突變體。
Bet v 1(2637)在約400-500ng達到50％的抑制，顯示在Bet v1(2637)突變體中引入的點突變使其與Bet v 1.2801相比將對特異性血清IgE的親和力降低了80～100倍。在IgE結合中的巨大差異進一步由Bet v 1.2801的抑制曲線相比于Bet v 1(2637)突變體蛋白質的抑制曲線所得的明顯的傾角差別的支持。提供證據表明IgE結合減少的不同的傾角歸因于與Bet v 1.2801相比突變體顯然不同的抗原決定部位的模式。
除用單獨修飾的變態反應原的進行抑制測定之外，對分別與Betv 1(2628)或Bet v 1(2637)的樣品具有等摩爾濃度的Bet v 1的Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)的1∶1混合物進行檢驗，它們顯示完全能抑制rBet v 1.2801對IgE的結合(100％)。完全抑制IgE結合的能力清楚表明所有存在于Bet v 1.2801上的活性抗原決定部位也存在于1∶1的變態反應原混合物中。進一步的證明來自Bet v1.2801和變態反應原混合物兩抑制曲線的可相比較的傾角。混合的變態反應原樣品減少的IgE反應性通過當與Bet v 1.2801相比時，為得到50％的IgE結合抑制需要高4-倍濃度的變態反應原混合物來證明。
用突變的重組Bet v 1變態反應原進行T細胞增殖測定該分析以如參考文獻15所述方法進行。Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)兩者均能夠誘導來自樺木花粉變態反應患者中的T細胞系的增殖，其刺激指數與重組體的和天然存在的情況相似。這暗示Betv 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體蛋白質均能起始抗體生產所必需的細胞免疫反應。
人嗜堿性粒細胞的組胺釋放測定嗜堿白細胞組胺釋放如下進行。從每個樺木花粉變態反應患者取肝素化的血液(20ml)，貯存于室溫，并在24小時內使用。將25微升肝素化的全血置于玻璃纖維覆蓋的微量滴定孔中(ReferenceLaboratory，Copenhagen，丹麥)并與25微升的變態反應原或抗-IgE于37℃溫育1小時。其后漂洗平板并去除干擾物質。最后，結合到微纖維上的組胺進行熒光分光光度測量。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體蛋白質的組胺釋放性質組胺釋放的數據在圖22和圖23中顯示。Bet v 1(2628)和Betv 1(2637)突變體蛋白質在來自兩個樺木花粉變態反應患者的人嗜堿性粒細胞中誘導組胺釋放的潛能與Bet v 1.2801的釋放曲線相比明顯地右移。該移動表明Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)的潛能減少了3～10倍。
突變體Bet v 1(2744)和突變體Bet v 1(2753)Bet v 1(2744)和突變體Bet v 1(2753)同樣構建用作混合的變態反應原疫苗。在這些突變變態反應原中，點突變如圖24和25所示以一種全表面排列的方式分布，并再次設計為分別在兩個分子中影響不同的表面，如在圖26中所示。然而，這些修飾的變態反應原也可單獨用作單一變態反應原疫苗。
Bet v 1(2744)突變體蛋白質的結構分析純化的Bet v 1(2744)突變體的結構完整性用圓二色(CD)譜學分析。圖27顯示以近乎相同的濃度記錄的重組Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2744)突變體的CD譜。來自2個重組蛋白質的CD譜中峰幅和位置的交迭顯示2種制備物含有相同量的二級結構，這強有力地暗示α-碳主鏈三級結構沒有受到氨基酸替換引入的影響。
Bet v 1(2744)的組胺釋放性質從來自5種不同的花粉變態反應患者的嗜堿白細胞的5個實驗中得來的組胺釋放數據在圖29和圖29A-D中顯示。已檢驗了Bet v 1(2744)突變體蛋白質在人嗜堿性粒細胞中誘導組胺釋放的潛能。突變的變態反應原的釋放曲線與Bet v 1.2801的釋放曲線相比明顯地右移，這表明Bet v 1(2744)釋放組胺的潛能減少了3～5倍。
突變體Bet v 1(2733)
已構建并重組表達了具有9個初級突變的突變體Bet v 1(2733)。突變體Bet v 1(2733)中點突變的分布留下了幾個組成＞4002的沒有改變的表面區域。圖30表示在Bet v 1(2733)分子表面引入的點突變。
實施例5本實施例描述了編碼來自屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)的Der p 2的基因的克隆和具有減少的IgE結合親和力的突變體的構建。
從屋塵螨第一鏈cDNA合成所得的PCR擴增產物得自Dr.Wendy-Anne Smith和Dr.Wayne Thomas(TVW Telethon Institutefor Child Health Research，100 Roberts Rd，Subiaco，WesternAustralia 6008)。在第一鏈cDNA文庫的擴增中，Der p 2被選擇性地用Der p 2特異性引物進行擴增。隨后將PCR片段克隆入pUC19的BamH I位點(New England BioLabs)。Der p 2的DNA測序用載體特異性有義(5’-GGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG-3’)和反義引物(5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3’)進行。
確定了總共7種獨特的Der p 2同種型，稱為ALK-101、ALK-102、ALK-103、ALK-104、ALK-113、ALK-114、ALK-120。將標號為ALK-114的克隆選作起始點以生成低親和力的IgE突變體，這是由于其與具有數據庫訪問號1A9V的Der p 2 NMR結構的高度序列一致性。與ALK-114相比，6個其他天然存在的同種型包含如下替換ALK-101M76V。
ALK-102V40L、T47S。
ALK-103M111L、D114N。
ALK-104T47S、M111T、D114N。
ALK-113T47S。
ALK-120V40L、T47S、D114N。
將Der p 2插入pGAPZα-A將編碼Der p 2(ALK-114)的基因隨后插入pGAPZα-A載體中(Invitrogen)以得到Der p 2在畢赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)中的分泌表達。將該基因是用分別相應于Der p 2多肽的氨基-和羧基端的有義引物OB27(5’-GGAATTCCTCGAGAAAAGAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGCC-3’)和反義引物OB28(5’-CGTTCTAGACTATTAATCGCGGATTTTAGCATGAGTTGC-3’)進行擴增。將引物在5’-端延長以分別包含限制酶切位點Xho I和Xba I。Xho I限制酶切位點使Der p 2的第一個密碼子以符合閱讀框形式與編碼pGAPZα-A的KEX2切割位點(LYS-ARG)的核酸序列融合。單輪的PCR反應在100微升(μl)體積進行的0.1mg的模板ALK-114 DNA，1X Expand聚合酶緩沖液(得自BoehringerMannheim)，各0.2毫摩爾(mM)的4種dNTPs，各0.3微摩爾(μM)的有義和反義引物和2.5單位的Expand聚合酶(得自Boehringer Mannheim)。DNA在25個循環中擴增95℃15秒，45℃30秒，72℃1分鐘，隨后1個72℃循環7分鐘。將結果所得的475堿基對的ALK-114 PCR片段用QIAquick旋轉純化程序(得自Qiagen)進行純化。然后將純化的DNA片段用Xho I和Xba I消化，凝膠純化并連接入以相似方式消化的pGAPZα-A中。將連接反應轉化入大腸桿菌菌株DH5α，結果得到質粒pCBo06。
Der p 2的核苷酸序列通過在克隆前后及隨后的體外誘變中的DNA測序來證實(見下文)。
Der p 2序列
SEQ ID NO 1相應于Der p 2的核酸序列(ALK-114)1 gatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccagga61tgccatggttcagaaccatgtatcattcatcgtggtaaaccattccaattggaagccgtt121 ttcgaagccaaccaaaacacaaaaaccgctaaaattgaaatcaaagcctcaatcgatggt181 ttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattacatgaaatgcccattg241 gttaaaggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccgaaaattgcaccaaaa301 tctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttatgggtgatgatggtgttttggcctgtgct361 attgctactcatgctaaaatccgcgattaaSEQ ID NO 2相應于推定的Der p 2氨基酸序列(ALK-114)1 dqvdvkdcanheikkvlvpgchgsepciihrgkpfqleavfeanqntktakieikasidg61levdvpgidpnachymkcplvkgqqydikytwnvpkiapksenvvvtvkvmgddgvlaca121 iathakird將pGAPZα-A-Der p 2插入到畢赤巴斯德酵母中將載體pCBo06用AvrII限制性內切酶線性化并轉化到感受態畢赤巴斯德酵母菌株X-33中，如在Invitrogen使用手冊中所述。選擇對100微克每毫升(μg/ml)的Zeocin具抗性的重組細胞，將菌落在含有100μg/ml Zeocin的新鮮YPD平板上純化。
重組Der p 2的表達和純化將250ml含有100μg/ml Zeocin的YPD培養基(1％的酵母提取物、2％的蛋白胨、2％的葡萄糖)用表達Der p 2的重組酵母細胞過夜培養物進行接種。使培養物在30℃生長72小時以獲得適當的Der p 2表達。細胞通過離心收集，將結果所得的培養物上清夜用50％的硫酸銨飽和。在用3000xg離心30分鐘之后，將上清夜用80％的硫酸銨飽和。離心后，將沉淀重懸于150毫摩爾(mM)的NH4HCO3中并在用相同的緩沖液平衡的Superdex 75凝膠過濾柱上分級分離。
Der p 2作為相應于其預期分子量的主要峰洗脫。Der p 2的洗脫通過隨后進行銀染的SDSPAGE電泳和用Der p 2特異性多克隆抗體的免疫印跡進行監控。
用于定點突變的氨基酸殘基的選擇用于定點突變的氨基酸殘基的選擇基于對來自屋塵螨(Der p 2/f2和Eur m 2)和貯存螨(storage mite)(Tyr p 2、Lep d 2、Gly d2)的變態反應原中高度溶劑暴露和高度保守性的殘基的確定。高度溶劑暴露的殘基通過Der p 2 NMR結構(#1.9，1A9V.pdb)的分子表面的分析直觀確定。選擇了12個氨基酸殘基用于誘變K6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q。
定點突變具有單個初級突變和其多重組合的重組突變變態反應原的構建描述如下。
編碼Der p 2突變體的表達質粒是用pCBo06作為DNA模板而生產的。PCR反應用插入了特定突變的有義和反義引物進行。用于PCR反應以生成特定突變的引物對列在圖31中。突變以粗體標明，且用于隨后的克隆步驟的限制酶切位點在圖中加下劃線。對于突變體K6A、K15E、H30N、H74N和K82N的構建，PCR反應基本是如在“將Der p 2克隆入pGAPZα-A”部分中所描述的那樣進行的。將純化的PCR片段在標明的限制性酶切位點(參見圖31)消化、凝膠純化、連接入用相似消化的pCBo06并轉化入大腸桿菌DH5α。
突變E62S是以在實施例1中對Bet v 1突變體的生成所描述的另一種PCR誘變方法學生成。合成了兩個覆蓋特定的突變的突變特異性寡核苷酸引物(OB47和OB48，在圖31中列出)。兩個用于二次擴增步驟的額外引物為OB27和OB28如在“將Der p 2插入pGAPZα-A”部分中所描述。
生產的變態反應原突變體用如在實施例4中所描述的相同方法來描述特性，如圓二色(CD)譜、結晶、IgE結合性質的測量、組胺釋放、T細胞增殖刺激能力等。
實施例6具有對特異性變態反應疫苗改善的安全性的突變的重組螨變態反應原(Der p 2)在本實施例中，當前發明對屋塵螨變態反應原概念的應用由一個變態反應原Der p 2作為例子。對其他屋塵螨變態反應原的處理可通過相當的程序進行。
突變的重組Der p 2分子的設計SED ID NO.3表示Der p 2-ALK-G克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，該克隆是野生型的同種型。
SED ID NO.3Der p 2-ALK-G的核苷酸和推定的氨基酸序列。
GAT CAA GTC GAT GTC AAA GAT TGT GCC AAT CAT GAA ATC AAA AAA 45D Q V D V K D C A N H E I K K 15GTT TTG GTA CCA GGA TGC CAT GGT TCA GAA CCA TGT ATC ATT CAT 90V L V P G C H G S E P C I I H 30CGT GGT AAA CCA TTC CAA TTG GAA GCT TTA TTC GAA GCC AAT CAA135R G K P F Q L E A L F E A N Q 45AAC TCA AAA ACA GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCT TCA ATC GAT GGT180N S K T A K I E I K A S I D G 60TTA GAA GTT GAT GTT CCC GGT ATC GAT CCA AAT GCA TGC CAT TAT225L E V D V P G I D P N A C H Y 75
ATG AAA TGT CCA TTG GTT AAA GGA CAA CAA TAT GAT ATT AAA TAT270M K C P L V K G Q Q Y D I K Y 90ACA TGG AAT GTT CCA AAA ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAT GTT GTC315T W N V P K I A P K S E N V V 105GTC ACT GTT AAA GTT TTG GGT GAT AAT GGT GTT TTG GCC TGT GCT360V T V K V L G D N G V L A C A 120ATT GCT ACT CAT GCT AAA ATC CGC GAT387I A T H A K I R D 129圖32表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http//www.expasy.ch/)上進行的序列比對，其中用表示于SED ID NO.3中的Der p 2-ALK-G的氨基酸序列作為輸入序列。該比對包括來自屋塵螨物種的序列，即Der p 2、Der f 2和Eurm 2。在圖32中，與Der p 2-ALK-G蛋白質序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸殘基在灰色背景上用黑體突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面結構圖象代表屋塵螨類群2變態反應原的氨基酸序列具有超過85％的相似性，且一些分子表面保守(灰色帶)，參見圖33。圖33表示當將Der p 2-ALK-G蛋白質序列添加到發表的PDB1A9v NMR結構上時，即10個包含在PDB文件中編號為1的結構，從4個不同的角度觀察的表面外形。
將保守的和高度溶劑暴露的氨基酸選來用于突變，這些氨基酸在空間上在25-30范圍的距離內分布在整個表面。在下面的部分中，給出了下述信息認為適合用于突變的氨基酸列表(A)、設計的突變的列表(B)和代表設計的突變的DNA序列(C)。圖34表示作為例子的以1號突變體的分子外形。灰色顯示保守的氨基酸殘基。黑色顯示選來用于突變的氨基酸殘基。
A.選來用于突變的氨基酸列表K15、S24、H30、R31、K48、E62、H74、K77、K82、K100、R128
B.設計的突變的列表突變體1K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N突變體2K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，R128Q突變體3K15E，S24N，H30G，K48A，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體4K15E，S24N，H30G，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體5K15E，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體6S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體7K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N突變體8K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，R128Q突變體9K15E，S24N，R31S，K48A，H74N，K82N，K100N，R128Q突變體10K15E，S24N，R31S，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q突變體11K15E，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q突變體12S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q
C.突變體的核苷酸序列突變體1K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100NGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat突變體2K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcCattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體3K15E，S24N，H30G，K48A，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突變體4K15E，S24N，H30G，E62S，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaaaaacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體5K15E，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggttcagaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體6S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突變體7K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100NGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat突變體8K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體9K15E，S24N，R31S，K48A，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctaCtcatgCtaaaatcCAGgat
突變體10K15E，S24N，R31S，E62S，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtCtgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體11K15E，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggttcagaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體12S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttCCaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
實施例7具有對特異性變態反應疫苗改善的安全性的突變的重組螨變態反應原(Der p 1)在本實施例中，當前發明對屋塵螨變態反應原概念的應用由一個變態反應原Der p 1作為例子。對其他屋塵螨變態反應原的處理可通過相當的程序進行。
突變的重組Der p 1分子的設計SED ID NO.4表示Der p 1-ALK克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，該克隆是野生型的同種型。
SED ID NO.4Der p 1-ALK的核苷酸和推定的氨基酸序列。
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT 45T N A C S I N G N A P A E I D15TTG CGA CAA ATG CGA ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC 90L R Q M R T V T P I R M Q G G30TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT GCC GCA ACT GAA TCA135C G S C W A F S G V A A T E S45GCT TAT TTG GCT TAC CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA180A Y L A Y R N Q S L D L A E Q60GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC225E L V D C A S Q H G C H G D T75ATT CCA CGT GGT ATT GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA270I P R G T E Y I Q H N G V V Q90GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CGA GAA CAA TCA TGC CGA CGA315E S Y Y R Y V A R E Q S C R R 105CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC360R N A Q R F G I S N Y C Q I Y 120CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC405P P N V N K I R E A L A Q T H 135AGC GCT ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC450S A I A V I I G I K D L D A F 150CGT CAT TAT GAT GGC CGA ACA ATC ATT CAA CGC GAT AAT GGT TAC495R H Y D G R T I I Q R D N G Y 165CAA CCA AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA540Q P N Y H A V N I V G Y S N A 180CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT585Q G V D Y W I V R N S W D T N195
TGG GGT GAT AAT GGT TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG630W G D N G Y G Y F A A N I D L 210ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC ATT CTC666M M I E E Y P Y V V I L 222圖35表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http//www.expasy.ch/)上進行的序列比對，其中用表示于SED ID NO.4中的Der p 1-ALK的氨基酸序列作為輸入序列。該比對包括來自屋塵螨物種的序列，即Der p 1、Der f 1和Eurm 1。在圖35中，與Der p 1-ALK蛋白質序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸殘基在灰色背景上用黑體突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面結構圖象代表屋塵螨類群1變態反應原的氨基酸序列具有某些程度的相似性，且一些分子表面是保守的(灰色帶)，參見圖36。圖36表示當將Der p 1-ALK蛋白質序列迭加到Der p 1分子結構模型上時從4個不同的角度觀察的表面外形。
將保守的和高度溶劑暴露的氨基酸選來用于突變，這些氨基酸在空間上在25-30范圍的距離內分布在整個表面。在下面的部分中，給出了下述信息認為適合用于突變的氨基酸列表(A)、設計的突變的列表(B)和代表設計的突變的DNA序列(C)。圖37以編號為11的突變體作為例子表示分子外形。灰色顯示保守的氨基酸殘基。黑色顯示選來用于突變的氨基酸殘基。
A.選擇來用于突變的氨基酸列表E13、P24、R20、Y50、S67、R78、R99、Q109、R128、R156、R161、P167、W192B.設計的突變的列表突變體1P24T、Y50V、R78E、R99Q、R156Q、R161E、P167T
突變體2P24T、Y50V、R78Q、R99E、R156E、R161Q、P167T突變體3R20E、Y50V、R78Q、R99Q、R156E、R161E、P167T突變體4R20Q、Y50V、R78E、R99E、R156Q、R161Q、P167T突變體5P24T、Y50V、S67N、R99E、R156Q、R161Q、P167T突變體6R20E、Y50V、S67N、R99E、R156Q、R161E、P167T突變體7R20Q、Y50V、S67N、R99Q、R156E、R161E、P167T突變體8E13S、P24T、Y50V、R78E、R99Q、Q109D、R128E、R156Q、R161E、P167T突變體9E13S、P24T、Y50V、R78Q、R99E、Q109D、R128Q、R156E、R161Q、P167T突變體10E13S、P24T、Y50V、R78E、R99Q、Q109D、R128E、R156Q、R161E、P167T、W192F突變體11E13S、P24T、Y50V、R78Q、R99E、Q109D、R128Q、R156E、R161Q、P167T、W192FC.突變體的核苷酸序列突變體1P24T，Y50V，R78E，R99Q，R156Q，R161E，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT 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R20E，Y50V，S67N，R99E，R156Q，R161E，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG GAA 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT AAC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 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666突變體8E13S，P24T，Y50V，R78E，R99Q，Q109D，R128E，R156Q，R161E，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT GAA GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體9E13S，P24T，Y50V，R78Q，R99E，Q109D，R128Q，R156E，R161Q，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCAT GC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CAG GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體10E13S，P24T，Y50V，R78E，R99Q，Q109D，R128E，R156Q，R161E，P167T，W192FACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT GAA GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TTT GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體11E13S，P24T，Y50V，R78Q， R99E，Q109D，R128Q，R156E，R161Q，P167T，W192FACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CAG GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TTT GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666實施例8具有對特異性變態反應疫苗改善的安全性的突變的重組草變態反應原(Phl p 5)在本實施例中，當前發明對草花粉變態反應原概念的應用由一個變態反應原Phl p 5作為例子。對其他草花粉變態反應原的處理可通過相當的程序進行。
突變的重組Phl p 5分子的設計SED ID NO.5表示Phl p 5.0103克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，該克隆是野生型的同種型。
SED ID NO.5Phl p 5.0103的核苷酸和推定的氨基酸序列。
gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60A D L G Y G P A T P A A P A A G Y T P A 20acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120T P A A P A G A E P A G K A T T E E Q K 40ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180L I E K I N A G F K A A L A A A A G V P 60ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240P A D K Y R T F V A T F G A A S N K A F 80gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300A E G L S G E P K G A A E S S S K A A L100acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360T S K L D A A Y K L A Y K T A E G A T P120gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcatcatcgccggc 420E A K Y D A Y V A T V S E A L R I I A G140accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480T L E V H A V K P A A E E V K V I P A G160gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540E L Q V I E K V D A A F K V A A T A A N180gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600A A P A N D K F T V F E A A F N D A I K200gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660A S T G G A Y E S Y K F I P A L E A A V220aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720K Q A Y A A T V A T A P E V K Y T V F E240accgcactgaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcacagaaggctgccaagcccgcc 780T A L K K A I T A M S E A Q K A A K P A260gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840A A A T A T A T A A V G A A T G A A T A280gctactggtggctacaaagtc 861A T G G Y K V
圖32表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http∥www.expasy.ch/)上進行的序列比對，其中用表示于SED ID NO.5中的Phl p 5.0103的氨基酸序列作為輸入序列。該比對包括來自草物種類群5變態反應原的序列，即Phl p 5、Poa p 5、Lol p 5、Hol l 5、Pha a 5、Hor v 9和Hor v 5。在圖38中，與Phl p 5.0103蛋白質序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸殘基在灰色背景上用黑體突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面結構圖象代表草花粉類群5變態反應原的氨基酸序列具有某些程度的相似性，且一些分子表面保守(灰色帶)，參見圖39。圖39表示當將Phl p 5.0103蛋白質序列迭加到Phl p 5分子結構模型上時，從4個不同的角度觀察的表面外形。該結構模型以兩個半部包含該分子，模型A(氨基酸34-142)在圖39A中表示，且模型B(氨基酸149-259)在圖39B中表示將高度溶劑暴露的氨基酸選來用于突變，這些氨基酸在空間上25-30范圍的距離內分布在整個表面。在下面的部分中，給出了下述信息認為適合用于突變的氨基酸列表(A)、設計的突變的列表(B)和代表設計的突變的DNA序列(C)。圖40A和B分別表示作為例子的1號突變體模型A和模型B分子外形。灰色顯示保守的氨基酸殘基。黑色顯示選來用于突變的氨基酸殘基。
A.選來用于突變的氨基酸列表I45、R66、E133、R136、I137、D186、F188、K211、P214、Q222、P232、L243、Q254B.設計的突變的列表突變體1I45K，E133S，F188I，Q222K，L243E，Q254K突變體2R66N，E133S，F188I，Q222K，L243E，Q254K突變體3I45K，R136S，F188I，Q222K，L243E，Q254K突變體4I45K，I137K，F188I，Q222K，L243E，Q254K突變體5I45K，E133S，D186H，Q222K，L243E，Q254K突變體6I45K，E133S，Q222K，P232G，L243E，Q254K突變體7I45K，E133S，F188I，P214G，L243E，Q254K突變體8I45K，E133S，F188I，K211N，L243E，Q254K突變體9R66N，R136S，F188I，Q222K，L243E，Q254K突變體10
R66N，I137K，F188I，Q222K， L243E，Q254K突變體11I45K，E133S，D186H，P214G，L243E，Q254K突變體12I45K，E133S，D186H，K211N，L243E，Q254K突變體13I45K，E133S，P214G，P232G，L243E，Q254K突變體14I45K，E133S，K211N，P232G，L243E， Q254KC.突變體的核苷酸序列突變體1I45K，E133S，F188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 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I45K，E133S，F188I，K211N，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體9R66N，R136S，F188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctct cgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體10R66N，I137K，F188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcAAAatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgcccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體11I45K，E133S，D186H，P214G，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體12I45K，E133S，D186H，K211N，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體13I45K，E133S，P214G，P232G，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgGGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840突變體14I45K，E133S，K211N，P232G，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgGGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861實施例9重組體和突變體Bet v 1的T-細胞反應性目的在增殖和細胞因子生產方面研究對突變的變態反應原的體外T細胞反應。
方法來自變態反應患者的PBL(外周血淋巴細胞)被用于下面的研究。
為了維持T-細胞所呈對的bet v 1同種型的多樣性，用具有天然純化的bet v 1的PBL建立了8個bet v 1特異性T細胞系，如以前發表的流程所述(26)。
將10個PBL和8個T-細胞系用樺木提取物(Bet v)、天然純化的bet v 1(nbet v 1)、重組Bet v 1(rBet v 1或wt；27)和rBetv 1的4種不同的突變體(在別處所述)2595、2628、2637、2744、2773來刺激。隨后發現2637突變體部分解折疊，將不予討論。
簡單扼要地在一個具有96圓底孔的平板上每孔加入2×105的PBL。以4份重復(quadropplicates)的3種不同的濃度加入不同的樺木樣品并使其生長6天。在第6天，將具有最高濃度的樺木的每孔半數體積(100μl)的細胞收獲以用于細胞因子的生產。將放射性標記的胸苷加入到孔中。第二天(第7天)在濾器中收獲細胞。將閃爍液加入到濾器中，其放射性用閃爍計數器進行測量。
同樣地，在一個具有96圓底孔的平板上每孔加入3×104的T-細胞，并用自身輻射的PBL(1×105細胞/孔)和3種不同濃度的不同樺木樣品來刺激。1天后，將來自各孔具有最高濃度的樺木的細胞收獲以用于細胞因子的生產。將放射性標記的胸苷加入到孔中。在第2天在濾器中收獲細胞。將閃爍液加入到濾器中并以如在PBL中描述的方法計數。
收集來自4等份(quadropplicates)的上清夜，并用來自Becton Dickinson的CBA(細胞因子珠陣列(cytokine beadarray))試劑盒來測量細胞因子。
結果10個PBL培養物顯示對樺木的特異性刺激。通常，對不同樺木樣品的PBL增殖相似，盡管可看到變化。在3個PBL中，nBet v 1比rBet v 1和突變體更好刺激增殖。突變體樺木樣品幾乎與rBet v 1一樣刺激了PBL(圖41)。圖41表示上述Bet v 1制備物的刺激指數。刺激指數(SI)是刺激的樣品的增殖(cpm每分鐘的讀數)除以培養基(medium)對照的增殖(cpm)來計算的。PPD指來自結核分枝桿菌(mucobacterium tuberculosis)的純化的蛋白質衍生物，它充當正對照。
細胞因子的生產是由IFN-gamma控制的且隨PBL增殖按比例增加。Th1/Th2替換的信號不明顯(圖42-44)。圖42表示具有Th0狀況的患者，圖43表示Th1狀況且圖44表示Th2狀況。細胞因子生產用顯示為條形圖的pg/ml測量的且IL-5/IFN-gamma之間的比率是較下面的虛線(Y-軸右邊)。用cpm測量的增殖在Y-軸右邊表示為實線。培養基(medium)和MBP(麥芽糖結合蛋白質)作為背景對照而包括。
8個T-細胞系建立在nBet v 1上，且除一個之外，其余的全部對所有樺木樣品同樣好地增殖。4個T-細胞系基于IL-5和IFN-gamma的比率(Th2＞5、5＞Th0＞0.2、0.2＞Th1)而分泌Th0樣的細胞因子。3個T-細胞系分泌Th1的細胞因子且1個T-細胞系分泌Th2細胞因子。IL-5/IFN-gamma的比率不受不同樺木樣品的影響。
結論對nBet v 1顯示特異性刺激的所有PBL培養物和7/8個T-細胞系也對rBet v 1和突變體起反應。這些數據暗示對于T-細胞的刺激，Bet v 1的同種型或這4個突變體可替換在天然變態反應原制備物中發現的單獨的同種型的混合物。因而，基于重組變態反應原或這4個突變體的疫苗將針對現存的Bet v 1特異性T-細胞群體。
實施例10用重組和突變體Bet v 1蛋白質在免疫接種后誘導Bet v 1特異性IgG抗體和阻斷抗體在本部分中，術語“阻斷抗體”定義為與IgE抗體不同的抗體，它能夠結合到抗原并阻止人IgE抗體對該抗原的結合。
重組Bet v 1 2227野生型蛋白質(rBet v 1)和Bet v 1 2595、2628、2744及2773突變體蛋白質誘導Bet v 1特異性IgG抗體和阻斷抗體的能力在小鼠中的免疫接種實驗中檢驗。
通過用重組Bet v 1 2227野生型蛋白質或4個突變體蛋白質對BALB/cA小鼠(每組8個)腹膜內注射進行免疫接種。該小鼠以14天的劑量間隔免疫接種4次。將不同的蛋白質綴合到1.25mg/ml的鋁膠上(氫氧化鋁凝膠，1.3％pH8.0-8.4，Superfos Biosector)。該小鼠用或者1μg的蛋白質/劑量或者10μg的蛋白質/劑量來免疫接種。血液樣品在第0、14、35、21、49和63天從眶放血(orbital bleed)獲取。
特異性IgG抗體水平用rBet v 1包被的微量滴定板和生物素化的兔抗小鼠IgG抗體(Jackson)作為探測抗體通過直接的ELISA來分析。用重組Bet v 1 2227野生型蛋白質或4種突變體蛋白質的免疫接種誘導了強的rBet v 1特異性IgG反應。該發現證明4種突變的蛋白質能夠誘導與Bet v 1 2227野生型蛋白質具有高度交叉反應性的抗體。
為了估計阻斷抗體的誘導，將來自樺木變態反應患者的血清樣品與包被了單克隆小鼠抗人IgE抗體的順磁珠溫育。溫育后，將珠子洗滌并重懸于緩沖液或來自未免疫接種的小鼠(對照)或上述免疫接種的小鼠的小鼠血清的稀釋樣品(1∶100)中。然后將生物素化的rBet v 1加入到該珠和小鼠血清抗體的混合物中。溫育之后，將珠子洗滌，其結合的生物素化的rBet v 1用丫啶(acridinium)標記的鏈酶抗生物素來探測。珠子和來自未免疫接種的小鼠的血清的溫育沒有改變rBet v 1與珠子的結合。相反的，珠子與來自用重組Bet v 1 227野生型蛋白質或4種突變體蛋白質免疫接種的小鼠血清的溫育顯著地減少了Bet v 1與珠子的結合，這證明了在血清樣品中存在Bet v 1特異性阻斷抗體。因而，在第63天，來自所有高劑量(10μg/劑量)免疫接種組的一種或多種血清樣品能夠減少超過80％的Bet v 1與珠子的結合。這些發現證明4種突變的蛋白質能夠誘導可充當Bet v 1特異性阻斷抗體的抗體。
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權利要求
1.重組變態反應原，其特征在于它是天然存在的變態反應原的突變體，其中該變態反應原突變體具有至少4個初級突變，與該天然存在的變態反應原的IgE結合能力相比，這里的每一個突變都減少了變態反應原突變體的特異的IgE結合能力；其中每一個初級突變都是用其他的殘基替換一個表面暴露的氨基酸殘基，在該天然存在的變態反應原所源自的分類學物種中用作替換的殘基不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上；其中每一個初級突變都與任一其他的初級突變間隔至少15；且其中初級突變這樣放置，以使得至少一個具有8002面積的圓形表面區域不包含突變。
2.根據權利要求1的重組變態反應原，其中初級突變以20間隔，優選25且最優選30。
3.根據權利要求1或2的重組變態反應原，其包含許多二級突變，與該天然存在的變態反應原的IgE結合能力相比，這其中的每一個二級突變都減少了變態反應原突變體的特異的IgE結合能力；其中每一個二級突變都是用其他的殘基替換一個表面暴露的氨基酸殘基，在該天然存在的變態反應原所源自的分類學物種中該用作替換的殘基不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上；其中的二級突變位于所述圓形表面區域之外。
4.根據權利要求1-3中任何一項的重組變態反應原，其中至少一個在天然存在的變態反應原中要被替換的表面暴露的氨基酸具有超過20％的溶劑可接近性，優選超過30％，更優選超過40％且最優選超過50％。
5.根據權利要求1-4中任何一項的重組變態反應原，其中至少一個在天然存在的變態反應原中要被替換的表面暴露的氨基酸在該天然存在的變態反應原所源自的物種中所有已知的同源蛋白質中具有保守性超過70％，優選80％且最優選為90％。
6.根據權利要求1-5中任何一項的重組變態反應原，它基本上具有與該天然存在的變態反應原相同的α-碳主鏈三級結構。
7.根據權利要求1-6中任何一項的重組變態反應原，其中每一個要插入變態反應原突變體的氨基酸殘基在該天然存在的變態反應原所源自的分類學屬，優選亞科，更優選科，更優選總科，更優選軍團(legion)，更優選亞目且最優選目中都不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上。
8.根據權利要求1-7中任何一項的重組變態反應原，其特征在于對突變的變態反應原的特異的IgE結合減少至少5％，優選至少10％。
9.根據權利要求6的重組變態反應原，其特征在于當比較突變體和天然存在的變態反應原分子的α-碳主鏈三級結構時，原子坐標的平均根均方偏差優選低于2。
10.根據權利要求1-9中任何一項的重組變態反應原，其特征在于所述圓形表面區域包含15～25個氨基酸殘基的原子。
11.根據權利要求1-10中任何一項的重組變態反應原，其特征在于將表面暴露的氨基酸殘基以溶劑可接近性分級，并將處于較高的溶劑可接近性的一個或多個氨基酸替換。
12.根據權利要求1-11中任何一項的重組變態反應原，其特征在于將表面暴露的氨基酸殘基以在該天然存在的變態反應原所源自的物種中的所有已知同源蛋白質中的保守程度分級，將處于較高保守性的氨基酸中的一個或多個替換。
13.根據權利要求1-12中任何一項的重組變態反應原，其中的變態反應原突變體是非天然存在的變態反應原。
14.根據權利要求1-13中任何一項的重組變態反應原，其包含5～20個，優選6～15個，更優選7～12個，且最優選8～10個初級突變。
15.根據權利要求1-14中任何一項的重組變態反應原，其特征在于該變態反應原突變體包含1～4個二級突變對應每個初級突變。
16.根據權利要求1-15中任何一項的重組變態反應原，其特征在于一個或多個替換由定點突變實現。
17.根據權利要求1-16中任何一項的重組變態反應原，其特征在于一個或多個替換由DNA改組實現。
18.根據權利要求1-17中任何一項的重組變態反應原，其特征在于它是吸入型變態反應原的突變體。
19.根據權利要求18的重組變態反應原，其特征在于它是花粉變態反應原的突變體。
20.根據權利要求19的重組變態反應原，其特征在于它是源自分類目Fagales、Oleales和Pinales的花粉變態反應原的突變體。
21.根據權利要求20的重組變態反應原，其特征在于它是Bet v 1的突變體。
22.根據權利要求21的重組變態反應原，其特征在于一種或多種替換選自V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。
23.根據權利要求19的重組變態反應原，其特征在于它是源自分類目Poales的花粉變態反應原的突變體。
24.根據權利要求19的重組變態反應原，其特征在于它是源自分類目Asterales和Urticales的花粉變態反應原的突變體。
25.根據權利要求18的重組變態反應原，其特征在于它是屋塵螨變態反應原的突變體。
26.根據權利要求25的重組變態反應原，其特征在于它是源自嗜皮螨屬(Dermatophagoides)的螨變態反應原的突變體。
27.根據權利要求18的重組變態反應原，其特征在于它是蟑螂變態反應原的突變體。
28.根據權利要求18的重組變態反應原，其特征在于它是動物變態反應原的突變體。
29.根據權利要求28的重組變態反應原，其特征在于它是源自貓、狗或馬的動物變態反應原的突變體。
30.根據權利要求1-17中任何一項的重組變態反應原，其特征在于它是毒液變態反應原的突變體。
31.根據權利要求30的重組變態反應原，其特征在于它是源自分類學膜翅目(Hymenoptera)的毒液變態反應原的突變體。
32.根據權利要求31的重組變態反應原，其特征在于它是來自分類學目胡蜂(Vespidae)、蜜蜂(Apidae)和蟻(Formicoidae)的毒液變態反應原的突變體。
33.根據權利要求30-32中任何一項的重組變態反應原，其特征在于它是Ves v 5的突變體。
34.根據權利要求33的重組變態反應原，其特征在于一或多個替換選自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
35.根據權利要求1-34中任何一項用作藥物的重組變態反應原。
36.根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原的用途，用于制備預防和/或治療變態反應的藥物。
37.包含兩種或更多根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原突變體的組合物，其中每一個變體都以具有至少一個初級突變而定義，該突變在至少一個其他的變體中不存在；其中對于每一個變體，在每一個不存在的初級突變的15的半徑之內不存在二級突變。
38.根據權利要求37的組合物，包含2～12個，優選3～10個，更優選4～8個且最優選5～7個變體。
39.根據權利要求37或38的用作藥物的組合物。
40.根據權利要求37或38的組合物的用途，用以制備預防和/或治療變態反應的藥物。
41.藥物組合物，其特征在于它包含根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原或根據權利要求37或38的組合物，可選結合藥物學上可接受的載體和/或賦形劑，以及可選結合佐劑。
42.根據權利要求41的藥物組合物，其特征在于它為抗變態反應疫苗的形式，該變態反應由天然存在的變態反應原在遭受變態反應的患者中引起。
43.在被試者中產生免疫反應的方法，包含向被試者施用根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原、根據權利要求37或38的組合物或根據權利要求41或42的藥物組合物。
44.對被試者進行的疫苗接種或治療，包含向被試者施用根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原、根據權利要求37或38的組合物或根據權利要求41或42的藥物組合物。
45.制備根據權利要求41或42的藥物組合物的方法，其包含將根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原或根據權利要求37或38的組合物與藥物學上可接受的物質和/或賦形劑混合。
46.由根據權利要求45的方法可獲得的藥物組合物。
47.在被試者中治療、預防或減輕變態反應的方法，包含向被試者施用根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原、根據權利要求37或38的組合物或根據權利要求41或42中任何一項的藥物組合物。
48.制備根據權利要求1-34中任何一項重組變態反應原的方法，其特征在于a)確定天然存在的變態反應原中的一些氨基酸殘基，其具有至少20％的溶劑可接近性；b)以這樣的方式選擇至少4個確定的氨基酸殘基，以使得每個所選氨基酸與其他所選氨基酸相互間隔至少15，且所選氨基酸以這種方式分布，以使得至少一個具有8002面積的圓形表面區域不包含所選氨基酸；和c)對每個所選氨基酸進行初級突變，使變態反應原突變體的特異的IgE結合能力與天然存在的變態反應原的IgE結合能力相比減少，其中每個初級突變都是用其他的氨基酸替換所選氨基酸殘基，前者在該天然存在的變態反應原所源自的分類學物種中不發生于任何已知同源蛋白質氨基酸序列的相同位置上。
49.根據權利要求48的方法，其特征在于以溶劑可接近性對所述確定的氨基酸殘基進行分級，且將具有較大溶劑可接近性的一或多個氨基酸替換。
50.根據權利要求48或49的方法，其特征在于選擇確定的氨基酸殘基，它們在該天然存在的變態反應原所源自的物種中的所有已知同源蛋白質中以超過70％的一致性保守。
51.根據權利要求50的方法，其特征在于以在該天然存在的變態反應原所源自的物種中的所有已知同源蛋白質中的保守程度來對其中確定的氨基酸殘基進行分級，且將具有較大保守性的一或多個氨基酸替換。
52.根據權利要求48-51中任何一項的方法，包含選擇確定的氨基酸以形成變態反應原突變體，后者具有與天然存在的變態反應原基本上相同的α-碳主鏈三級結構。
53.根據權利要求48-52中任何一項的方法，其特征在于對氨基酸殘基的替換通過定點突變實現。
54.制備根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原的方法，其特征在于該變態反應原從由編碼相應的天然存在的變態反應原的DNA的進行DNA改組(DNA shuffling)(分子培育)所獲得的DNA序列生產。
55.編碼根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原的DNA序列、其衍生物、其部分序列、其簡并的序列或在嚴緊條件下與其雜交的序列，其中該衍生物、部分序列、簡并序列或雜交序列編碼具有至少一個B細胞抗原決定部位的肽。
56.根據權利要求55的DNA序列，它是編碼天然存在的變態反應原的DNA序列的衍生物。
57.根據權利要求56的DNA序列，其中的衍生物通過對編碼天然存在的變態反應原的DNA的定點突變而獲得。
58.根據權利要求55-57中任何一項的DNA序列，其中該序列是圖3所示序列的衍生物，其中該DNA序列經突變而編碼具有至少4個突變的變態反應原，這些突變選自V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。
59.根據權利要求55-57中任何一項的DNA序列，其中的序列是圖13所示序列的衍生物，其中該DNA序列經突變而編碼具有至少4個突變的變態反應原，這些突變選自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
60.根據權利要求55-57中任何一個的DNA序列，其中的序列是圖16所示序列的衍生物，其中的DNA序列經突變而編碼具有至少4個突變的變態反應原，這些突變選自R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和K-15。
61.包含根據權利要求55-60中任何一項的DNA的表達載體。
62.包含權利要求61的表達載體的宿主細胞。
63.生產重組變態反應原突變體的方法，該方法包含培養根據權利要求62的宿主細胞的步驟。
64.根據權利要求1-34中任何一項或由根據權利要求55-60中任何一項的DNA序列編碼的重組變態反應原，其包含至少一種T細胞抗原決定部位，該抗原決定部位能夠刺激特異于該天然存在的變態反應原的T細胞克隆或T細胞系。
65.用根據權利要求1-34中任何一項的重組變態反應原突變體或根據權利要求37或38的組合物來估計對被試者治療的適當性、安全性或結果的診斷測定，其中將被試者的含IgE的樣品與該突變體或該組合物混合并估計該樣品中的IgE和該突變體的反應性水平。
全文摘要
本發明公開了具有多重突變及減小的IgE結合親和力的新型重組變態反應原。該變態反應原是天然變態反應原的非天然存在的突變體。總的α－碳主鏈的三級結構基本保守。本文也公開了制備這種重組變態反應原的方法及其用途。
文檔編號C12N1/19GK1484699SQ01820783
公開日2004年3月24日 申請日期2001年11月16日 優先權日2000年11月16日
發明者J·霍爾姆, J 霍爾姆, H·伊普森, 丈, J·尼得加德拉爾森, 眉擁呂 , M·D·斯潘格福特, 斯潘格福特 申請人:阿爾克-阿貝洛有限公司